不同劑量的重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人血管抑素對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響

1、不同劑量的重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人血管抑素對糖尿病腎病大鼠腎功能的影響    【摘要】  目的 探討不同劑量的重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)對糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎功能的影響。方法 60只清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)抽取10只作為正常對照組(NC組)，其余造模為糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)60 mg/kg，72 h后尾靜

2、脈測血糖大于16.7 mmol/L記為造模成功，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，把糖尿病大鼠隨機(jī)分為DN組(n=10)，rAAV-0組(n=10), AS1組(n=10, 1×1012 VG/kg)，AS2組(n=10, 2×1012 VG/kg)，AS3組(n=10, 4×1012 VG/kg)。AS1組、AS2組和AS3組3組大鼠尾靜脈注射rAAV-AS, NC組和DN組分別注射同等劑量的生理鹽水，rAAV-0組注射同等劑量rAAV-0空載體;從第2周起，整個實驗過程共持續(xù)8周。8周后檢測各組大鼠的體重(body weight, BW)、腎重(kidney weight,

3、KW)，計算腎指數(shù)(kidney index, KI)，檢測血糖(blood glucose, BG)、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c, HbA1c)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿微量白蛋白(miscroalbunminuria, MAU)。結(jié)果 與NC組相比，DN、rAAV-0、AS1組的KI、MAU、BUN、SCr、BG、HbA1c明顯增高(P<0.05);與DN組相比，AS2組和AS3組KI、MAU、BUN、SCr明顯降低(P<0.05);與rAAV-0組相比，AS2組和AS3

4、組KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05);與AS1組相比，AS2組和AS3組KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05)。結(jié)論 中等劑量和大劑量 rAAV-AS對DN大鼠腎臟具有保護(hù)作用，且不依賴血糖降低而起作用。 【關(guān)鍵詞】  糖尿病腎病;腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的血管抑素;基因治療Abstract:Objective To investigate the effect of different doses of recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene (rAAV-AS

5、) on the renal function in rats with diabetic nephropathy. Methods 10 out of 60 male SD rats of clean grade were randomly allotted as the normal control group, while the others were used to establish models of diabetic rats. Streptozotocin (STZ) 60 mg/kg was intraperitoneally injected in rats at the

6、 end of 12 h of fasting to induce diabetic model. 72 h later, the blood glucose level of caudal vein was above 16.7 mmol/L, and the diabetic model was marked as successful. After a week of adaptation, diabetic rats were randomized into 5 groups (n=10): group DN, group rAAV-0, group AS1 (1×1012

7、VG/kg), group AS2 (2×1012 VG/kg), group AS3 (4×1012 VG/kg). Different doses of rAAV-AS were injected into groups AS1, AS2 and AS3 from the caudal vein, and the corresponding doses of normal saline were injected in group NC and corresponding doses of rAAV-0 idler injected in group DN. At th

8、e end of the 8th weeks, their body weight (BW) and kidney weight (KW) were measured to calculate kidney index (KI). The blood glucose (BG), glycosylated hemoglobin (HbA1c), miscroalbunminuria (MAU), blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were determined.Results Compared with group NC,

9、the levels of KI, BG, HbA1c, MAU, BUN and SCr increased significantly in DN, rAAV-0 and AS1 groups (P<0.05). Compared with group DN, the levels of KI, MAU, BUN and SCr significantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05). Compared with group rAAV-0, the levels of KI, MAU, BUN and SCr signifi

10、cantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05). Compared with group AS1, the levels of KI, MAU, BUN and SCr significantly decreased in groups AS2 and AS3 (P<0.05).Conclusions rAAV-AS of medium and large doses has protective effect on the kidneys in diabetic rats, independent of the decrease o

11、f blood glucose level.Key words： diabetic nephropathy; recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene; gene therapy糖尿病腎病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一,在1型糖尿病中發(fā)病率約33%44%,在2型糖尿病中約15%60%,并是造成終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因之一。但目前臨床應(yīng)用的藥物尚不能有效地逆轉(zhuǎn)DN的進(jìn)程，因此找到一種可靠的方法

12、預(yù)防和治療糖尿病腎病迫在眉睫。血管抑素(angiostatin, AS)具有抑制血管生成、抗纖維化等生物學(xué)學(xué)活性，研究表明AS能降低DN的蛋白尿1，但是由于注射AS在體內(nèi)活性不穩(wěn)定、表達(dá)效率差，因此我們使用不同劑量重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)治療DN大鼠，觀察其對DN大鼠尿微量蛋白和腎功能的影響，以明確不同劑量rAAV-AS對早期DN大鼠的作用。1 材料和方法1.1 實驗動物和試劑 雄性SD大鼠，體重160180 g,8周齡，由徐州醫(yī)學(xué)

13、院實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司,rAAV-AS由本元正陽公司構(gòu)建。1.2 實驗分組和模型制備 60只清潔級雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料1周后，從中隨機(jī)抽取10只作為正常對照組(NC組)，其余造模為糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射STZ 60 mg/kg，NC組僅注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈測血糖大于16.7 mmol/L記為造模成功，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，把糖尿病大鼠隨機(jī)分為DN組(n=10)，腺相關(guān)病毒空載體組(rAAV-0，n=10), rAAV-AS低劑量治療組(AS1組, n=10, 1×1012 VG/kg)， rAAV

