禽流感血凝抑制試驗(yàn)(HI)的影響因素分析.docx

1、禽流感血凝抑制試驗(yàn)（HI）的影響IIIII因素分析劉俊青（山西省長(zhǎng)治市郊區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西長(zhǎng)治（）46000）中圖分類號(hào):S858.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號(hào)：1008-04i4（2014）08-0010-03摘要血彼抑制試股是檢測(cè)禽沈感抗體水平的一種常用方法，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)楠、能夠處理大量祥品等君點(diǎn)，在區(qū)縣級(jí)醫(yī)實(shí)瞼宣被廣逝應(yīng)用。但是由于試驗(yàn)中不規(guī)范的操作和知節(jié)注意不夠.從而導(dǎo)致不正確的檢測(cè)姑果出現(xiàn)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，從而提供概誤的冬礎(chǔ)數(shù)據(jù)。文章粽述了減少禽流感血旅試臉的影響因素的措施。關(guān)鍵詞血凝抑制影響因素分析患寄生蟲病的病羊主要表現(xiàn)為消瘦、貧血、黃疽、水腫、營(yíng)養(yǎng)不良、發(fā)育受阻和消化障礙

2、等慢性消耗性疾病的癥狀，結(jié)合流行病學(xué)特點(diǎn)和尸體剖檢病變，一般可做出初步診斷。必要時(shí)可通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷的方法，檢查糞便中的蟲卵和幼蟲進(jìn)步確診。5.2治療根據(jù)羊的體質(zhì)、病情和寄生蟲的生物學(xué)特性等進(jìn)行合理用藥。采取不同的方法及早進(jìn)行驅(qū)蟲和殺蟲。要在加強(qiáng)護(hù)理、提高病羊抵抗力的基礎(chǔ)上.應(yīng)用各種驅(qū)蟲、殺蟲藥物對(duì)癥治療。另外，對(duì)于某些直接接觸感染的寄生蟲病，還應(yīng)將病寄進(jìn)行隔離治療，以免疾病擴(kuò)散。6 加強(qiáng)對(duì)羊群的飼養(yǎng)管理注意飲水衛(wèi)生寄生蟲的感染常因水源污染引起，有些中間宿主就生存于水中。因此，不良的飲水往往是寄生蟲病發(fā)生的感染源C要禁止飲用不流動(dòng)的池塘、沼澤地等處的水。最好是自來(lái)水和井水，其次是干凈無(wú)污染的河水

3、。6.1 保證羊只日糧的足拍:供給和飼料營(yíng)養(yǎng)成分的全價(jià)平衡，及時(shí)補(bǔ)充精料，以保證發(fā)揮機(jī)體抗病能力，要防止飼料污染。6.3搞好圈舍建設(shè)、衛(wèi)生、消毒。對(duì)土壞墻圈舍要搞好墻面粉刷和硬化處理，達(dá)到無(wú)縫、平整。墻高1.5-1.8m處最好用瓷片砌墻圈，防止蟠蟀擴(kuò)散污染羊舍。圈舍要經(jīng)常打掃.保持干燥、通風(fēng)良好，光照充足、密度合理。定期應(yīng)對(duì)羊舍進(jìn)行消毒（至少2周1次）。6.4在寄生蟲易感期應(yīng)避開污染牧場(chǎng)放牧。6.5從外地引種的，在引種后要詳細(xì)觀察羊只，無(wú)病后方可混群。7 做好糞便的無(wú)害化處理患寄生蟲病的羊只糞便中，常伴有很多寄生蟲卵、幼蟲和卵囊，如果處理不好，就會(huì)污染草料及飲水，使寄生蟲病擴(kuò)大傳播。因此，驅(qū)蟲

