丹酚酸B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

1、丹酚酸B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究         08-12-23 11:12:00     作者：王曉斌    編輯：studa20【摘要】  目的：研究丹酚酸B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）氧化損傷的保護(hù)作用,并探討其對(duì)HUVECs CD54表達(dá)和中性粒細(xì)胞黏附率的影響。方法:以H2O2為損傷劑，觀察丹酚酸B對(duì)HUVECs培養(yǎng)上清中LDH、NO、MDA含量的影響,并利用免疫組化方法和顯微計(jì)數(shù)法觀察該藥對(duì)H

2、2O2存在下CD54表達(dá)和中性粒細(xì)胞黏附率的影響。結(jié)果:丹酚酸B可劑量依賴性地減少H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞LDH外漏和MDA生成,并提高NO釋放,還能有效抑制H2O2存在下CD54表達(dá)和增加中性粒細(xì)胞黏附率。結(jié)論:丹酚酸B具有減輕H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞的氧化性損傷，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)胞黏附分子表達(dá)和抑制中性粒細(xì)胞黏附的作用，這一作用可能是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  丹酚酸B 內(nèi)皮細(xì)胞 CD54 中性粒細(xì)胞    丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖。丹參歸心、肝經(jīng)

3、,藥性微寒,味苦、無(wú)毒,具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。近年研究顯示，丹參有廣泛的生物活性，其治療心血管系統(tǒng)疾病的作用尤其受到關(guān)注，并已有相關(guān)藥物在臨床使用14。目前已有研究表明,其水溶性有效成分為治療心血管疾病的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而丹酚酸B是其中較為重要的成分之一。目前關(guān)于丹酚酸B的研究主要集中于心肌缺血/再灌注損傷和缺氧/復(fù)氧損傷，而關(guān)于丹酚酸B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于血管內(nèi)皮細(xì)胞所處的特殊位置（血液與間質(zhì)組織間的一層半透性的屏障）及其損傷對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的重要影響，我們研究了丹酚酸B對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化性損傷的影響，以期為更全面了解丹酚酸B的藥理作用提供相關(guān)

4、依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  藥品、試劑和儀器    丹參注射液，生藥1.5  g·ml-1，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)0405202。肝素鈉注射液，常州生物千紅制藥有限公司，批號(hào)030212。RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco產(chǎn)品。新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)041030。胰蛋白酶（1250），Amresco分裝。3%雙氧水，南京興藍(lán)箭科技公司，批號(hào)200309011。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批

5、號(hào)20050225。一氧化氮（NO）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20050112。丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20050203。Rabbit Anti CD54(ICAM1)，0.1 ml(200 g·ml-1)，武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。Percoll，100 ml(1.131 g·ml-1),北京夏斯生物有限公司，批號(hào)301944。Beckman冷凍臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司。萊卡顯微工作站，德國(guó)萊卡公司。精密移液器，吉爾

6、森公司。Forma細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Forma公司。全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠。24孔培養(yǎng)板，Costa公司。    12  藥物對(duì)H2O2所致HUVECs氧化損傷的影響    121  HUVECs的培養(yǎng)及氧化損傷模型的建立5  HUVECs按常規(guī)方法復(fù)蘇后接種于40 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，加入0.25%胰蛋白酶37 消化23 min，用新生牛血清終止消化。將細(xì)

7、胞懸液移入離心管，1 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108 L-1的細(xì)胞懸液，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層融合后，棄去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長(zhǎng)，即可用于試驗(yàn)。接種于24孔板的HUVECs同步化生長(zhǎng)后，加入含有終濃度為200 mol·L-1 H2O2的無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，作用24 h。    122  實(shí)驗(yàn)分組  （1)正常對(duì)照組：無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液；（2）模型組

8、：無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液加200 mol·L-1  H2O2作用24 h；（3）丹參注射液組：加入含有丹參注射液終質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（4）丹酚酸B低劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-6 g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（5）丹酚酸B中劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-5 g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有2

9、00 mol·L-1H2O2的培養(yǎng)液作用24 h；（6）丹酚酸B高劑量組：加入含有丹酚酸B終質(zhì)量濃度為1×10-4g·L-1的培養(yǎng)液預(yù)孵1 h，然后換成含有200 mol·L-1 H2O2的培養(yǎng)液作用24 h。    123  細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及生化指標(biāo)測(cè)定  各組HUVECs經(jīng)H2O2處理24 h后，于相差倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化，并檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH、NO、MDA含量。    13  HUVECs CD54表達(dá)的測(cè)定方法    將

10、HUVECs按1×10-4ml-1的密度接種于預(yù)先鋪有玻片（5 mm×5 mm）直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中4塊玻片。37、95% O2、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后吸去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使其同步化生長(zhǎng)，即可用于實(shí)驗(yàn)。    將長(zhǎng)滿細(xì)胞的涂片從培養(yǎng)皿中取出，置于冰丙酮（100%）中固定10 min，晾干。將固定好的玻片用502膠固定于載玻片上，放入4冰箱中備用。取出4冰箱中的載玻片，用PBS潤(rùn)洗1 min，晾干。30% H2O2  1份+純甲醇50份混合，將載玻片置于其中浸泡30

11、 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水潤(rùn)洗3次，晾干。滴加5% BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。滴加Rabbit Anti CD54抗體，稀釋度為1100，4過(guò)夜,PBS潤(rùn)洗3次，每次2 min。滴加生物素化山羊抗兔IgG，濕盒中37 20 min，PBS潤(rùn)洗3次，每次2 min。加試劑SABC，37 20 min，PBS潤(rùn)洗4次，每次5 min。使用DAB試劑盒顯色，取1 ml蒸餾水加試劑A、B、C各1滴，混勻后加至載玻片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間530 min，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。    免疫組化染色陰性對(duì)照：用PBS代替Rabbit Anti CD54抗體4過(guò)夜，其余步驟同上。    每張切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)40×40下，隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算平均單個(gè)視野CD54陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。    14  HUVECs與嗜中性多形核白細(xì)胞（PMN）黏附率