水痘-帶狀皰疹病毒抗原的ELISA定量檢測方法的建立.docx

1、doi：10.3969/j.issn.1CXXM84X.2013.05.021水痘帶狀皰疹病毒抗原的ELISA定量檢測方法的建立周欽賈繼宗劉劍陳麗宏楊連威曾麗文韓金樂葉祥忠李益民夏煥章(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽110016)中國圖書分類號R392.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1000484X(2013)054)5424)5摘要目的:建立水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)抗原的雙抗體央心ELISA定量檢測方法，用于質(zhì)控VZV滅活疫苗研發(fā)和生產(chǎn)中抗原含方法：以VZV中和單抗5F6C8為包被抗體、8H5I)1為酶標(biāo)抗體，構(gòu)建定量檢測VZV抗原的雙抗體夾心ELISA方法,并對本方法的特異性、靈敏度

2、、準(zhǔn)確性、線性和穩(wěn)定性等性能進(jìn)行分析。結(jié)果：建立的雙抗體夾心定量檢測VZV抗原的ELISA方法，線性范圍為0.4jig-13Wml.相關(guān)系數(shù)為R2=0.994,定居限度為0.4pg/ml；變異系數(shù)CV<15%、準(zhǔn)確性恒】收率介于87.5%-111.6%之間，穩(wěn)定性37筆6天的回收率80%°與VZV以外的相關(guān)病毒樣本沒有交叉反應(yīng)。結(jié)論：構(gòu)建的VZV抗原ELISA定讖檢測方法的各項(xiàng)性能符合定量檢測需要，可用于VZV滅活疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)過程的抗原含量檢測。關(guān)鍵詞水痘-帶狀皰疹病毒;抗原;雙抗體夾心ELISADevelopmentofaquantitativeELISAdetectio

3、nmethodforVaricellaZosterVirus(VZV)antigenZHOUQin,JIAJi-Zong,LIUJian,CHENLi-Hong,YANGLian-Wei3ZENGLi-Wen,HANJin-",YEXiang-Zhong,LIYi-Min,XIAHuan-Zhang.CollegeofLifeScienceandBiopharmaceutics,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,ChinaAbstract.Objective：Todevelopaquantitativeenzymelink

4、edirnmunosorlirntassay(Q-ELISA)todeterminetheconcentrationofVaricellaZosterVirus(VZV)antigen.ThismethodwasusedtodetermineVZVantigencontentateachstageofVZVinactivevac-cinedevelopingandmanufacturingprocess.Methods:AdoubleantibodysandwichQ-ELISAwasdevelopedtodetermineconcentrationofVZVantigen,whichwasb

5、asedonthethehigh-affinityneutralizingmonoclonalantibodies5F6C8ascaptureantibodies,and8H5D1asHRP-labeledantibmiy.Theperformanceofreagentwereevaluated.Results:TheQ-ELISAforVZVantigencontentwassuccessfullydeveloped.Thereagenthadgoodperformance.Thequantitationscopewas0.4眺13pL/ml,'Ihecoefficientcorre

6、lationwas0.994,thelimitofdetectionwas0.4jig/ml,therecoverywasbetween87.5%and111.6%.Thestabilitywasupto80%aftern*agenlwasheatedfor6daysat37T.'Ilicvariationcoefficientwaslowerthan15%,andthereagentwasnoreactionwithothersampleexceptVZVantigen.Conclusion:TheQ-E1JSAforVZVantigenwasdevelopedwithgoodspe

7、cificity,accuracyandstability.,HiemethodcanbeusedtodetermineVZVantigencontentduringdevelopmentandproductionofVZVinactivevaccine.KeywordsVaricellaZosterVirus(VZV)；Antigen；DoubleantibodysandwichELISA水痘-帶狀皰疹病毒(VaricellaZosterVirus,VZV)是皰疹病毒科，a-皰疹病毒亞科的成員，是一種具有高度傳染性的病毒，能引發(fā)水痘(Varied-la)和帶狀皰疹(HerpesZoster)

8、o病毒初次感染引發(fā)水痘，產(chǎn)生發(fā)熱、皮疹和瘙癢等癥狀，同時(shí)，病毒會北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，北京102206 曜門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門361005作者簡介:周欽(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事病樣及疫苗檢測方法研究,E-rnail：zhouqinhulx:i；指導(dǎo)教師:葉祥忠(1967年)，男.碩上.高級工程師，主要從米疫苗與診斷試劑研發(fā)方面的研究,E-mail:yxzh_hb163com0潛伏于感覺神經(jīng)中樞，旦具有終生潛伏性。在兒童中水痘通常是自愈的，但是至少有1%的15歲以卜兒童會出現(xiàn)并發(fā)癥，如細(xì)菌二次感染、肺炎、腦炎、肝炎、美節(jié)炎和眼部綜合癥等，其