4、應(yīng)在專門的場(chǎng)所進(jìn)行?；技纳x病的羊只及羊群投驅(qū)蟲藥后，所排糞便要及時(shí)清理、運(yùn)送到指定地點(diǎn)進(jìn)行堆積，集中收集發(fā)禽流感病毒能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)哈（H1）。由于血凝反應(yīng)可被特異性抗體所抑制，抗體與病毒結(jié)合后，血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，因此血凝抑制試臉可以用于（1）檢測(cè)血清中的抗體水平；（2）卷定病毒；（3）輔助診斷病毒性疾?。唬?）作為適時(shí)免疫的輔助手段，能避免免疫失敗、免疫空檔及重復(fù)免疫造成的損失。1 樣品采集和處理1.1樣品的采集環(huán)境在25Y以上時(shí)，采集的血樣h以內(nèi)可以自然析出血清，但環(huán)境在10Y左右時(shí)，血清很難自然

5、析出，需放置在37Y培養(yǎng)箱中l(wèi)2h,才能析出血清“血清樣品應(yīng)采用隨機(jī)的方法以減少人為的主觀因素對(duì)最后結(jié)果產(chǎn)生影響，樣品數(shù)址應(yīng)每批采20%左右。運(yùn)輸全血可低溫保存送檢。有條件的可將自然析出或經(jīng)高心分離出的收稿日期：2014-06-23酵。放牧羊群投藥驅(qū)蟲后7d內(nèi)應(yīng)禁止放牧，糞便同樣也要集中發(fā)酵。發(fā)酵的目的是，利用產(chǎn)生的生物熱，殺死寄生蟲的蟲卵、幼蟲和蟲囊。集中發(fā)怖的具體方法是：把糞便集中成堆，外用10cm泥土糊好，再用塑料膜封死，發(fā)酵滅害30d后方可開封使用。8 小結(jié)羊的寄生蟲病可導(dǎo)致成年羊繁殖血清吸出，按需要分裝到離心管中，標(biāo)記清楚冷藏，同采樣表一同送檢.禁止運(yùn)輸過(guò)程中劇烈震動(dòng)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，1

6、.2待檢血清的保存當(dāng)血清被細(xì)菌污染嚴(yán)重或長(zhǎng)時(shí)間置于溫度較高環(huán)境就會(huì)變質(zhì)，變成渾濁的黃色。變質(zhì)的血清往往會(huì)發(fā)生凝集反應(yīng)，致使含有較高抗體的血清在做禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)前面幾孔凝集而后面幾孔凝集被抑制的現(xiàn)象，所以不能及時(shí)檢測(cè)的血清應(yīng)該放置4Y的冰箱保存。樣品待檢時(shí)間超過(guò)1周的需-20弋低溫保存。1.3非特異性凝集素的處理在該試驗(yàn)中雞血清極少出現(xiàn)非特異性陽(yáng)性反應(yīng)，沒(méi)有必要在試驗(yàn)前對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理。除雞外，有些禽（如水禽、鴿子）的血清可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性的凝集，這種特性的確定可用待檢血清做血凝試驗(yàn)，如果待檢血清也出現(xiàn)凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象，則說(shuō)明有非特異凝集素存在，需用雞紅細(xì)胞對(duì)待檢血清進(jìn)行吸

7、附，以除去非特異凝集索。方法：每0.5mL的血清中加入0.025mL的雞紅細(xì)胞，輕搖后靜力下降，羊毛、羊乳和羊肉產(chǎn)量降低、品質(zhì)受損，幼齡及育成羊生長(zhǎng)發(fā)育受阻，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益。防控工作面廣、髭大、周期K,防控不當(dāng)復(fù)發(fā)率高，影響防控效果。筆者在羊的寄生蟲病防控中，總結(jié)出了程序化適時(shí)驅(qū)蟲、合理用藥及推廣羊圈舍改造等經(jīng)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)要長(zhǎng)期堅(jiān)持、嚴(yán)格執(zhí)行.才能夠有效達(dá)到控制羊寄生蟲病發(fā)生的目的C置至少30min,800g離心25min,收集上清液，即為處理后的血清，或者也可用被檢禽中的紅細(xì)胞。2膠凍樣血清的原因分析在血清樣品抗體檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)膠凍樣血清，或者完全凝結(jié)，導(dǎo)致不能進(jìn)行檢測(cè)。雞血清析出呈

