秀麗線蟲的研究和飼養(yǎng)

1、編輯ppt1秀麗隱桿線蟲的飼養(yǎng)及研究用途 By 王傳杰編輯ppt2介紹 秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）,屬于線形動物門、線蟲綱。體形非常小,成蟲只有1mm左右。 線 蟲 是 細 胞 定 數(shù) 動 物 ， 兩性 成蟲 只有 9 5 9 個 體 細 胞 ， 雄 性 成 蟲 只 有 1 0 3 1 個 體細 胞 ， 其 中 1 3 1個 細 胞 注 定 要 接 一 定 的發(fā) 育 程 序 陸續(xù) 死 亡 。 神 經 系統(tǒng)解 剖結 構 十 分 簡 單 ， 僅有 3 0 2個細 胞 ， 約 占整 個 動 物 體 細 胞 總 數(shù) 的 三 分 之 一 。它身體透明,能感知氣味和味道,

2、對光線、溫度有反應。研究者很容易在顯微鏡下對其細胞和組織進行跟蹤觀察編輯ppt3 飼養(yǎng)與凍存設備試劑： 大腸桿菌大腸桿菌OP50 大腸桿菌大腸桿菌OP50是尿嘧啶滲漏突變型是尿嘧啶滲漏突變型,作為作為秀麗隱桿線蟲的食物。秀麗隱桿線蟲的食物。 NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)基1000ml的的NGM培養(yǎng)基內加有培養(yǎng)基內加有:3gNaCl,2.5g蛋蛋白胨白胨,17g瓊脂瓊脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液緩沖液(pH=6.0)25ml,975ml蒸餾水蒸餾水,滅菌后加入分別抽濾除菌的滅菌后加入分別抽濾除菌的1ml膽固膽固醇溶液醇溶液(5mg/ml乙醇乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/

3、L的的 CaCl 21ml 編輯ppt4M9緩沖液每升緩沖液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜現(xiàn)用現(xiàn)配S緩沖液0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH=6.0)編輯ppt5喂養(yǎng)方法 用冰M9緩沖液清洗蟲體 置4環(huán)境20min 1000r離心，棄上清,沉淀物用M9緩沖液重懸 置4環(huán)境20min 棄上清 取200ul沉淀物以靠接法接種到涂有大腸桿菌大腸桿菌OP50的的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將培養(yǎng)基放置到將培養(yǎng)基放置到16生化培養(yǎng)箱中，72h后可繁育至第二

4、代編輯ppt6 凍存準備1mlEP管，加入700ul30%甘油（s緩沖液溶解）用冰M9緩沖液清洗蟲體置4環(huán)境20min，1000r離心棄去上清將蟲體轉入事先準備好的EP管中，置于-80冰箱凍存（可保存2個月），需要時取出室溫解凍重置培養(yǎng)基編輯ppt7編輯ppt8研究范圍 細胞程序性死亡的遺傳調控機制 RNAi 及其作用機制 秀麗線蟲的功能基因組學及其他研究秀麗線蟲的功能基因組學及其他研究 低氧應答模式生物 基因組學和功能蛋白組學的研究基因組學和功能蛋白組學的研究 其他（其他（MAPK 信號傳導信號傳導 、 TGF- b 信號傳遞途徑信號傳遞途徑 、衰老和年齡及脂、衰老和年齡及脂肪代謝等）肪代謝

5、等）編輯ppt9 方法 線蟲基因顯微注射顯微注射技術是線蟲研究領域的常用技術，對線蟲進行轉基因操作的一種高效且相對簡單的方法，主 要用于研究線蟲突變種系的功能恢復(mutant rescue)、特定基因的過表達或異位表達、標 簽 蛋白的 表達、特 定 蛋白 質 結構域的功 能、DNA 或 RNA 調節(jié)元件的分析及 RNA 干擾等 此外，這項轉基因技術對于特異表型的篩選也是個強有 力 的 工具 ， 并 且 它還 可 用于 將人 工 合 成 mRNAs 或其他分子接引入細胞編輯ppt10設備 顯微注射全套儀器 瓊脂糖固定墊 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 緩 沖液編輯ppt

