外源基因在大腸桿菌中表達(dá)基本原理與微量移液器使用

1、外源基因在大腸桿菌中表達(dá)基本原理與微量移液器使用第一課第一課第一部分第一部分 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理第二部分第二部分微量移液器的使用微量移液器的使用臧 宇 輝A432Tel: 89681321（o)Email: 第一部分 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)原理研究者經(jīng)常需要獲得大量的蛋白質(zhì)以滿足各類研究的需要。比如：1，用作抗原來刺激抗體的產(chǎn)生：可以是蛋白質(zhì)或其部分片斷。2，用于生化和細(xì)胞生物學(xué)研究：這種情況下保持蛋白質(zhì)原有的功能（如高比活性酶、結(jié)合蛋白或生長因子）就顯得十分重要。3，用于結(jié)構(gòu)研究：要求得到的蛋白質(zhì)有天然的結(jié)構(gòu)。因?yàn)閹缀醪?/p>

2、可能知道一種尚未知道其結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)經(jīng)變性后是否被精確地重折疊，蛋白質(zhì)必須以可溶性形式產(chǎn)生。獲得目的蛋白的方法：從天然產(chǎn)物中純化利用基因工程方法表達(dá)基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)的概念： 是指為了獲取大量的目標(biāo)蛋白而進(jìn)行的有目的的蛋白質(zhì)合成。1.方法是將編碼所需蛋白質(zhì)的基因插入質(zhì)?；蚱渌d體，然后再將載體導(dǎo)入活細(xì)胞。利用宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系產(chǎn)生目的蛋白。 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of mo

3、lecular geneticsWerner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith Switzerland Biozentrum der Universitt Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA 1929 - 1928 - 19991931 - 抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gen

4、e,such as Ampicillin resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)gene, Kanamycine resistance gene)啟始復(fù)制子（啟始復(fù)制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(MSC, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

5、：質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：重組重組DNADNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程轉(zhuǎn)化細(xì)菌過程示意圖示意圖各種表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)：指大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞系統(tǒng)包括：哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞等表達(dá)體系。各種表達(dá)體系各有優(yōu)缺點(diǎn)。舉例說明如下：原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)載體：包括噬菌體載體和質(zhì)粒載體，通過感染或轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生目的蛋白。原核細(xì)胞系統(tǒng)主要是利用大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白。優(yōu)點(diǎn)：該系統(tǒng)操作簡便、周期短、收益大、及表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定。1.局限：表達(dá)基因的相對分子質(zhì)量有限，且不能對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行一些翻譯后加工 、修飾。各種表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將外源基因插入昆蟲桿狀病毒，通過重組病毒感染昆蟲細(xì)胞而產(chǎn)生目的蛋白。優(yōu)

6、點(diǎn)：表達(dá)效率高，昆蟲細(xì)胞對蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與哺乳動物細(xì)胞接近。2.缺點(diǎn)：操作比較繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)利用病毒、質(zhì)粒建立重組有外源基因的表達(dá)載體，通過感染或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)目的蛋白。優(yōu)勢：能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的哺乳動物蛋白質(zhì)分子。3.缺點(diǎn)：表達(dá)效率通常不高。利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌里表達(dá)外源基因一般是始于將基因插入表達(dá)載體（通常為質(zhì)粒）。表達(dá)載體應(yīng)具有的幾種元件是：選擇標(biāo)志的編碼序列，它可提供篩選以確定載體是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄

7、調(diào)控序列：可調(diào)控的強(qiáng)啟動子（如lac, tr或tac啟動子），經(jīng)誘導(dǎo)后可產(chǎn)生大量的目的基因mRNA；轉(zhuǎn)錄終止子。翻譯調(diào)控序列：一個(gè)位置合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（和起始密碼子ATG之間有合適的距離）。I.一個(gè)由多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)構(gòu)成的克隆位點(diǎn)，便于將外源基因以正確的方向插入載體中。利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體（質(zhì)粒）制備感受態(tài)大腸桿菌將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA定量利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體擴(kuò)增目的基因PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段

