禽流感血凝抑制試驗(HI)的影響因素分析.docx

1、禽流感血凝抑制試驗（HI）的影響IIIII因素分析劉俊青（山西省長治市郊區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西長治（）46000）中圖分類號:S858.3文獻標志碼：B文章編號：1008-04i4（2014）08-0010-03摘要血彼抑制試股是檢測禽沈感抗體水平的一種常用方法，具有簡便、快速、靈敏、準楠、能夠處理大量祥品等君點，在區(qū)縣級醫(yī)實瞼宣被廣逝應用。但是由于試驗中不規(guī)范的操作和知節(jié)注意不夠.從而導致不正確的檢測姑果出現(xiàn)的現(xiàn)象時有發(fā)生，從而提供概誤的冬礎數(shù)據(jù)。文章粽述了減少禽流感血旅試臉的影響因素的措施。關鍵詞血凝抑制影響因素分析患寄生蟲病的病羊主要表現(xiàn)為消瘦、貧血、黃疽、水腫、營養(yǎng)不良、發(fā)育受阻和消化障礙

2、等慢性消耗性疾病的癥狀，結(jié)合流行病學特點和尸體剖檢病變，一般可做出初步診斷。必要時可通過實驗室診斷的方法，檢查糞便中的蟲卵和幼蟲進步確診。5.2治療根據(jù)羊的體質(zhì)、病情和寄生蟲的生物學特性等進行合理用藥。采取不同的方法及早進行驅(qū)蟲和殺蟲。要在加強護理、提高病羊抵抗力的基礎上.應用各種驅(qū)蟲、殺蟲藥物對癥治療。另外，對于某些直接接觸感染的寄生蟲病，還應將病寄進行隔離治療，以免疾病擴散。6 加強對羊群的飼養(yǎng)管理注意飲水衛(wèi)生寄生蟲的感染常因水源污染引起，有些中間宿主就生存于水中。因此，不良的飲水往往是寄生蟲病發(fā)生的感染源C要禁止飲用不流動的池塘、沼澤地等處的水。最好是自來水和井水，其次是干凈無污染的河水

3、。6.1 保證羊只日糧的足拍:供給和飼料營養(yǎng)成分的全價平衡，及時補充精料，以保證發(fā)揮機體抗病能力，要防止飼料污染。6.3搞好圈舍建設、衛(wèi)生、消毒。對土壞墻圈舍要搞好墻面粉刷和硬化處理，達到無縫、平整。墻高1.5-1.8m處最好用瓷片砌墻圈，防止蟠蟀擴散污染羊舍。圈舍要經(jīng)常打掃.保持干燥、通風良好，光照充足、密度合理。定期應對羊舍進行消毒（至少2周1次）。6.4在寄生蟲易感期應避開污染牧場放牧。6.5從外地引種的，在引種后要詳細觀察羊只，無病后方可混群。7 做好糞便的無害化處理患寄生蟲病的羊只糞便中，常伴有很多寄生蟲卵、幼蟲和卵囊，如果處理不好，就會污染草料及飲水，使寄生蟲病擴大傳播。因此，驅(qū)蟲

4、應在專門的場所進行?；技纳x病的羊只及羊群投驅(qū)蟲藥后，所排糞便要及時清理、運送到指定地點進行堆積，集中收集發(fā)禽流感病毒能夠與雞紅細胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制實哈（H1）。由于血凝反應可被特異性抗體所抑制，抗體與病毒結(jié)合后，血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上，因此血凝抑制試臉可以用于（1）檢測血清中的抗體水平；（2）卷定病毒；（3）輔助診斷病毒性疾??；（4）作為適時免疫的輔助手段，能避免免疫失敗、免疫空檔及重復免疫造成的損失。1 樣品采集和處理1.1樣品的采集環(huán)境在25Y以上時，采集的血樣h以內(nèi)可以自然析出血清，但環(huán)境在10Y左右時，血清很難自然