6、11編輯ppt12注射步驟制劑及破針制劑及破針固定蟲固定蟲將純化的將純化的 DNA 溶解在溶解在 Tris-EDTA(TE)緩沖液中即可接用緩沖液中即可接用于注射。在注射液中加入終濃于注射。在注射液中加入終濃度約度約 10 mg/L 的線蟲基因組的線蟲基因組 DNA，則會有效地提高轉基因，則會有效地提高轉基因效率。效率。將一小玻片放在加了注射油的將一小玻片放在加了注射油的固定墊上，操縱微操使注射針固定墊上，操縱微操使注射針與玻片邊緣相撞，若針頭尖端與玻片邊緣相撞，若針頭尖端撞破，可觀察到有液泡自動滲撞破，可觀察到有液泡自動滲出出注射時將注射時將線蟲挑至線蟲挑至瓊脂糖固瓊脂糖固定墊上，定墊上，調

7、整線蟲調整線蟲使性腺暴使性腺暴露，滴加露，滴加注射油覆注射油覆蓋整個蟲蓋整個蟲體體 固定固定好后的操好后的操作要迅速，作要迅速，否則線蟲否則線蟲容易脫水容易脫水而死而死將瓊脂糖固定墊放將瓊脂糖固定墊放在載物臺上，在載物臺上，40 x物物鏡下找到線蟲，使鏡下找到線蟲，使性腺聚焦在正確的性腺聚焦在正確的平面平面 操作微操或操作微操或輕移滑動載物臺，輕移滑動載物臺，將注射針尖刺入性將注射針尖刺入性腺腺 啟動微量加壓啟動微量加壓器進行注射，能觀器進行注射，能觀察到注射液在性腺察到注射液在性腺中快速流動，注射中快速流動，注射后的性腺被液體充后的性腺被液體充滿滿在體視顯微鏡下，在體視顯微鏡下，滴加恢復緩沖

8、液至滴加恢復緩沖液至注射后的線蟲正上注射后的線蟲正上方，由于與油互不方，由于與油互不相溶，緩沖液會滲相溶，緩沖液會滲入油下使線蟲浮入油下使線蟲浮起起 一般等待一般等待 2 5 min，線蟲活力，線蟲活力恢復，身體開始游恢復，身體開始游動，即可挑至培養(yǎng)動，即可挑至培養(yǎng)板上，板上，20 常規(guī)培常規(guī)培養(yǎng)養(yǎng)注射注射恢復恢復編輯ppt13 瓊脂糖固定墊 取約 50 ul 加熱溶解的 2%瓊脂糖(agarose)溶液滴在長寬 50 mmx24 mm，厚 0.13 0.17 mm 的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上，待瓊脂糖凝固后( 約 2 min)，將上面的玻片從側面滑下即可 制作好的固定墊室溫過夜或 65

9、 干燥 1h 后可疊放起來備用編輯ppt14 恢復緩沖液5.8 g Na2HPO4， 3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl， 1.0gNH4Cl加水至 1L，高壓滅菌，用于注射后線蟲的恢復編輯ppt15 注射編輯ppt16子代目的基因表達檢測注射后約 3 天，觀察孵出的 F1 代是否有目的DNA 表達 目前，線蟲外源基因表達的標記通常用：a 熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但熒光蛋白與目的蛋白形成融合蛋白，但需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；需要確定熒光蛋白的連接不影響目的蛋白的功能；b 目的基因與熒光標記基因共注射；目的基因與熒光標記基因共注射；c 目的基因目的基因與具有

10、明顯表型的標記基因共注射，與具有明顯表型的標記基因共注射，我們通常使用易觀察的 pmyo-3:TDimer II作為熒光標記，它在所有體壁肌肉細胞表達，轉基因效率高且本身對線蟲的行為 和功能沒有 影響。編輯ppt17顯微注射后的整合目前常用的整合方法有：用 y射線和 X射線照射，或用光敏劑補骨脂素加長波紫外線照射整合(TMP/UV integration) 基本策略是大量篩選經射線照射過的轉基因線蟲，一般挑取數(shù)百只 F1 代繁殖，篩選 F4 代，檢測是否有 100%的轉基因表達，若是則說明整合成功 一般一次整合能得到若干個獨立種系，可選擇最好的一個進行實驗編輯ppt18 整合TMP/UV 整合

