普通變形桿菌TWN3株DNA疫苗的初步研究.docx

1、普通變形桿菌TWN3株DNA疫苗的初步研究王娟械，辜文博】，馮軍】，顧繼銳械，吳江2,徐恒】，2(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川成都610064；2.通威股份有限公司，四川成都610081)摘要：普通變形桿菌TWN3分離自死亡大口船菌的DNA文庫已構(gòu)建成功.通過免疫印跡法從文庫中篩選到TWN3抗原片段PV<,將其克隆到真核表達載體pcDNA,上.構(gòu)建DNA疫苗pcDNA3-PV4.肌肉注射免疫小版進行真核表達檢測。免疫組織化學(xué)分析DNA疫苗在接種局部肌肉中抗原的表達.ELISA檢測小鼠血清中的IgG及IFN-y含址。免疫pcDNA3-PV4疫苗的小鼠肌

2、肉細胞中檢測到PV,相關(guān)抗原蛋白的表達.外周血中的IgG及IFN-y顯著高于免疫pcDNA,組.對小鼠進行免疫保護試驗.免疫DNA疫苗的小鼠對TWN3菌有免疫力.初步顯示構(gòu)建的DNA疫苗有一定效果.試驗結(jié)果為魚類水體試驗提供了參考依據(jù)，同時隨著TWN3株函DNA疫苗研究的深入，將對該疫苗最終大規(guī)模用于魚類提供理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：普通變形桿菌TWN3株；DNA文庫；PV,»DNA疫苗中圖分類號：Q78文獻標識碼：A文章編號：1003-1111(2009)04-0205-04水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大規(guī)模高密度養(yǎng)殖造成水質(zhì)惡化，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害日趨嚴重。使用化學(xué)合成或抗生素類藥防治疾病影

3、響水產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性并引起環(huán)境污染。采用減毒或滅活疫苗，重組亞單位疫苗及合成多肽疫苗進行防治雖然在生產(chǎn)實踐中得到較大程度應(yīng)用，然而在免疫方式、保護力等方面存在一定問題。核酸疫苗具抗原性強、保護時間長、制備容易等優(yōu)點而成為研究熱點。普通變形桿菌(P"£e"sw"/g"is)TWN3由實驗室從四川繪科魚類養(yǎng)殖場死亡的大口幼(Si-lurusmeridionalis)成魚組織中分離得到，對小鼠有較強的致病性，病癥與魚類一致。這株菌的DNA文庫已由實驗室建立，文章構(gòu)建了TWN3的DNA疫苗并對疫苗進行了初步研究。1材料與方法1.1主要試劑EcoRI/

4、1；DNAligase、小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)、異丙基-伊D硫代半乳糖(IPTG)；HRP標記羊抗兔IgG購自北京博奧公司；HRP標記羊抗鼠IgG購自中杉公司；普通變形菌TWN-3株菌的多克隆抗體經(jīng)過免疫新西蘭雄性兔獲得，存于超低溫冰箱待用；4-氯1紊酚為Sigma公司；硝酸纖維素膜為Pharmacia公司產(chǎn)品；氨苯青需素、牛血清白蛋白(BSA)、Tris為Amresco公司產(chǎn)品；酵母粉與胰蛋白豚為OXIDE公司產(chǎn)品；IFN-y檢測試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司；免疫組化所需試劑II/III抗:SP9710試劑盒及DAB-0031顯色試劑盒購于福建邁新生物技術(shù)有限公司；其他相關(guān)試劑為

5、國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.2菌株、質(zhì)粒及試驗動物大腸桿菌(Escherichiaco4)JM109,質(zhì)粒pUC18,pcDNA,為本實驗室保存，TWN3為實驗室分離鑒定。普通變形桿菌TWN3株DNA文庫由本實驗室保存。試驗用昆明小鼠(Musmusculus)購自成都中醫(yī)藥研究所，質(zhì)量為1520g,雄性。1.3試驗方法1.3.1免疫印跡篩選普通變形桿菌TWN3株抗原相關(guān)基因或片斷從已構(gòu)建的普通變形桿菌TWN3株DNA文庫中，參照文獻4的方法先制備一個主板，待主板菌落長至34mm后，用已滅菌的硝酸纖維素膜復(fù)印主板，然后將該膜轉(zhuǎn)移到含有異丙基仲D-硫代半乳糖昔(IPTG)(終濃度1.0mmol/L)、氨苯

