春季傳染病病原菌的采集、分離和純培養(yǎng)

1、春季傳染病病原菌的采集、分離和純培養(yǎng)實驗方案化藥1104趙金金病原物的分離和純化摘要：本實驗主要通過用對辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分離和在PDA培養(yǎng)基中對炭疽病菌消毒后做無菌培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)的實驗過程觀察炭疽病菌的生長情況，了解分離與純化病原物的基本原理與方法，掌握實驗室常用的消毒滅菌方法，并掌握培養(yǎng)基的制作和無菌操作技術(shù)。關(guān)鍵詞：分離培養(yǎng)、炭疽病、PDA培養(yǎng)基、滅菌前言柯赫氏法則(Kochs Rule)又稱柯赫氏假設(shè)(Koch's postulates)或柯赫氏證病律，是確定侵染性病害病原物的操作程序。如發(fā)現(xiàn)一種不熟悉的或新的病害時，就應按柯赫氏法則的四個步驟來完成診斷與鑒定

2、。診斷是從癥狀等表型特征來判斷其病因，確定病害種類。鑒定則是將病原物的種類和病害種類同已知種類比較異同，確定其科學名稱或分類上的地位。有些病害特征明顯，可直接診斷或鑒定，如霜霉病或稈銹病。但在許多場合難以鑒定病原物的屬、種。如花葉癥狀易于識別，要判斷由何種病原物引起，就必須經(jīng)詳細鑒定比較后才能確定。 柯赫氏法則表述為：“(1)在病植物上常伴隨有一種病原微生物存在；(2)該微生物可在離體的或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)；(3)將純培養(yǎng)接種到相同品種的健株上，出現(xiàn)癥狀相同的病害；(4)從接種發(fā)病的植物上再分離到其純培養(yǎng)，性狀與接種物相同”【1】。如果進行了上述四步鑒定工作得到確實的證據(jù)，就可以

3、確認該微生物即為其病原物。但有些專性寄生物如病毒、菌原體、霜霉菌、白粉菌和一些銹菌等，目前還不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以采用其他實驗方法來加以證明。侵染性病害的診斷與病原物的鑒定都必須按照柯赫法則來驗證，每個醫(yī)學家和植物病理學家都應能熟練地運用。 柯赫氏法則同樣也適用來對非侵染性病害的診斷，只是以某種懷疑因子來代替病原物的作用，例如當判斷是否缺乏某種元素而引起病害時，可以補施某種元素來緩解或消除其癥狀，即可確認是某元素的作用。春季傳染病病原菌的采集、分離和純培養(yǎng)實驗方案1.實驗目的1 明確培養(yǎng)基的配制原理2 通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟3通過采集和培養(yǎng)春季傳染病病原菌

4、來更好的預防春季傳染2.材料、儀器與用具2.1實驗材料 柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、PDA培養(yǎng)基（自制）2.2儀器用具超凈工作臺、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、接種鏟、接種針、70%酒精、0.1升汞、電爐等三腳架、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌。3.內(nèi)容與方法3.1培養(yǎng)基的配制過濾溶化稱量培養(yǎng)基的制作：擱置斜面滅菌包扎分裝加塞“培養(yǎng)基按成分及對成分了解程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基、組合培養(yǎng)基三類，從物理性分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基兩種，培養(yǎng)基不同，配制方法不同?！薄?】本實驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，簡稱PDA培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基是植物實驗室最常用的培養(yǎng)基，主要用于植物病原真菌的分

5、離培養(yǎng)。下面介紹PDA培養(yǎng)基的配制方法：首先準備優(yōu)質(zhì)去皮馬鈴薯200克、葡萄糖10-20克、瓊脂20克，加水至1000ml。將馬鈴薯切成小塊，加水1000ml煮沸約半小時，煮沸過程中要不斷攪拌，然后用雙層紗布濾去薯塊，補足水量，加入小塊瓊脂，加熱融化，再加糖，待完全溶化后，趁熱分裝于三角瓶和試管中，注意每個三角瓶不宜裝太多，以少于1/2為宜，試管中用于制備斜面培養(yǎng)基，也應較少，1/3左右為宜，然后將三角瓶和試管塞好棉塞以備滅菌。由于PDA略帶酸性，適于真菌生長，因此不用調(diào)節(jié)pH值。3.2滅菌為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，用于培養(yǎng)病原物的器物和培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用。滅菌前在三角瓶中加入少許孟

6、加拉紅抑制細菌和放線菌的生長。本實驗采用高壓蒸汽滅菌法對做好的PDA培養(yǎng)基和試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基滅菌。高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它是利用高壓提高蒸汽溫度，達到滅菌的目的，其操作步驟如下：A、 關(guān)好清水閥門，放入清水至標準度為止注意水量要加足，否則易造成事故。B、 將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上氣蓋，旋緊螺旋時，先將每個螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度，不要太緊，再旋緊相對的兩個旋鈕，以達到平衡旋緊，否則易造成漏氣不能徹底滅菌。C、 通電加溫，同時打開排氣活門牌盡鍋內(nèi)的空氣，當活門噴出的全是蒸汽的時候即可關(guān)閉閥門，一定要排盡空氣以達到徹底滅菌的目的，通常壓力表上升至5