11、無需 酌 或 X 射線源，可在普通實 驗室 進 行 誘 變 劑 TMP (Trioxsalen 或 4,5憶 ,8-Trimethylpsoralen, 三甲基補骨脂素)，劇毒，避光，對其操作都需避光進行 TMP/UV 的處理可使線蟲 DNA 發(fā)生隨機斷裂，從而使染色體外的 DNA片段整合至染色體上 TMP/UV 整合法的流程為：a 用 M9 緩沖液將同步好的 L4 齡線蟲從培養(yǎng)板中清洗下來，加 TMP(溶于 DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，存于-80 )使其終濃度為 50 mg/L b 室溫下輕柔振蕩15 min，將線蟲轉至未鋪菌的 9 cm 培養(yǎng)板上紫外線照射，照射能量為 35 000 滋J/cm2，

12、換算成瞬時功率即 350 滋W/cm2, 100s c 照射完畢后，在培養(yǎng)板上加大腸桿菌 OP50，室避光培養(yǎng) 5h，使線蟲活力恢復 d 挑取 15 25 只狀態(tài)較好的 P0 代個體，每板 1 只，等待大腸桿菌被吃完，挑 100300 只 F2 代，每板 1 只，觀察 F4 代是否全部表達注射 DNA 根據我們的經驗，如果經紫外線照射后，后代出現(xiàn)很多具有短粗、致死表型的線蟲，甚至 1/4 沒有后代，則預示整合成功 整合成功的標準是 F4 代全部表達目的基因，若沒有，一般沒必繼續(xù)篩選，可認為該克隆的整合不成功編輯ppt19細胞程序性死亡的遺傳調控機制 現(xiàn)階段研究已發(fā)現(xiàn)了十幾個控制細胞凋亡的基因，

13、這些凋亡基因之間通過遺傳相互作用組成一條線性的調控途徑控制細胞程序性死亡，包括凋亡的激活階段、凋亡的起始 、凋亡細胞的清除及凋亡細胞內部的 DNA 降解編輯ppt20線蟲PCA關鍵階段EGL-1：促凋亡蛋白，屬BCl2蛋白家族，與哺乳動物BAD、BIK/NBK及HRK同源CED-9:抗凋亡蛋白,與人體bcl-2同源CED-4:促凋亡蛋白,同源體為Apaf-1CED-3:凋亡蛋白,與ICE(caspase家族)同源編輯ppt21低氧應答模式生物低氧能夠引起秀麗線蟲發(fā)生相應的生理和行為學變化，并可保護機體免受缺氧損傷。秀麗線蟲的低氧誘導因子(HIF-1)的恒定性調控通路和人類的相應通路之間具有高度

14、保守性，因此秀麗線蟲也已成為研究低氧應答調控通路進化保守性的重要工具之一。闡明秀麗線蟲的低氧應答機制將為了解人類低氧相關疾病的發(fā)病機制提供有價值的線索。編輯ppt22相關機制低氧環(huán)境秀麗線蟲的非HIF一1介導的低氧應答通路秀麗線蟲的氧感知神經回路胰島素胰島素樣受體DAF-2通路熱休克蛋白及其它秀麗線蟲中低氧誘導因子HIF1介導的低氧應答編輯ppt23m i R N A 作用機制的研究首個時序調控的miRNA 基因 lin-4發(fā)現(xiàn)于線蟲，轉錄后形成兩種長度的RNA，較小的一個與基因lin-14的mRNA互補配對阻礙其翻譯，隨后又發(fā)現(xiàn)了類似作用的let-7.通過研究miRNA在線蟲細胞內對于靶基因翻譯表達的阻礙作用，為疾病治療提供新手段，特別是探究其對RNA病毒侵染的抑制作用編輯ppt24其他方面 衰老和壽命控制機制衰老和壽命控制機制DAF-16 蛋白可以轉運到細胞核中激活靶基因轉錄時 線蟲的壽命就可延長 反之則縮短 藥物篩選藥物篩選基于秀麗線蟲與人在