9、中10%50%的兒童因?yàn)楦腥拘枰驮\。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)至少有15%水痘患者機(jī)體的潛伏病毒在一定條件下會再激活產(chǎn)生帶狀皰疹，旦帶狀皰疹的發(fā)病率隨年齡增加而提高"si,50%帶狀皰疹患者分布于60歲以上人群。愈后神經(jīng)痛是帶狀皰疹的主要并發(fā)癥，一般持續(xù)半年左右，有時(shí)可長達(dá)一年，甚至更長時(shí)間，嚴(yán)重困擾患者身心健康。水痘和帶狀皰疹及其相關(guān)的并發(fā)癥已經(jīng)成為公眾衛(wèi)生問題而逐漸受到人們的重視,預(yù)防和治療成為研究的重點(diǎn)。接種活疫苗是預(yù)防水痘和帶狀皰疹的最經(jīng)濟(jì)的措施，但是，對器官移植患者或細(xì)胞免疫缺陷者而言，減毒活疫苗存在安全性問題，因而，對這類人群而言，滅活疫苗在預(yù)防帶狀皰疹上更安全。研發(fā)VZV抗原檢測試劑

10、，是對在VZV疫苗特別是在滅活疫苗的研制過程中，準(zhǔn)確質(zhì)控病毒抗原含量,指導(dǎo)疫苗研發(fā)、質(zhì)控疫苗生產(chǎn)和保障疫苗放行的最有效手段。本文介紹一種靈敏的、準(zhǔn)確的和特異的VZV抗原檢測系統(tǒng)以及該系統(tǒng)在VZV抗原檢測中的相關(guān)應(yīng)用，為VZV疫苗的檢測提供支持。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1抗體及參考品VZV單克隆抗體5F6C8由廈門大學(xué)提供,VZV單克隆抗體8H5D1由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司（下稱萬泰公司）提供。1.1.2檢測樣品水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、單純皰疹病毒I/U（HSVI/n）、甲型肝炎病毒（HAV）、柯薩奇病毒A組16型（CA16）和人腸道病毒71型（EV7

11、1）由萬泰公司保存。1.1.3其他試劑牛血清門蛋白（BSA）,辣根過氧化物酶（HRP）（美國Sigma公司）；BCA試劑（美國Thermo公司），單抗-HRP由萬泰公司制備。1.2單抗的制備以純化的VZV糖蛋白（VZV-gp）為免疫原，免疫BALB/c小鼠，采集并檢測免疫后小鼠血清抗VZV-gp抗體滴度，當(dāng)血清抗體滴度達(dá)到1Xi。"時(shí)，取安樂死小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨情痛Sp2/0細(xì)胞按經(jīng)典PEG方法融合。間接EI.ISA法篩選特異性雜交瘤細(xì)胞°雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔接種小鼠生產(chǎn)腹水，腹水經(jīng)硫酸鉉沉淀和QSepharoseHighPerformance和ProteinA柱層析得到純化

12、的單克隆抗體（mAb）o1.3單克隆抗體篩選用VZV-gp包被酶標(biāo)板，用間接法分析單抗效價(jià);將效價(jià)高的抗VZV的單抗用斑點(diǎn)雜交法及Westernblot法檢測抗體的特異性，細(xì)胞中和法測單抗效價(jià)，選擇特異性好的抗體構(gòu)建雙抗體夾心系統(tǒng)。1.4單克隆抗體抗原表位分析用疊加ELISA法進(jìn)行抗原表位分析。根據(jù)公式:AI=2xA（l+2）/（Al+A2）-lx|00%,計(jì)算2株單抗之間的重疊率。其中A（1+2）為兩株單抗疊加后的值,AI為一株單抗的值，A2為另一株單抗的0D也驢值;若AI>50%,表示兩株單抗可能識別不同抗原表位,AI值越大，說明兩株單抗重登可能性越小。1.5雙抗體夾心EUSA法的建