14、-AS中劑量治療組(AS2組, n=10, 2×1012 VG/kg)，rAAV-AS高劑量治療組(AS3組, n=10, 4×1012 VG/kg)。rAAV-AS各劑量組大鼠尾靜脈注射rAAV-AS, NC組和DN組分別注射同等劑量的生理鹽水，rAAV-0組注射同等劑量rAAV-0空載體;從第2周起，整個實驗過程共持續(xù)8周。1.3 標(biāo)本收集 各組大鼠于8周末測量體重(BW)，尾靜脈取血測定血糖，用代謝籠收集24 h尿液、離心，保存于-40冰箱中，以待測尿白蛋白。大鼠隔夜空腹，1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg 腹腔注射)麻醉下心臟采血、離心、取上清，-40冰箱保存，以備

15、測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。然后，取大鼠雙腎，除去包膜后測量腎重(KW)，計算腎指數(shù)(KI)，公式：KI=KW(g)/BW(kg)。1.4 生化指標(biāo)檢測 膠體金雙抗體夾心法檢測尿微量白蛋白(MAU)，葡萄糖氧化酶法檢測血糖(BG)，分析法檢測HbA1c，日立7600 型全自動生化分析儀檢測BUN、SCr。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計方差分析法(ANOVA), P<0.05為差異有顯著性。2 結(jié) 果2.1 一般情況 實驗中6只大鼠可能因血糖過高死亡。

16、實驗結(jié)束時共存活大鼠54只，其中NC組10只， DN組8只，rAAV-0組9只， AS1組10只， AS2組8只, AS3組9只。NC組大鼠精神較好，毛發(fā)光澤，體重增加，行動敏捷，食欲好，每天添加1次食物，每周換1次墊料，墊料無異味;DN組大鼠血糖明顯升高并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦等典型“三多一少”的糖尿病表現(xiàn)，精神萎靡，毛色晦暗無光澤，體重減輕，行動遲緩，食欲差，易死亡;rAAV-0組和AS1組與DN組大鼠表現(xiàn)類似;AS2組和AS3組大鼠精神一般，毛發(fā)無明顯晦暗，體重增加，行動可，食欲好，每2天添加1次食物，每周換2次墊料。2.2 各組大鼠KI變化情況 與NC組相比，DN、rAAV-0、A

17、S1組KI明顯增高(P<0.05);與DN組比較，AS2、AS3組KI降低(P<0.05);與rAAV-0組比較，AS2、AS3組KI降低(P<0.05);與AS1組比較，AS2、AS3組KI降低(P<0.05)。見表1。表1 rAAV-AS對各組大鼠KI的影響與NC組比較：*P<0.05;與DN組比較：#P<0.05;與rAAV-0組比較：P<0.05;與AS1組比較：+P<0.052.3 各組大鼠生化指標(biāo)的影響 與NC組比，DN、rAAV-0、AS1、AS2、AS3組BG、HbA1c、MAU、BUN、SCr明顯增高(P<0.05);與D

18、N組相比，AS2、AS3組MAU、BUN、SCr明顯降低(P<0.05);與rAAV-0組相比，AS2、AS3組MAU、BUN、SCr明顯降低(P<0.05);與AS1組相比，AS2、AS3組MAU、BUN、SCr明顯降低(P<0.05)。見表2。表2 rAAV-AS對各組大鼠的生化指標(biāo)的影響與NC組比較：*P<0.05;與DN組比較：#P<0.05;與rAAV-0組比較：P<0.05;與AS1組比較：+P<0.053 討 論DN病理學(xué)特征性改變表現(xiàn)為腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚致系膜區(qū)擴(kuò)張，最后導(dǎo)致腎小球纖維化、硬化2。臨床表現(xiàn)

19、為微量白蛋白尿、腎功能不全等。本實驗結(jié)果顯示，與NC組比，DN、rAAV-0、AS1組KI、BG、HbA1c、MAU、BUN、SCr明顯增高(P<0.05)，說明此模型已出現(xiàn)DN典型改變;與DN組相比，AS2、AS3組KI、MAU、BUN、SCr明顯降低(P<0.05)，治療后DN大鼠MAU、BUN和SCr有明顯改善，提示中劑量和大劑量rAAV-AS對DN大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，并且增加劑量并不能出現(xiàn)更好的效果，而且這種改善不依賴于血糖降低。AS最初是OReilly等3于1994年從Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分離出的能夠特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的因子,是大分子物質(zhì)纖溶酶原

20、的一個片段，目前國內(nèi)外研究AS對DN的作用很少。AS基因注射宿主，轉(zhuǎn)染效率低、安全性差而且費用高昂， AAV是一種無包膜的人單鏈DNA病毒,重組AAV由于其宿主范圍廣，免疫原性低,表達(dá)攜帶基因長久等優(yōu)點而越來越多地被用于基因治療的實驗研究4-5。本實驗使用rAAV-AS注射到DN大鼠體內(nèi)，6周后，大鼠MAU、BUN、SCr明顯降低，提示其對糖尿病大鼠腎臟有保護(hù)作用，可能機(jī)制與血管抑素能明顯阻止腎小球系膜中高糖和 TGF-誘導(dǎo)的 MCP-1、I CAM-1分泌,抑制 DN的炎癥反應(yīng)和血管抑素可能是腎臟中 TGF-1和 VEGF的內(nèi)源性拮抗劑或抑制劑有關(guān)1。綜上所述，中劑量和大劑量rAAV-AS對

21、DN早期起保護(hù)作用，且這種作用并不依賴于血糖水平的降低。rAAV-AS對DN的保護(hù)作用的具體機(jī)制我們將在今后的實驗中繼續(xù)探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Zhang SX, Wang JJ, Lu K, et al. Therapeutic potential of angiostatin in diabetic nephropathy J. J Am Soc Nephrol, 2006, 17(2):475-486.2 Dronavalli S, Duka I, Bakris GL. The pathogenesis of diabetic nephropathy J. Nat Clin Pract Endocrinol Metab