8、膠凍樣的原因：（1）進(jìn)食后或感染某些疾病時(shí)采血容易發(fā)生；（2）采血后放置的時(shí)間太短，血液沒(méi)有完全分層就做離心處理，纖維蛋白沒(méi)有析出，使血清呈膠凍狀；（3）血脂高，雞的脂肪堆積過(guò)多，在血清中的蛋白纖維和脂肪析出過(guò)多而成。飼喂高蛋白質(zhì)飼料的雞，分離的血清多呈現(xiàn)膠凍狀。2 器材的選擇和使用為使器材保持最佳工作狀態(tài)，應(yīng)建立選擇、使用、維護(hù)器材的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所用器材主要有單道、多道可調(diào)微量加樣器、微髭反應(yīng)板、吸頭、振蕩器等，微量反應(yīng)板、吸頭盡雖使用一次性產(chǎn)品。3.1單道、多道可調(diào)微量加樣器在使用前或使用一些時(shí)間后均應(yīng)進(jìn)行校正或簽定。使用時(shí)需注意：（1）吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松

9、開,以防溶液吸入過(guò)快，沖入加樣器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣；（2）為獲得較高的精確度，吸頭需預(yù)先吸取1次樣品溶液，然后再正式移液，因?yàn)槲⊙鍟r(shí)，吸頭內(nèi)壁會(huì)殘留一層“液膜”，造成排液敏偏小而產(chǎn)生誤差；（3）取樣時(shí)只需按到第一檔停點(diǎn)，排樣時(shí)需按到第二檔停點(diǎn)，才能徹底排出，以達(dá)到準(zhǔn)確的取樣量。2.2 微量反應(yīng)板建議使用96孔90°V型一次性優(yōu)質(zhì)塑料反應(yīng)板進(jìn)行HA-HI試輪，W避免使用有機(jī)反應(yīng)板因清洗不凈和過(guò)度磨損而影響試驗(yàn)結(jié)果。若使用有機(jī)反應(yīng)板，清洗程序是：試驗(yàn)完畢后，立即將反應(yīng)板用自來(lái)水反復(fù)沖洗（以孔底不留沉積的紅血球?yàn)闇?zhǔn)），再將沾有洗滌劑溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自來(lái)水反復(fù)沖凈每個(gè)

10、凹孔及板面，待反應(yīng)板干燥后，放到2%3%濃度的鹽酸中浸泡24h以上.撈出后用自來(lái)水沖洗多次.最后以蒸饞水沖洗23次，在溫箱中烘干備用。對(duì)底部磨損嚴(yán)重的反應(yīng)板要及時(shí)淘汰。3.3吸頭取復(fù)使用需經(jīng)超聲波清洗、高壓天菌后使用，使用一段時(shí)間后要淘汰、及時(shí)更新。3 pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）配制稱7.9gNaCi,0.2gKC1.0.24gKH2PO4（或1.44gNa2HPO4）和1.8gK2HPO4,溶于800mL蒸僧水中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,最后加蒸儒水定容至1L。分裝，121弋、15min高壓滅菌，一經(jīng)使用，于4T保存不超過(guò)3周。4 1%紅細(xì)胞懸液的配制雞翅部脈或心臟采血。采集

11、至少3只SPF公雞或無(wú)禽流感和新城疫抗體的健康公雞的抗凝血液與等量檸櫬酸鈉溶液混合，放入離心管中，加入34倍體積的PBS混勻，以1000r/min離心10min,去掉血漿和白細(xì)胞層，反復(fù)洗滌3次，最后吸取壓積紅細(xì)胞.PBS配制成體積分?jǐn)?shù)為1%的懸液，于4弋保存?zhèn)溆?。紅細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量:與新鮮程度決定了實(shí)際能與抗原結(jié)合的紅細(xì)胞表面受體的數(shù)址，影響到實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，紅細(xì)胞的多少影響到抗體效價(jià)的高低（正比）。5 4個(gè)血凝單位（HAU）抗原的配制先對(duì)抗原做血凝試驗(yàn)，以抗原與紅細(xì)胞完全凝集的亂作為抗原效價(jià)，再根據(jù)抗原效價(jià)，配成4個(gè)血凝單位抗原,4個(gè)血凝單位抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。為保證4個(gè)血凝單位抗原的配侗準(zhǔn)確無(wú)誤

