食品理化檢驗氨基酸及蛋白質(zhì)

1、食品理化檢驗氨基酸及蛋白質(zhì)第三節(jié)第三節(jié) 食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定Determination of protein and amino acid in Food復(fù)習(xí)一下復(fù)習(xí)一下1.1.蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的元素組成 C C：50-55% H50-55% H：6-8% O6-8% O：20-23% 20-23% N N：15-18% S15-18% S：0-4%0-4% 微量元素：還含有微量的微量元素：還含有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等等2.2.基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸基本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸3.3.蛋白質(zhì)的變性作用。蛋白質(zhì)的變性作用。（一）蛋白質(zhì)的生理功能

2、及在食品中的作（一）蛋白質(zhì)的生理功能及在食品中的作用用（二）食品中的蛋白質(zhì)含量（二）食品中的蛋白質(zhì)含量（三）蛋白質(zhì)系數(shù)（三）蛋白質(zhì)系數(shù)（四）蛋白質(zhì)水解（四）蛋白質(zhì)水解（五）蛋白質(zhì)測定方法（五）蛋白質(zhì)測定方法一、概述一、概述 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分；重要成分； 維持人體的酸堿平衡、水平衡；維持人體的酸堿平衡、水平衡； 物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān); ; 蛋白質(zhì)是食品的最重要的營養(yǎng)指標(biāo)。其含量與分解產(chǎn)蛋白質(zhì)是食品的最重要的營養(yǎng)指標(biāo)。其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。物直接影響食品的

3、色、香、味。（一）蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用（一）蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用不同食品蛋白質(zhì)的含量不同，可作為質(zhì)量檢驗的一種重要手段。不同食品蛋白質(zhì)的含量不同，可作為質(zhì)量檢驗的一種重要手段。( (二二) ) 食品中的蛋白質(zhì)含量食品中的蛋白質(zhì)含量谷類和面食：谷類和面食： （% %）大米（糙米、長粒、生）大米（糙米、長粒、生） 大米（白米、長粒、生）大米（白米、長粒、生） 小麥粉（整粒）小麥粉（整粒） 玉米粉（整粒、黃色）玉米粉（整粒、黃色） 玉米淀粉玉米淀粉 豆類：豆類：大豆（成熟的種子、生）大豆（成熟的種子、生） 豆（腰子狀、所有品種）豆（腰子狀、所有品種） 豆腐（生、普通）豆腐（生

4、、普通） 水果和蔬菜：水果和蔬菜：蘋果（生、帶皮）蘋果（生、帶皮） 蘆筍（生）蘆筍（生） 草莓（生）草莓（生） 萵苣（冰、生）萵苣（冰、生） 肉、家禽、魚：肉、家禽、魚：牛肉（頸肉、烤前腿）牛肉（頸肉、烤前腿） 牛肉（腌制、干牛肉）牛肉（腌制、干牛肉） 雞（可供煎炸的雞胸肉、生）雞（可供煎炸的雞胸肉、生） 火腿（切片、普通的）火腿（切片、普通的） 雞蛋（生、全蛋）雞蛋（生、全蛋） 魚（太平洋鱈魚、生）魚（太平洋鱈魚、生） 魚（罐裝金槍魚滴干的固體）魚（罐裝金槍魚滴干的固體） 乳制品：乳制品：牛乳（全脂、液體）牛乳（全脂、液體） 牛乳（脫脂、干）牛乳（脫脂、干） 干酪干酪 酸奶（普通的、低脂）酸

5、奶（普通的、低脂） （三）蛋白質(zhì)系數(shù)（三）蛋白質(zhì)系數(shù) 在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等等8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食品提供，種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須依靠食品提供，故被稱為必需氨基酸，他們對人體有極其重要的生理故被稱為必需氨基酸，他們對人體有極其重要的生理作用。作用。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)胨胨肽肽氨基酸氨基酸利用蛋白質(zhì)共性的方法利用蛋白質(zhì)共性的方法利用特定氨基酸殘基法利用特定氨基酸殘基法凱氏定氮法凱氏定氮法杜馬斯法杜馬斯法福林酚法福林酚法染