6、青霉索(終質(zhì)JR濃度100Fg/ml)的LB平板中于37C培養(yǎng)4h,誘導(dǎo)插入片斷表達外源蛋白質(zhì)。再將膜上的菌落于氯仿蒸汽中暴露15min,然后將膜放入裂解液裂解16h。裂解完成后，依次加入兔血清與偶連HRP的羊抗兔IgG進行雜交，然后顯色定影得到陽性克隆。挑取主板上相應(yīng)位置的陽性克隆接種于氨羊青霉素(100g/ml)的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并用EcoRI完全酶切進行進一步驗證，得到普通變形桿菌TWN3株的保護性抗原基因片段PV”回收片段，同時送測序。1.3.2DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定收稿H期：2008-06-11.修回日期：2008-07-29.基金項目；四川省科技攻關(guān)項目(O5NG

7、OO2002-4),通威股份科技發(fā)展項目.作者簡介，王始(1982-),女.碩士研究生，研究方向：微生物生物技術(shù)»E-maihstoncwjl982,通訊作者:徐恒(1964-),男，教授，研究方向：微牛.物1E-mail:xubcng®email,.pcDNA3能在真核哺乳動物細胞中高水平表達外源基因，具有多個限制性酶切位點。EcoRI完全酶PCDNA3,去稚酸化，將PV插入到PcDNA3的相應(yīng)位點，經(jīng)酶切及測序驗證，證實DNA疫苗構(gòu)建成功。小鼠試驗驗證DNA疫苗真核表達情況。1.3.3疫苗的大量制備將含質(zhì)粒pcDNA3及pcDNA-PV,質(zhì)粒的大腸桿菌分別接種于500m

8、lLB培養(yǎng)基中，搖菌過程中加入終質(zhì)量濃度為100Mg/ml的氯霉素，大批最抽提方法參照文獻4。紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，用0.85%生理鹽水調(diào)整至終質(zhì)量濃度500昭/ml。1.3.4DNA疫苗免疫小鼠為了驗證DNA疫苗的真核表達情況，選用小鼠進行動物試驗。小鼠分為2組，免疫pcDNA3的對照組和免疫pcDNA3-PV4的試驗組，每組9只小鼠。免疫量為100'g/只，免疫時間為第0周、第2周、第4周，每次免疫的部位相同。免疫后第10<1、第20d、第30d每組分別取3只小鼠，眼部采血，分離血清測抗體及IFN-y含量。1.3.5免疫組織化學(xué)法檢測小鼠肌肉組織目的抗原的表達取小鼠大腿

9、注射位置的肌肉組織，投入10%中性福爾馬林溶液中，固定12h；參照文獻5制片及染色，顯微鏡觀察并拍照。出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)判讀為陽性表達。1.3.6免疫小鼠血清中IgG的測定按照文獻5中的方法制備PV,抗原，調(diào)整抗原的質(zhì)量濃度為0.5/zg/，按100/孔加入96孔板內(nèi)，4C過夜，洗滌封閉后按100小/孔加入1:100稀釋的待檢血清，溫育1.5h,PBS洗3次，按100/孔加入稀釋度為1:10000的HRP標記的羊抗鼠IgG,37C溫育1h,PBS洗3次后顯色，終止反應(yīng)后用BIO-RAD860酶標儀測OD響的A值。1.3.7外周血清中IFN-y的檢測免疫小鼠30d后取兩組小鼠血測定外周血清中IFN-

10、y的水平，檢測試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司。1.3.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPASS13.0進行單因素方差檢驗DNA疫苗免疫組與對照組之間的差異，P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。L3.9小鼠免疫保護試驗取免疫30d后的試驗組及對照組小鼠各3只，將經(jīng)復(fù)壯的TWN3菌懸液稀釋配制成8.1X107cfu/ml,分別腹腔注射小鼠，每只0.3ml,觀察1周記錄小鼠死亡情況，對死亡小鼠進行解剖觀察及病原菌分離。2結(jié)果2.1普通變形桿菌TWN3株保護性抗原基因片段PV,的篩選普通變形桿菌TWN3株總DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切醵EcoRI消化，克隆到經(jīng)EcoRI酶消化CIAP去磷酸化的PUC18載體，轉(zhuǎn)