5、析出，需放置在37Y培養(yǎng)箱中l(wèi)2h,才能析出血清“血清樣品應采用隨機的方法以減少人為的主觀因素對最后結(jié)果產(chǎn)生影響，樣品數(shù)址應每批采20%左右。運輸全血可低溫保存送檢。有條件的可將自然析出或經(jīng)高心分離出的收稿日期：2014-06-23酵。放牧羊群投藥驅(qū)蟲后7d內(nèi)應禁止放牧，糞便同樣也要集中發(fā)酵。發(fā)酵的目的是，利用產(chǎn)生的生物熱，殺死寄生蟲的蟲卵、幼蟲和蟲囊。集中發(fā)怖的具體方法是：把糞便集中成堆，外用10cm泥土糊好，再用塑料膜封死，發(fā)酵滅害30d后方可開封使用。8 小結(jié)羊的寄生蟲病可導致成年羊繁殖血清吸出，按需要分裝到離心管中，標記清楚冷藏，同采樣表一同送檢.禁止運輸過程中劇烈震動產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，1

6、.2待檢血清的保存當血清被細菌污染嚴重或長時間置于溫度較高環(huán)境就會變質(zhì)，變成渾濁的黃色。變質(zhì)的血清往往會發(fā)生凝集反應，致使含有較高抗體的血清在做禽流感血凝抑制試驗時，會出現(xiàn)前面幾孔凝集而后面幾孔凝集被抑制的現(xiàn)象，所以不能及時檢測的血清應該放置4Y的冰箱保存。樣品待檢時間超過1周的需-20弋低溫保存。1.3非特異性凝集素的處理在該試驗中雞血清極少出現(xiàn)非特異性陽性反應，沒有必要在試驗前對血清進行預處理。除雞外，有些禽（如水禽、鴿子）的血清可能對雞紅細胞產(chǎn)生非特異性的凝集，這種特性的確定可用待檢血清做血凝試驗，如果待檢血清也出現(xiàn)凝集紅細胞的現(xiàn)象，則說明有非特異凝集素存在，需用雞紅細胞對待檢血清進行吸

7、附，以除去非特異凝集索。方法：每0.5mL的血清中加入0.025mL的雞紅細胞，輕搖后靜力下降，羊毛、羊乳和羊肉產(chǎn)量降低、品質(zhì)受損，幼齡及育成羊生長發(fā)育受阻，嚴重影響生產(chǎn)效益。防控工作面廣、髭大、周期K,防控不當復發(fā)率高，影響防控效果。筆者在羊的寄生蟲病防控中，總結(jié)出了程序化適時驅(qū)蟲、合理用藥及推廣羊圈舍改造等經(jīng)驗，這些實驗要長期堅持、嚴格執(zhí)行.才能夠有效達到控制羊寄生蟲病發(fā)生的目的C置至少30min,800g離心25min,收集上清液，即為處理后的血清，或者也可用被檢禽中的紅細胞。2膠凍樣血清的原因分析在血清樣品抗體檢測過程中，經(jīng)常出現(xiàn)膠凍樣血清，或者完全凝結(jié)，導致不能進行檢測。雞血清析出呈

8、膠凍樣的原因：（1）進食后或感染某些疾病時采血容易發(fā)生；（2）采血后放置的時間太短，血液沒有完全分層就做離心處理，纖維蛋白沒有析出，使血清呈膠凍狀；（3）血脂高，雞的脂肪堆積過多，在血清中的蛋白纖維和脂肪析出過多而成。飼喂高蛋白質(zhì)飼料的雞，分離的血清多呈現(xiàn)膠凍狀。2 器材的選擇和使用為使器材保持最佳工作狀態(tài)，應建立選擇、使用、維護器材的標準操作程序，所用器材主要有單道、多道可調(diào)微量加樣器、微髭反應板、吸頭、振蕩器等，微量反應板、吸頭盡雖使用一次性產(chǎn)品。3.1單道、多道可調(diào)微量加樣器在使用前或使用一些時間后均應進行校正或簽定。使用時需注意：（1）吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松

9、開,以防溶液吸入過快，沖入加樣器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣；（2）為獲得較高的精確度，吸頭需預先吸取1次樣品溶液，然后再正式移液，因為吸取血清時，吸頭內(nèi)壁會殘留一層“液膜”，造成排液敏偏小而產(chǎn)生誤差；（3）取樣時只需按到第一檔停點，排樣時需按到第二檔停點，才能徹底排出，以達到準確的取樣量。2.2 微量反應板建議使用96孔90°V型一次性優(yōu)質(zhì)塑料反應板進行HA-HI試輪，W避免使用有機反應板因清洗不凈和過度磨損而影響試驗結(jié)果。若使用有機反應板，清洗程序是：試驗完畢后，立即將反應板用自來水反復沖洗（以孔底不留沉積的紅血球為準），再將沾有洗滌劑溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自來水反復沖凈每個