13、立將純化后用于包被的單抗和HRP標(biāo)記的單抗作系列稀釋,采用方陣試驗(yàn)確定兩者最佳的使用濃度，采用正交試驗(yàn)和平行試驗(yàn)篩選并確定封閉液、樣品稀釋液和醵標(biāo)抗體稀釋液組方，建立雙抗體夾心檢測方法O1.6性能分析根據(jù)中華人民共和國藥典三部（2010版）【眨對檢測方法騷證的要求，對試劑的線性、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性等性能進(jìn)行分析。1.6.1準(zhǔn)確性試驗(yàn)將VZV抗原內(nèi)部參考品用樣品稀釋液稀釋為高值（12|ig/ml）、中值（6ag/ml）、低值（3pLg/ml）共3個(gè)濃度的VZV抗原溶液，用本方法進(jìn)行測定，每個(gè)濃度樣品作3個(gè)重復(fù)檢測，計(jì)算稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的測定值和理論標(biāo)示值的比值，即回收率，分析試劑的準(zhǔn)確性。1.6.

14、2精密性試驗(yàn)對高值（12|ig/ml）、中值（6瞄/ml）、低值（3|ig/ml）3個(gè)濃度的VZV抗原稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在3人次獨(dú)立試驗(yàn)中，對每一稀釋度作3個(gè)重復(fù)測定。比較測定值和真實(shí)值，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析試劑精密性。1.6.3直線性和定01限度試驗(yàn)用樣品稀釋液將VZV抗原參比品稀釋到26J3、6.5、3.25、1.6、0.8、0.4A2.0pig/ml。用本方法進(jìn)行測定，以抗原濃度對01）值作直線回歸分析，分析最佳線性范圍，確定定量限度。1.6.4穩(wěn)定性試羚通過37勾熱破壞性試驗(yàn)預(yù)測試劑的穩(wěn)定性。用在37勾放置3天和6天的試劑，測定VZV抗原的吸收值，以4T放置的試劑作對照，計(jì)算于37Y與4

15、T放置的試劑檢測樣品的0D值之比,分析試劑的穩(wěn)定性。1.6.5特異性試驗(yàn)用本方法分別檢測滅活的VZV收獲液、CMV收獲液、HSVI/n收獲液、CA16收獲液、HAV收獲液，用本方法分別檢測小牛血清、小鼠血清、正常人血清、人血白蛋白、MRC-5細(xì)胞、MEM培養(yǎng)基。分析本試劑的特異性。1.7方法的應(yīng)用抗原底檢測用本方法檢測23批凍干帶狀皰疹減毒活疫苗（萬泰公司制備）中VZV-Ag的含量.并同時(shí)檢測凍干活疫苗的病毒滴度，根據(jù)檢測結(jié)果擬定疫苗病毒滴度與抗原含量之間的關(guān)系。2.1單克隆抗體篩選根據(jù)抗體滴度、細(xì)胞中和水平、斑點(diǎn)雜交.Westernblot和配對后檢測VZV抗原的靈敏度，篩選到兩株用于試劑構(gòu)

16、建的單抗,5F6C8單抗用于包被;8H5D1單抗用于HRP標(biāo)記的組合最優(yōu)。兩株單抗的特性見表1和圖I、2。2.2單克隆抗體抗原表位分析采用企加ELISA法對兩株單抗進(jìn)行抗原&位分析，見表2。結(jié)果表明5F6C8識別VZV-gp上的一個(gè)抗原表位.8H5D1識別VZV-gp上的另一個(gè)抗原表位。2.3雙抗體火心方法建V.通過優(yōu)化ELISA試驗(yàn)條件，確定VZV抗原的雙抗體夾心ELISA定代檢測系統(tǒng)：單抗用50mmol/L碳酸鹽緩沖液(PH9.6)稀釋到2.0jig/ml包破96孔板，100隊(duì)在孔,4Y過夜,棄液;用封閉液封閉,200W孔,37無溫育2小時(shí)；加稀釋樣品，100W孔，37無溫育1小時(shí)

17、；洗板5次，加酸標(biāo)抗體I：作液，100W孔，37Y溫ft45分仲，洗板5次JillTMB顯色液，100以/孔，37無溫育15分鐘，加2mol/LH2SO4終止,450/630雙波長讀A(1*10繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬定標(biāo)準(zhǔn)方程，代入樣品的A值.計(jì)算待檢品抗原活性值。2.4性能分析2.4.1準(zhǔn)確性和粘密性待檢品的I叫收率介于87.5%111.6%之間；幣：夏檢測和牯密座檢測的變異系數(shù)<15%。結(jié)果如表3所示。表1兩株抗體的特性Tab.1ThecharacteristicsoftwoVZVantibodiesM<vl»nanwPuqxzNrulralizingantilwMiyti