8、。RT-PCR方法：從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。純化PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物定量利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程構(gòu)建表達(dá)載體將表達(dá)質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶（與目的基因PCR引物相同的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行酶切回收質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物（載體大片段）質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物定量PCR產(chǎn)物酶切回收PCR產(chǎn)物的酶切片段PCR產(chǎn)物的酶切片段定量利用連接酶連接質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物及外源基因酶切片段利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程重組表達(dá)載體的鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌抽提重組質(zhì)粒并定量通過酶切初步鑒定重組質(zhì)粒測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒（檢查目的基因

9、插入方向、序列及閱讀框架的正確性）利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)制備宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)帶有重組表達(dá)載體的大腸桿菌誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)利用大腸桿菌進(jìn)行外源基因表達(dá)的過程鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物抗體鑒定生物活性鑒定序列測定第二部分 微量移液器的使用一個(gè)完整的移液過程包括：容量設(shè)定安裝移液頭預(yù)洗移液頭吸液排液卸去移液頭每一個(gè)步驟都要遵循操作規(guī)范。 容量設(shè)定從大值調(diào)整到小值時(shí)，剛好即可。從小值調(diào)整到大值時(shí)，需要調(diào)超過三分之一圈后再返回，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補(bǔ)。不要將按鈕旋出量程，這將導(dǎo)致移液器損壞。吸液頭安裝正確的安裝方法是

10、：把白套筒頂端插入吸液頭，在輕輕用力下壓的同時(shí)，把移液器按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)180度。2. 切記用力不能過猛，更不能采取剁吸液頭的方法來進(jìn)行安裝，那樣做會對移液器造成不必要的損傷。預(yù)洗吸液頭安裝了新的吸液頭或增大了容量值以后，應(yīng)把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩到三次。這樣做是為了讓吸液頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度，使移液過程具有重現(xiàn)性。其次，在吸取有機(jī)溶劑或高揮發(fā)液體時(shí)，揮發(fā)性氣體會在白套筒室內(nèi)形成負(fù)壓，從而產(chǎn)生漏液的情況，這時(shí)就需要我們預(yù)洗四到六次，讓白套筒室內(nèi)的氣體達(dá)到飽和，負(fù)壓就會自動消失。吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過深

11、，以免液壓對吸液的精確度造成影響。同時(shí)可以避免在吸取粘稠液體時(shí)在吸液頭表面粘上液體影響吸取精度。4.松開移液器排放按鈕要平穩(wěn)，切記不能過快，以免導(dǎo)致液體吸入移液器內(nèi)部。排液5. 排液時(shí)，吸液頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略作停頓以后，再按至第二停點(diǎn)，這樣做可以確保吸液頭內(nèi)無殘留液體。卸掉吸液頭一般用力下按吸液頭推出器即可卸掉吸液頭。如吸液頭安裝過緊，則可用手卸除。6. 將吸液頭丟棄到合適的廢物收集器中。 反向移液法在轉(zhuǎn)移高粘度液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量液體時(shí)，很容易導(dǎo)致體積誤差較大。為了提高移液準(zhǔn)確性，建議采取反向移液法。按下按鈕至第二停點(diǎn)，將吸液嘴沒入液面下，輕緩松開按鈕回原點(diǎn)。將吸液頭在容器壁上?？恳幌拢匀コ嘤嘁后w。將吸液頭緊貼容器壁，輕按按鈕至第一停點(diǎn)，排出液體。 繼續(xù)按住按鈕，將留在吸液嘴中未被轉(zhuǎn)移的多余液體返回原來容器或隨吸液頭丟棄。常見的錯(cuò)誤操作采取剁吸液頭的方法來進(jìn)行安裝吸液頭。直接按到第二停點(diǎn)吸液。吸液時(shí)，移液器本身傾斜，導(dǎo)致移液不準(zhǔn)確。吸液或排液時(shí)速度太快。排液時(shí)未按到第二停點(diǎn)，吸液頭中有殘液。平放帶有殘余液體吸液頭的移液器(應(yīng)將移液器掛在移液器架上)。用大量程的移液器移取小體積樣品(應(yīng)該選擇合適量程范圍的移液器)。使用丙酮或強(qiáng)腐蝕性的液體清洗移液器。不經(jīng)常檢查移液器工作狀態(tài)。檢查移液器工作狀態(tài)測漏吸取滿量程的純凈水，將