兩種染色方法在細(xì)胞核DNA含量檢測中的應(yīng)用及比較

1、兩種染色方法在細(xì)胞核DNA含量檢測中的應(yīng)用及比較         08-08-23 16:02:00     編輯：studa20           作者：焦紅麗， 冶亞平 夏潮涌    【摘要】  目的 探討改良、快速兩種Feulgen染色方法達(dá)到最佳染色效果的水解時間段，為科研和臨床的應(yīng)用提供方法學(xué)指導(dǎo)。方法 選取5只成年健康雄性S

2、D大鼠的肝組織，制成肝細(xì)胞涂片，分別在室溫和60溫度下水解不同時間，應(yīng)用改良和快速兩種方法染色，TIGER圖像分析儀檢測和分析單個肝細(xì)胞核的DNA含量。結(jié)果 （1） 不同大鼠肝細(xì)胞涂片在同一水解溫度、時間作用下，相同DNA倍體含量肝細(xì)胞的DNA含量大致相同，CV值均小于10%；（2） 二、四、八倍體肝細(xì)胞核的DNA含量比值均接近2或4；（3） 同一大鼠相同水解溫度不同水解時間，同一倍體的肝細(xì)胞核DNA含量存在差異：60水解溫度下，IOD(57 min)>IOD(915 min)>IOD(1 min，20 min)，室溫水解溫度下，IOD(50 min)>IOD(2030 mi

3、n，7090 min)>IOD(51 min，100 min)。結(jié)論 HCL水解肝細(xì)胞涂片時間過長或過短均不能理想的染色，快速法和改良法Feulgen染色達(dá)較佳染色效果的時間段分別為：快速法57 min，改良法2090 min。 【關(guān)鍵詞】  DNA分析； 染色與標(biāo)記方法； Feulgen染色； 肝細(xì)胞涂片    Application and comparison of two kinds of staining methods for    Abstract: Objective  To find out

4、 the suitable hydrolysis time for two staining methods of Feulgen and to provide guidline on research and clinic. Methods  Smears of liver cell suspension were obtained from five healthy rats. All the hepatocytes are, respectively, hydrolyzed in different time at room temperature and 60, and th

5、en stained with modified Feulgen stain and quick one. DNA content and ploid of intact hepatocyte nuclei was analyzed by TIGER cell image analysis system. Results  (1) the nuclear DNA contents are almost identical from same DNA content ploidy of different rats under the same temperature and time

6、 of hydrolysis, and the CV of IOD from three types of DNA content ploidy was less than 10 percent. (2) The IOD ratio among diploid, tetraploid and octaploid was close to 2 and 4. (3) The DNA contents of hepatocyte nuclei from same DNA content ploidy of different rats were distinct under the same tem

7、perature and different hydrolysis time: hydrolysis at 60, IOD(57 min)>IOD(915 min)>IOD(1 min，20 min); hydrolysis at room temperature, IOD(50 min)>IOD(2030 min，7090 min)>IOD(510 min，100 min). Conclusion  nuclei DNA cant be stained better for extra long or short hydrolysis time, the b

8、etter hydrolysis time of quick Feulgen stain and modified one are, respectively, 57 min and 2090 min.    Key words: DNA analysis; staining and labeling methods; feulgen staining; smear    細(xì)胞核的DNA含量測量與倍體分析對判斷腫瘤的良惡性及預(yù)后有重要參考價值14。自1924年Feulgen和Rossenbeck5在組織原位上用Feulgen反應(yīng)顯示細(xì)

9、胞核的DNA以來，F(xiàn)eulgen反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科中的細(xì)胞、組織化學(xué)染色。幾十年來，科研工作者們一直從多個角度探索Feulgen反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件69，以更好地適應(yīng)不同的應(yīng)用要求。目前，臨床和科研中普遍采用改良Feulgen染色法，該方法相比傳統(tǒng)法效果更為穩(wěn)定，為適應(yīng)臨床上快速染色、診斷的要求，金日男等10改進(jìn)了染色的過程，提出了快速Feulgen染色法，從而基本滿足了臨床快速病理診斷的需要。然而，該兩種染色方法在具體應(yīng)用中受到一定的條件限制，同時染色效果也有所差別。本文比較兩種染色方法在不同溫度、不同時間水解從而尋找改良和快速Feulgen染色法的最適鹽酸水解時間，為臨床和

10、科研的應(yīng)用提供參照。    1  材料與方法1.1  制片    正常雄性SD大白鼠五只，水合氯醛麻醉、開腹，生理鹽水經(jīng)門靜脈灌注沖洗肝臟，將其游離并切成約0.5  cm×0.5  cm×0.5  cm的組織塊，放于篩網(wǎng)中研磨，刮取白色較黏稠的肝細(xì)胞懸液，均勻推于另一載玻片上，每只大鼠制片約30張，4%多聚甲醛固定30  min，自然干燥保存。    1.2  快速Feulgen染色   

11、; 5N HCl和Schiffs試劑放入60的恒溫箱中預(yù)熱30  min，每只大鼠取八張涂片，入5N HCl（60）分別水解不同時間（表1）后再放入Schiffs試劑中60恒溫染色10  min，自來水沖洗，乙醇脫水封片。    1.3  改良法Feulgen染色     每只大鼠取九張涂片，入5N HCl（室溫）分別水解不同時間(表1)后入Schiffs試劑中室溫（2328）染色60  min，自來水沖洗，乙醇脫水封片。    1.4  圖像分析儀的校正與肝細(xì)胞核參數(shù)的測量    顯微測微臺尺（最小刻度10  m）標(biāo)定TIGER細(xì)胞圖像分析儀的幾何標(biāo)尺，中國計量科學(xué)院出產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)密度片(DV24,鑒定證書，光字第184041號)標(biāo)定其光密度值；按柯勒照明要求調(diào)整NIKON55i顯微鏡光源，在物鏡(20×NA0.5)與黑白攝像機(jī)之間插入535   nm/35 的帶通濾光片，按TIGER細(xì)胞圖像分析儀測量光密度的要求校正系統(tǒng)基準(zhǔn)，隨機(jī)（涂片中部每間隔一視野攝