18、trrAntibodylilrrEpilofwAblype«H5DIHRPsign3201：100KLinearIgG2*5F6C8coaling2561：1950KLinearIgf1表2疊加ELISA試驗(yàn)結(jié)果Tab.2TheresultofsupcrposableELISAtestMal>s5F6(：«8H5DISF6C88H5D169.45%表3準(zhǔn)確性及精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.3VerificationofaccuracyandprecisionofQ-ELISAVZantigenr%emgeratioCV(岫ml)(%)(%)12l2.4±0.698.

19、7-106.60.266.2±0.696.3-111.61.()32.9±0.587.5-110.23.6kD11666.44535A67234567圖1兩株VZV抗體的Westernblot實(shí)驗(yàn)Eig.1WesternblotofantibodiesagainstVZVNote：A.SDS-PAGEofsani|>lt*s:B.Westernl»l<>(of5F6C8；C.Westernblot<>f8H5DI(I.Marker；!.VZV-gp；3.NBS；4.accineprotwlanl；5.Plas-lmmin；6.MRC-

20、5；7.VZV).D圖2抗體的斑點(diǎn)雜交分析Fig.2PlaqueassayofmonoclonalantibodyagainstVZVNolf：A.5F6(18pla<|u<*assay;B.Xli5l)l|>la(|iiruMsay;C.Nrgalivrhybridization；I).Posithi*hyl>ri<liz<ili<»n.2.4.2線性和定量限度VZV-gp抗原內(nèi)部參比品用樣品稀釋液稀釋為26、13、6.5、3.25、1.6、0.8、0.4、0.2、0岫ml后，用本方法測定吸光值,以濃度和吸光值作回歸分析得到,線性范圍為0.

21、4片13岫ml、R2=0.994,定圾限度為0.4心的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)通過37T熱破壞試驗(yàn)預(yù)測試劑的穩(wěn)定性c在37乞放置3天和6天的試劑，測定吸收值，試劑存放穩(wěn)定性80%，見表4。2.4.4特異性試驗(yàn)用本方法測定特異性試驗(yàn)樣品，檢品的A450/630均小于0.4jig/ml,小于Cutoff值（0.075）,即無交叉反應(yīng)。y-0.1263x+0.0549y=0.1236x+0.0724y-0.1235x+0.0587圖3VZV抗原內(nèi)部參比品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3StandardcurveofinternalreferenceofVZVantigen表4試劑的熱穩(wěn)定性性能分析

22、結(jié)果Tab.4VerificationofthermostabilityofQ-ELISA37?。╠）CoalingEnzymeSampleEntirelyrecoveryrecoveryrecoveryrecovery3100%85%96%83%6100%86%93%82%2.002.202.402.602.803.003203.40LOG(VZV-antigenconcentration)圖4VZV-antigen含與帶狀皰疹疫苗滴度的相關(guān)性分析Fig.4CorrelationanalysisofVZV-antigenconcentrationandHerpesZostervaccinet

23、iterrelationship2.5抗原量檢測用本方法檢測凍干帶狀皰疹疫苗的結(jié)果顯示，疫苗抗原含量與疫苗病毒滴度呈現(xiàn)良好的相關(guān)性,R=0.96,見圖4。3討論帶狀皰疹是由潛伏于人感覺神經(jīng)中樞的VZV再激活引發(fā)的沿神經(jīng)末梢分布的真皮性皰疹，隨年齡增加帶狀皰疹發(fā)病率急劇增加,60歲以上帶狀皰疹患者占50%以上,愈后神經(jīng)痛（PHN）是最常見的并發(fā)癥隨年齡增加PHN發(fā)病率和嚴(yán)重性都增加，帶狀皰疹這種發(fā)病規(guī)律是因?yàn)榧?xì)胞免疫應(yīng)答水平隨年齡增加而降低所致。細(xì)胞免疫低下者或細(xì)胞免疫缺陷者如化療患者、HIV患者、器官移植者易患帶狀皰疹，這類人群接種帶狀皰疹活疫苗風(fēng)險(xiǎn)更大,接種滅活疫苗可能是較好的選擇。Atsu