11、化感受態(tài)細胞大腸桿菌BL21,選擇具有外源DNA片段的克隆，當(dāng)克隆數(shù)達到3.6XIO'個重組子時，DNA文庫構(gòu)建成功。利用免疫印跡篩抗原基因，選取在硝酸纖維膜上經(jīng)多次夏篩始終顯示出深紫色斑的克?。▓D1）,得到陽性克隆子。挑取對應(yīng)菌落提質(zhì)粒酶切驗證（圖2）,插入片段為PV,。序列測定如下（775bp）。1GAATTCAGCmTrTAArArAAmATrCTrGCrGTGATrArTAAATTrCIA53TrTTTACCAAAATGGTACTTATTAAATTACTGAGATrTAAGCAAAITTAKrC105ATTACCATACCAACCAGTAATAATATAATTCCACCCCAT

12、CCTTTATXrCAATC158AAGTGGTGCATnGGGTrAATGTCGTTGGCTGGTATTTAATGAGAACGTOA209CAAGCGCCTCTCACGTTGCTAAGTTGGATTGCGACGTCTAArCTGAGCAA260CGAATGCACAAGATTTAGAGTACCAGAGCCCTGTGATGCTGTCACGGGGC310TTTGTTACATCTGGAGCTTGGTAAACCTCATAAArTCAATTCXjCAACGCTCG362CCGCAAGGCGTGAACTTGnTCACGTCGAGGAAGCGGAAnTCTCGAAAG412CCTTATACTGTCTCCGT

13、rCACACXrGArCGGAGGGTGTeTCTATGTCTCAAr464TAnTCGnTGGCATCGCCAGAAGArTACGAArACATCGAAGAArrAAAnT516ATGGGAATTGTCATTTGArAAGCGACCGGTrCAAGGGGTTCGrrGTGAAGA567TCCGGTGArCGGGGCAGAAAAATArAArCAAGGGCGTGAAAAATTTAAGGCfilSGTTAGCGTCACGGCATAAAAAACACTGGAAACCGAACGGATTGACCTTTTC669GGAGTTGATCCGCTG<jGCAArAGAATGCGGAACrCCAGAACAA

14、rGTCAGCTTZOTGTTTTAGCGTTATACCATTGCACAAACGArGArGATTXrCACGCGATGGGA772ATTCAB圖1陽性克Pt免疫印避A：陽性對照(TWN3菌體蛋白)；B：陰性對照(BL21/pUC18)»4,陽性克(pUC18-PV4).bp1500010000750050002500bp15000100007500500025001000250圖2陽性克隆pUC18-PV,EcoRI切結(jié)果1.MarkerDI»2.pUC】8斡切結(jié)果3.pUC18-PV,酶切結(jié)果.2.2DNA疫苗的構(gòu)建和鑒定pcDMA、載體與PV,的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM

15、109,挑取轉(zhuǎn)化菌落提取質(zhì)粒,EcoRI單酶切驗證，有插入片段，大小與PV,致，得到重組質(zhì)粒pcDNA3-PV<(圖3),同時測序結(jié)果與2.1中的結(jié)果-致，DNA疫苗構(gòu)建成功。DNA疫苗的真核表達情況通過小鼠試驗獲得。2.3疫苗的大量制備及免疫動物DNA疫苗和空載體的OD2g/OD28。皿約為1.8,質(zhì)量濃度為1.0mg/ml,利用0.85%NaCl調(diào)整終質(zhì)量濃度至500網(wǎng)/ml,每只小鼠免疫100網(wǎng),分別在兩側(cè)大腿肌肉上各免疫50Mge免疫后小鼠未出現(xiàn)異常現(xiàn)象，正常進食。123圖3疫苗pcDNA3-PVEcoRI醺切結(jié)果1.MarkerDL15000.2.pcDNAi的切結(jié)果;3.pc

16、DNA3-PV4W切結(jié)果.見，免疫peDNA-PV.的試驗組血清中的含最較pcDNA3對照組高，利用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析,pcDNA3-PV4組血清中的IFN-y與pcDNA3組存在顯著差異(PV0.05)。2.4免疫組化結(jié)果試驗中的兔血清為TWN3菌體蛋白的抗血清，由實驗室制備保存于冰箱一80C備用，稀釋倍數(shù)為1:200,結(jié)果見圖4、圖5,免疫pcDNA3-PV,的試驗組肌漿中表達的抗原呈現(xiàn)棕黃色至黃色，免疫pcDNA3的對照組細胞核為藍色，未檢測到抗原的產(chǎn)生。圖4免«peDNA：,的對照組小鼠肌細胞中無PV,抗原產(chǎn)生(200X)圖5免疫peDNAj-PVS