7、磅時打開放氣降至零點再關(guān)閉。D、 壓力表的指針上升時溫度也隨之升高，當壓力表升至15磅時蒸汽壓相當于一個大氣壓，此時計算滅菌時間，控制熱源，使處于15磅壓力保持30分鐘，就能達到完全滅菌目的，然后停止加溫。E、 一般應待壓力表降至5磅時稍微打開排氣活門，使鍋內(nèi)蒸汽緩慢排除，然后加大活門開口，勿使排氣過快。F、 當壓力表降至0時鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。然后將高壓鍋內(nèi)水排出。G、 抽取上述培養(yǎng)基放入25攝氏度恒溫箱中，48小時不見雜菌證明培養(yǎng)基已達到目的。有些培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后容易失去營養(yǎng)成分，則可采用間歇性蒸汽滅菌法，即每天保持100攝氏度一個小時連續(xù)三天也可達到滅菌效果。3.3

8、病原真菌的分離培養(yǎng) 為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須進行分離菌的純化，本實驗采用組織分離法分離炭疽病菌。分離培養(yǎng)一般在超凈工作臺上進行，無菌室和無菌箱要經(jīng)過噴霧除塵，并用紫外線照射消毒，工作前將所需物品放在超凈工作臺內(nèi)，操作人員需用肥皂洗手，操作時還需用70%的酒精擦拭雙手，操作時呼吸要輕，不要說話。操作方法如下：A、 取滅菌培養(yǎng)基一個置于濕紗布上，在皿蓋上表明分離日期、材料和分離人姓名，并分別將10s、15s、20s、25s四個標示均勻標示到培養(yǎng)皿背面?zhèn)溆?。點燃酒精燈。B、 將培養(yǎng)皿拿在手上在酒精燈上烘烤皿口一圈，用無菌培養(yǎng)操作法向培養(yǎng)皿中加入25%乳酸1-2滴，然后將溶化冷至60攝氏度左右的P

9、DA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒15-20毫升，輕輕搖動使成平面，凝固后即成平板培養(yǎng)基。C、 取辣椒或柑橘炭疽病新鮮病葉，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣既病健結(jié)合部切取長寬3-4mm的方形小塊病組織數(shù)塊。D、 取5個滅菌培養(yǎng)皿，兩個分別加入75%酒精、0.1%升汞，其余三個加入適量無菌水。將切好的病組織放入75%酒精中浸泡3-5秒（消除表面張力），然后按無菌操作法將病組織移入0.1%升汞液中分別進行表面消毒10s、15s、20s、25s，然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留消毒劑。E、 將漂洗后的病組織放到無菌吸水紙上吸取多余水分，減少細菌污染，然后在酒精燈火線前用無菌操作法分別

10、將消毒時間為10s、15s、20s、25s的病組織各1個分別放入培養(yǎng)皿對應標識的位置，然后迅速將培養(yǎng)皿蓋上。F、 將培養(yǎng)皿放到25攝氏度左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。前兩天主要觀察是否被細菌污染，后兩天主要觀察待分離菌生長情況。G、 若病組織長出較為一致的菌落則多半為要分離的病原菌，為確定病原物是否為需要分離培養(yǎng)的病原物，可挑取菌落鏡檢，觀察其形態(tài)特征，若與之前看到的一致即為所需病原物。待病原菌生長到一定情況，取出培養(yǎng)皿，在超凈工作臺內(nèi)用接種環(huán)在菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上（接種環(huán)使用前在酒精燈火焰上烘烤數(shù)秒，防止雜菌滋生），在25攝氏度左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后觀察待分離菌生長狀況，如無雜菌生長，即得

11、到該病菌的純菌種，便可置于冰箱中保存。 如需驗證此病害，可將分離培養(yǎng)所得病原物通過無菌操作接種到健康的相同植株上，保濕培養(yǎng)數(shù)日，觀察其所致病害特征是否與原來一致，如一致，可再將其病原物分離培養(yǎng)觀察其性狀是否與第一次分離培養(yǎng)的病原物一致。4.結(jié)果分析4.1實驗結(jié)果分離培養(yǎng)所得病原物菌落多數(shù)在平板培養(yǎng)基中生長良好，呈純白色或灰白色，約有極少數(shù)被細菌污染，呈乳膠狀，灰色。約3天后接種到斜面培養(yǎng)基中，生長數(shù)天后觀察生長良好，無雜菌污染，呈黑褐色。挑取菌落部分與顯微鏡下觀察，其分生孢子著生于分生孢子盤內(nèi)壁上，分生孢子梗呈無色或褐色，分生孢子為無色單胞，長橢圓形或新月形，有的分生孢子盤上還長有黑褐色剛毛。4.2結(jié)果分析本實驗過程主要為科赫氏法則的前兩步，通過實驗操作，了解了分離培養(yǎng)的基本原理和方法，基本掌握了消毒滅菌方法和培養(yǎng)基的制作、無菌操作技術(shù)，了解了科赫氏法則的程序和方法。5.分析討論 炭疽病屬菌物描述如下：“分生孢子盤在寄生角質(zhì)下、表皮或表皮下，黑褐色，人工培養(yǎng)時有時產(chǎn)生菌核，在菌核和分生孢子盤上有時生有黑褐色的剛毛，分生孢子梗無色至褐色，產(chǎn)生內(nèi)壁芽生式分生孢子，分生孢子為無色，單胞，長橢圓形或新月形，有的含有1-2個油球萌發(fā)之后芽管頂端產(chǎn)生附著胞，引起多種瓜果和蔬菜炭疽病?！薄?】普通植物病理學實驗指導上對