10、凹孔及板面，待反應板干燥后，放到2%3%濃度的鹽酸中浸泡24h以上.撈出后用自來水沖洗多次.最后以蒸饞水沖洗23次，在溫箱中烘干備用。對底部磨損嚴重的反應板要及時淘汰。3.3吸頭取復使用需經(jīng)超聲波清洗、高壓天菌后使用，使用一段時間后要淘汰、及時更新。3 pH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）配制稱7.9gNaCi,0.2gKC1.0.24gKH2PO4（或1.44gNa2HPO4）和1.8gK2HPO4,溶于800mL蒸僧水中，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,最后加蒸儒水定容至1L。分裝，121弋、15min高壓滅菌，一經(jīng)使用，于4T保存不超過3周。4 1%紅細胞懸液的配制雞翅部脈或心臟采血。采集

11、至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫抗體的健康公雞的抗凝血液與等量檸櫬酸鈉溶液混合，放入離心管中，加入34倍體積的PBS混勻，以1000r/min離心10min,去掉血漿和白細胞層，反復洗滌3次，最后吸取壓積紅細胞.PBS配制成體積分數(shù)為1%的懸液，于4弋保存?zhèn)溆?。紅細胞的實際數(shù)量:與新鮮程度決定了實際能與抗原結(jié)合的紅細胞表面受體的數(shù)址，影響到實驗的準確性，紅細胞的多少影響到抗體效價的高低（正比）。5 4個血凝單位（HAU）抗原的配制先對抗原做血凝試驗，以抗原與紅細胞完全凝集的亂作為抗原效價，再根據(jù)抗原效價，配成4個血凝單位抗原,4個血凝單位抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。為保證4個血凝單位抗原的配侗準確無誤

12、，須做抗原回歸試驗。取96孔V形微量反應板，用微址移液器在26孔每孔加25jxL的PBS,第一孔加入4HA抗原50p»L,從第一列孔吸取25jiL混勻后的抗原液加到第二孔中，混勻后吸取25皿加入到第三孔中，依次進行系列倍比稀釋至第五孔.最后從第五孔各吸取25棄之。設第六孔為紅細胞對照，從第一孔到第六孔依次為4HA、2HA、1HA、O5HA、Q25HA、對照每孔再加25aLPBS自右向左依次向各孔加入25jiLl%的雞紅細胞懸液。將反應板置于微量振蕩器上振蕩1min,室溫（2025?。╈o置30min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定若第一、二、三孔出現(xiàn)完全凝集，第四孔出現(xiàn)50%的凝集，則表明該4個血

13、凝單位抗原配制準確.可用于HI試驗。如果第四孔也出現(xiàn)完全凝集，說明該血凝價提高了1個滴度，需等址稀釋抗原；如果只有前2孔出現(xiàn)完全凝集.說明該血凝價降低了1個滴度，抗原量需加倍。6 加樣在HI試驗中有4次加樣步驟，即加PBS、待檢血清、4個血凝單位抗原、1%紅細胞懸液。加樣時須注意以下兒點。7.1加樣時應將液體加在V型板的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。7.2注意吸頭勿碰觸到液面，以免發(fā)生交叉污染。7.3 倍比稀釋時，避免氣泡產(chǎn)生（吸頭插入液面以F）引起混合不均，影響檢測結(jié)果的準確性。7.4 1%紅細胞懸液在試驗過程中需隨用隨時搖勻，使之呈均質(zhì)狀態(tài)。7 孵育孵育溫度對試驗的影響較大，從4

14、37丁，隨著溫度的上.升，HA與HI的滴度也跟著升高。同時.溫度的高低也影響到反應的速度，溫度過低反應速度減慢，溫度過高會使反應結(jié)果洗脫加快，所以孵育溫度?？刂圃谑覝?025丁,濕度30%70%。此外，孵育時間也須嚴格控制，一般來說，以紅血球?qū)φ胀耆恋淼那昂?min內(nèi)判定試驅(qū)結(jié)果較好，在3040min。幾種抗球蟲藥對雞球蟲的療效對比試驗陳超燕（廣西壯族自治區(qū)貴港市平南縣上渡鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西平南537300）文章編號：1008-0414（2014）08-0012-01中圖分類號:S858.31文獻標志碼：B為探索使用市場上出售的幾種抗球蟲藥對雞球蟲的防治效果，我們在晨光雞場進行r對比性試