12、，須做抗原回歸試驗(yàn)。取96孔V形微量反應(yīng)板，用微址移液器在26孔每孔加25jxL的PBS,第一孔加入4HA抗原50p»L,從第一列孔吸取25jiL混勻后的抗原液加到第二孔中，混勻后吸取25皿加入到第三孔中，依次進(jìn)行系列倍比稀釋至第五孔.最后從第五孔各吸取25棄之。設(shè)第六孔為紅細(xì)胞對(duì)照，從第一孔到第六孔依次為4HA、2HA、1HA、O5HA、Q25HA、對(duì)照每孔再加25aLPBS自右向左依次向各孔加入25jiLl%的雞紅細(xì)胞懸液。將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩1min,室溫（2025?。╈o置30min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定若第一、二、三孔出現(xiàn)完全凝集，第四孔出現(xiàn)50%的凝集，則表明該4個(gè)血

13、凝單位抗原配制準(zhǔn)確.可用于HI試驗(yàn)。如果第四孔也出現(xiàn)完全凝集，說(shuō)明該血凝價(jià)提高了1個(gè)滴度，需等址稀釋抗原；如果只有前2孔出現(xiàn)完全凝集.說(shuō)明該血凝價(jià)降低了1個(gè)滴度，抗原量需加倍。6 加樣在HI試驗(yàn)中有4次加樣步驟，即加PBS、待檢血清、4個(gè)血凝單位抗原、1%紅細(xì)胞懸液。加樣時(shí)須注意以下兒點(diǎn)。7.1加樣時(shí)應(yīng)將液體加在V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。7.2注意吸頭勿碰觸到液面，以免發(fā)生交叉污染。7.3 倍比稀釋時(shí)，避免氣泡產(chǎn)生（吸頭插入液面以F）引起混合不均，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。7.4 1%紅細(xì)胞懸液在試驗(yàn)過(guò)程中需隨用隨時(shí)搖勻，使之呈均質(zhì)狀態(tài)。7 孵育孵育溫度對(duì)試驗(yàn)的影響較大，從4

14、37丁，隨著溫度的上.升，HA與HI的滴度也跟著升高。同時(shí).溫度的高低也影響到反應(yīng)的速度，溫度過(guò)低反應(yīng)速度減慢，溫度過(guò)高會(huì)使反應(yīng)結(jié)果洗脫加快，所以孵育溫度?？刂圃谑覝?025丁,濕度30%70%。此外，孵育時(shí)間也須嚴(yán)格控制，一般來(lái)說(shuō)，以紅血球?qū)φ胀耆恋淼那昂?min內(nèi)判定試驅(qū)結(jié)果較好，在3040min。幾種抗球蟲藥對(duì)雞球蟲的療效對(duì)比試驗(yàn)陳超燕（廣西壯族自治區(qū)貴港市平南縣上渡鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西平南537300）文章編號(hào)：1008-0414（2014）08-0012-01中圖分類號(hào):S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B為探索使用市場(chǎng)上出售的幾種抗球蟲藥對(duì)雞球蟲的防治效果，我們?cè)诔抗怆u場(chǎng)進(jìn)行r對(duì)比性試

15、驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1試驗(yàn)材料及方法球蟲卵囊是從鄰近雞場(chǎng)收集到臨床癥狀明顯的球蟲病雞的糞便用飽和鹽水漂浮再離心沉淀收集。收集到的卵囊放在平器內(nèi)加入5%重絡(luò)酸鉀溶液使其濃度達(dá)到2.5%的情況F于溫室中培養(yǎng)。1.1 試驗(yàn)雞和分組從市場(chǎng)上購(gòu)買問(wèn)來(lái)的2（XX）羽雛雞中，挑選出個(gè)體無(wú)明顯差異的娠雞50羽，飼養(yǎng)到15日齡時(shí)，逐個(gè)編號(hào)，每組10羽。1.2試驗(yàn)方法1.2.1把在敢絡(luò)酸鉀溶液卜培養(yǎng)的卵囊離心，除去重絡(luò)酸鉀，直到卵橫抱子化，然后每個(gè)小雞分別稱取。第一至第四組稱成后每羽喂服5萬(wàn)完全抱子化的卵囊。第一組小雞在感染前一天在拌入鹽霉素60mg/（kg飼料），第二組小雞在感染前一天拌入氨內(nèi)林125mg/（