24、ko等將默克公司的熱滅活水痘疫苗接種于移植前和移植后的造血細(xì)胞移植患者，臨床顯示疫苗組接種者體內(nèi)IFN-）和TNF-a水平顯著高于安慰劑組。水痘疫苗針對VZV特異的CD4T細(xì)胞在造血細(xì)胞移植前后能給患者提供持久和穩(wěn)固的細(xì)胞免疫應(yīng)答。滅活VZV疫苗包含的多種病毒蛋白能提高患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，降低移植受體水痘和帶狀皰疹的發(fā)病率，避免減毒活疫苗在移植患者體內(nèi)的再活化引發(fā)水痘或帶狀皰疹的風(fēng)險(xiǎn)；Rebecca】進(jìn)行的類似研究并得出相同結(jié)論。Ste-ven等0就默克公司水痘減毒活疫苗與水痘熱滅活疫苗免疫的血清陽性健康成人，比較免疫后成人體內(nèi)抗體滴度，發(fā)現(xiàn)兩種免疫方式所產(chǎn)生的抗體滴度水平?jīng)]有差異，并指出

25、水痘滅活疫苗可以解決免疫受損患者例如HIV感染者或者腫瘤化療患者因不能使用減毒活疫苗問題。隨后Anthony等'就默克公司水痘減毒活疫苗與水痘熱滅活疫苗在健康老年人體內(nèi)進(jìn)行了同樣的研究，比較了兩種免疫方式所產(chǎn)生T細(xì)胞數(shù)量、抗體水平JFN-7水平，并得出VZV滅活疫苗和VZV減毒活疫苗在安全性、抗體水平和T細(xì)胞應(yīng)答方面具有相同效果的結(jié)論，進(jìn)一步印證了滅活VZV疫苗的功效和應(yīng)用。本文介紹的VZV抗原定量檢測方法，是以針對VZV抗原的親和力高、中和性好的特異性單抗為基礎(chǔ)構(gòu)建的,試劑性能穩(wěn)定，不隨抗體批次不同而變化。本VZV抗原定量檢測試劑直線性好、靈敏度高，可以質(zhì)控VZV滅活疫苗中Ag含拼，

26、用于疫苗生產(chǎn)工藝中病毒培券條件優(yōu)化、病毒純化方法建立、滅活條件選擇、制品穩(wěn)定性等研究中抗原含量分析。（下轉(zhuǎn)第552頁）OchiT,FujiwaraH,OkamotoSelal.NoveladoptiveT-cellimmunotherapyusinguW-specificTCRvectorencodingsilencemforendogenousTCRsshowsmarkedantileukemiarraclivilyandsafetyJ.Blood.2011；H8(6)：1495.1503.20 ProvasiE,GenoveseP.LombardoAelal.EditingTcellspe

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32、ftheMAGE-AantigensuperfamilyinseveraltypesofcancerJ.JImmunol,2011:186(2):685096.2728293078910H1213收稿2012-06-20(編輯倪夠)（上接第545頁）VZV滴度檢測經(jīng)典方法為蝕斑法，但蝕斑法耗時(shí)長,本系統(tǒng)檢測的凍干帶狀皰疹疫苗中Ag含魚，與蝕斑法檢測的疫苗病毒滴度具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.96,表明本法可以輔助用于病毒滴度估算，可以縮短檢測時(shí)間和加速研究進(jìn)程。此外，本試劑以中和單抗為基礎(chǔ)構(gòu)建的，若檢測的抗原活性水平與免疫后產(chǎn)生的中和抗體水平之間具有相關(guān)性，則可用于疫苗免疫效力的預(yù)估，但此推

33、測有待于疫苗臨床后驗(yàn)證。5參考文獻(xiàn)ANNMARVIN.Varicella-zo»tcrvimsJ.JClinMicrobiolRev,1996；3：361-38l.1 GnannJWJr,WhitleyRJ.HerpeszosterJ.NEnglJMrd,2002；347:340-346.2 DavidWW,JudithB.HerpeszosterJ.JClinRev,2007；334:1211-1215.3 AndreaI）9JohnA.G.SaulKetal.Vaccinationsforadultsolid-organtransplantrecipients：currentrecommendationsandprotocolsJJ.JClinMicrobiolRev,2OO3；3：357-364.4 YusukeH.TokuhiroC,TakumaIetal.PreparationofmousemonoclonalantibodyforRBICC1anditsclinicalapplicationJ.PiosOn