15、驗?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。1試驗材料及方法球蟲卵囊是從鄰近雞場收集到臨床癥狀明顯的球蟲病雞的糞便用飽和鹽水漂浮再離心沉淀收集。收集到的卵囊放在平器內(nèi)加入5%重絡酸鉀溶液使其濃度達到2.5%的情況F于溫室中培養(yǎng)。1.1 試驗雞和分組從市場上購買問來的2（XX）羽雛雞中，挑選出個體無明顯差異的娠雞50羽，飼養(yǎng)到15日齡時，逐個編號，每組10羽。1.2試驗方法1.2.1把在敢絡酸鉀溶液卜培養(yǎng)的卵囊離心，除去重絡酸鉀，直到卵橫抱子化，然后每個小雞分別稱取。第一至第四組稱成后每羽喂服5萬完全抱子化的卵囊。第一組小雞在感染前一天在拌入鹽霉素60mg/（kg飼料），第二組小雞在感染前一天拌入氨內(nèi)林125mg/（

16、kg飼料），第三組小雞在感染前一天拌入氯苯脆33mg/（kg飼料），第四組小雞作為感染對照組，第五組作為不感染對照組。飼養(yǎng)第一至第五組小雞所用的飼料除了用抗球蟲藥成分不收褊日期：2014-04-29結(jié)果的判定以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為H1滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2,陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。HI價小于或等于3log2判定HI試驗陰性；H【同外.其它成分配比一致。1.2.2試驗時間：2009年12月3H-2010年4月5Ho分別觀察記錄各組小雞出病的癥狀、死亡情況、感染后7d逐羽稱重，記錄每組小雞飼料消耗量。2試驗結(jié)果與分析試驗結(jié)果詳

17、見表1。組科只效藥物名稱及其使用浪度發(fā)病數(shù)發(fā)病率死亡數(shù)死亡率相對增京率相時飼料轉(zhuǎn)化率110鹽客素（60）4400098.04133.25210兼丙林（120）8800053.5261.24310氯笨眼（33）66011050.6874.1341()感染不給藥10100550-5.37-10.73510不感染不給藥0000100100表1幾種抗球蟲藥對對球蟲的防治效果2.1發(fā)病記錄感染不給藥試組發(fā)病率為100%,感染試駛組的三蛆小雞在感染后410d都有不同程度的食欲減退，羽毛蓬松閉眼呆立，拉稀糞或拉白痢等癥狀，鹽霉素試驗組的發(fā)病率為40%,氨內(nèi)林為80%,氯苯服為60%。三種抗球蟲藥中沒有一種藥

18、物控制雞球蟲病的發(fā)生，但對降低發(fā)病率都有-定效果，其中以鹽霉素效果最佳。2.2死亡記錄感染不給藥試驗組死亡5只小雞，氯苯弧組死亡1只小雞，其他組無價等于41og2為可疑，需重復試驗；HI價大于或等于51og2為陽性?？傊谶M行愈流感血凝抑制試驗時要考慮多方面的因素，尤其要注意各步驟操作的細節(jié)。只有提供真實可靠的檢測數(shù)據(jù)，才能動態(tài)掌控禽群的食流感抗體水平，科學防控禽流感。死亡之現(xiàn)象。表明鹽霉素、氨丙林在暴發(fā)球蟲病時，對控制死亡都有很好的效果，而氛苯弧能降低死亡率。2.3增重記錄不感染不給藥組相對增重率為100%,鹽霉素絹為98.04%,兩組較為接近.表明60mg/（kg飼料）的鹽霉素不影響雞的生長發(fā)育，不影響雞的增重；氨丙林和氯苯弧為53.52%和50.68%,表明兩藥明顯影響了雞的增重，氯苯服比氨丙林影響雞的增重更嚴重“2.4相對飼料轉(zhuǎn)化率記錄鹽霉素組為133.35%,不感染不給藥組為100%。鹽霉素組飼料轉(zhuǎn)化率大過不感染不給藥組，提高了33.35%,表明60mg/（kg飼料）的鹽霉素能提高飼料轉(zhuǎn)化率，氨丙林組飼料轉(zhuǎn)化率降低了38.76%；氯苯胸飼料轉(zhuǎn)化降低f25.87%,氨丙林降低飼料轉(zhuǎn)化率比氯