16、kg飼料），第三組小雞在感染前一天拌入氯苯脆33mg/（kg飼料），第四組小雞作為感染對(duì)照組，第五組作為不感染對(duì)照組。飼養(yǎng)第一至第五組小雞所用的飼料除了用抗球蟲藥成分不收褊日期：2014-04-29結(jié)果的判定以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為H1滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于21og2,陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于或等于3log2判定HI試驗(yàn)陰性；H【同外.其它成分配比一致。1.2.2試驗(yàn)時(shí)間：2009年12月3H-2010年4月5Ho分別觀察記錄各組小雞出病的癥狀、死亡情況、感染后7d逐羽稱重，記錄每組小雞飼料消耗量。2試驗(yàn)結(jié)果與分析試驗(yàn)結(jié)果詳

17、見表1。組科只效藥物名稱及其使用浪度發(fā)病數(shù)發(fā)病率死亡數(shù)死亡率相對(duì)增京率相時(shí)飼料轉(zhuǎn)化率110鹽客素（60）4400098.04133.25210兼丙林（120）8800053.5261.24310氯笨眼（33）66011050.6874.1341()感染不給藥10100550-5.37-10.73510不感染不給藥0000100100表1幾種抗球蟲藥對(duì)對(duì)球蟲的防治效果2.1發(fā)病記錄感染不給藥試組發(fā)病率為100%,感染試駛組的三蛆小雞在感染后410d都有不同程度的食欲減退，羽毛蓬松閉眼呆立，拉稀糞或拉白痢等癥狀，鹽霉素試驗(yàn)組的發(fā)病率為40%,氨內(nèi)林為80%,氯苯服為60%。三種抗球蟲藥中沒(méi)有一種藥

18、物控制雞球蟲病的發(fā)生，但對(duì)降低發(fā)病率都有-定效果，其中以鹽霉素效果最佳。2.2死亡記錄感染不給藥試驗(yàn)組死亡5只小雞，氯苯弧組死亡1只小雞，其他組無(wú)價(jià)等于41og2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于或等于51og2為陽(yáng)性?？傊?，在進(jìn)行愈流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)要考慮多方面的因素，尤其要注意各步驟操作的細(xì)節(jié)。只有提供真實(shí)可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)，才能動(dòng)態(tài)掌控禽群的食流感抗體水平，科學(xué)防控禽流感。死亡之現(xiàn)象。表明鹽霉素、氨丙林在暴發(fā)球蟲病時(shí)，對(duì)控制死亡都有很好的效果，而氛苯弧能降低死亡率。2.3增重記錄不感染不給藥組相對(duì)增重率為100%,鹽霉素絹為98.04%,兩組較為接近.表明60mg/（kg飼料）的鹽霉素不影響雞的生長(zhǎng)發(fā)育，不影響雞的增重；氨丙林和氯苯弧為53.52%和50.68%,表明兩藥明顯影響了雞的增重，氯苯服比氨丙林影響雞的增重更嚴(yán)重“2.4相對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率記錄鹽霉素組為133.35%,不感染不給藥組為100%。鹽霉素組飼料轉(zhuǎn)化率大過(guò)不感染不給藥組，提高了33.35%,表明60mg/（kg飼料）的鹽霉素能提高飼料轉(zhuǎn)化率，氨丙林組飼料轉(zhuǎn)化率降低了38.76%；氯苯胸飼料轉(zhuǎn)化降低f25.87%,氨丙林降低飼料轉(zhuǎn)化率比氯