17、苗的小鼠肌細胞胞漿中有PV,抗原產(chǎn)生(箭頭所指處X200X)2.5免疫小鼠血清中特異性抗體IgG的測定用于ELISA檢測的小鼠血清稀釋倍數(shù)1:100,檢測結(jié)果見圖6,利用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析，試驗組與對照組存在顯著性差異(P<o.05).2.6外周血中IFN-y的檢測外周血中IFN-y的檢測結(jié)果見表1。由表1可衰1免疫30d后2組外周血清中IFN-y的含(pgmL)(n=3)免疫時間/dpcDNAj-PV4fflpcDNA3ffl3018.16±0.5288.215±0.3512.7小鼠免疫保護試驗免疫DNA疫苗的小鼠1只死亡，解剖未發(fā)現(xiàn)與大口

18、幼相似的癥狀。免疫空載體的對照組3只小鼠全部死亡，對剛死亡的小鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)，小腸脹氣且大多化膿性壞死，大腸和胃有出血現(xiàn)象，從死亡小鼠的腸、胃中分離到TWN3菌株。初步顯示免疫DNA疫苗的小鼠獲得對TWN3菌的免疫保護力。3討論3.1構(gòu)建DNA文庫篩選病原菌相關(guān)抗原基因或片斷核酸疫苗(Nucleicacidvaccine)是將含有編碼某種抗原蛋白的外源基因或片斷克隆到真核表達質(zhì)粒載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動物體內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液免液和細胞免疫應(yīng)答，獲得對致病菌的免疫能力。普通變形桿菌TWN3株由實驗室首次從大口幼中分離得到，尚未見明確致病因子

19、報道，試驗采用構(gòu)建普通變形桿菌TWN3株DNA文庫的方法，利用免疫印跡篩選廣泛篩選相關(guān)抗原相基因或片斷。從免疫印跡結(jié)果可以看見篩選到的PV,可以表達蛋白質(zhì)，對該序列進行簡單的開放閱讀框分析，片段中有一約300bp的開放閱讀椎(ORF),同時進行序列比對未發(fā)現(xiàn)同源性蛋白，提示PV,可能編碼新的蛋白。因此試驗直接利用PV,進行DNA疫苗構(gòu)建。3.2利用小鼠做動物試驗動物試驗首先采用小鼠主要原因如下：檢測DNA疫苗在小鼠中的真核表達情況，同時初步判斷DNA疫苗的免疫效果；普通變形桿菌TWN3株對小鼠有較強的致病性，病癥與魚類一致；魚類與哺乳動物具有相似的免疫作用因子，IrG、IFN-yJL-2w等免

20、疫因子參與免疫應(yīng)答；小鼠作為動物模型研究免疫應(yīng)答十分成熟，在魚類尚無類似用于研究免疫反應(yīng)的模式動物。若DNA疫苗表達強且對小鼠有一定免疫效果，則進行魚體試驗，若無效果，則重新構(gòu)建DNA疫苗。這些結(jié)果將為魚體試驗提供參考依據(jù)，并為魚用核酸疫苗的研究羹定基礎(chǔ)。3.3DNA疫苗實際應(yīng)用中需解決的問題當(dāng)前規(guī)?；\用于魚類養(yǎng)殖的DNA疫苗很少，據(jù)Lorenzen等口°】報道，2005年有2種魚用DNA疫苗獲得許可證。魚用疫苗難以規(guī)?；脑蛑饕怯捎隰~類個體小，種群數(shù)量大，DNA疫苗的注射法或基因槍法在操作上存在一定困難。同時魚類主要病原表面抗原研究基礎(chǔ)薄弱。而戴賢君等利用減毒沙門氏菌(Sal

21、monellatyphiniuri-作為疫苗載體，采用口服形式免疫草魚(Cteno-pharyngodonidellus)9取得了一定的效果，但尚未形成產(chǎn)業(yè)化。今后的研究方向是對DNA疫苗的載體進行研究，使DNA疫苗能夠以口服的形式接種，方便DNA疫苗的使用；改造重組疫苗，如構(gòu)建復(fù)合疫苗，或加上強啟動子等方法來增強疫苗的表達；改進免疫途徑來增強疫苗效果；DNA疫苗的安全性問題等。這些問題的解決將給魚用疫苗帶來巨大的發(fā)展空間。參考文獻：1 郝貴杰，沈錦玉.潘曉義.核酸疫苗的研究進展及其在魚類免疫中的應(yīng)用J.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報.2007,22(2) :142-148.2 曹海軍，李永文.雷雨.等.大

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