6、色法染色法1.1.原理原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿，中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿，在氫氧化鈉的作用下，經(jīng)水蒸氣蒸餾使氨蒸出，用過在氫氧化鈉的作用下，經(jīng)水蒸氣蒸餾使氨蒸出，用過量的硼酸溶液吸收后，再以鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，量的硼酸溶液吸收后，再以鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量計算含氮量，并換算成蛋白質(zhì)含量。根據(jù)酸的消耗量計算含氮量，并換算成蛋白質(zhì)含量。 消化消化2NH

7、2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸鉀加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點作為增溫劑，提高溶液沸點加氧化劑加氧化劑 加速有機物氧化速度加速有機物氧化速度u 作為增溫劑，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度，而加快有機物分解；u 一般純硫酸的沸點在3400C左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到4000C以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解 ，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大 ，故沸點升高，其反應(yīng)式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度

8、過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。 催化劑 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反應(yīng)不斷進行，待有機物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。 可以指示消化終點的到達(dá)準(zhǔn)確稱取樣品，置于凱氏燒瓶中；準(zhǔn)確稱取樣品，置于凱氏燒瓶中；加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸搖勻；加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸

9、搖勻；置于電爐上，成置于電爐上，成4545度角，小火加熱。度角，小火加熱。待泡沫停止后，加大火力，保持微待泡沫停止后，加大火力，保持微沸，至液體變藍(lán)綠色透明，再繼續(xù)沸，至液體變藍(lán)綠色透明，再繼續(xù)加熱加熱1h1h，取下冷卻后，小心加入水，轉(zhuǎn)移至取下冷卻后，小心加入水，轉(zhuǎn)移至1000ml1000ml容量瓶，定容，作為樣品液容量瓶，定容，作為樣品液備用，同時做空白試驗。備用，同時做空白試驗。l按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置;l于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水裝水至2/3容積處，加指示劑數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)毫升，以保持水呈，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。l在加入硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下

10、。 用硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點用硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點 指示劑：混合指示劑（甲基紅指示劑：混合指示劑（甲基紅溴甲酚綠）溴甲酚綠） 指示劑指示劑 紅色紅色 綠色綠色 紅色紅色 （酸）（酸） （堿）（堿） （酸）（酸）2NH + 4H BO =(NH ) B O +5H O (NH ) B O +2HCl+5H O=2NH Cl+4H BOX =1000W%100K)(CMVVN21半微量凱氏定氮蒸餾裝置半微量凱氏定氮蒸餾裝置（1）測得的是粗蛋白含量（總氮量，含非蛋白氮）；（2）所用試劑應(yīng)用配制；（3）消化過程應(yīng)注意凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以

11、促進消化完全。（4）若樣品含脂肪或糖較多時，消化時易產(chǎn)生大量泡沫，可加少量辛醇或液體石蠟，或硅油消泡劑，并注意適當(dāng)控制熱源強度（要小火加熱）。（5）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入300g/L23ml后再加熱。過氧化氫注意事項注意事項（5）若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化時間一般約4小時左右即可，消化時間過長會引起氨的損失。一般消化至透明后，繼續(xù)消化30min即可，但當(dāng)含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸或組氨酸時，消化時間需適當(dāng)延長，因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內(nèi)不易消化完全，往往導(dǎo)致總氮量偏低。有機物如分解完全，分解

12、液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。（7）蒸餾過程應(yīng)注意接頭處無現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）不應(yīng)超過40C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈，在中性溶液中呈，在酸性溶液中呈。特點：特點：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化多個樣品，）快速：一次可同時消化多個樣品， 消化時間短；消化時間短；（3）自動

13、：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？桑┳詣樱鹤詣蛹訅A蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置。可計算總氮百分含量并記錄，計算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成分鐘完成1個樣。個樣。 1、試述蛋白質(zhì)測定中，樣品消化過程所必須注意的事項，消化過程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？ 2、樣品經(jīng)消化進行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒有變化，說明什么問題？須采用什么措施？ 3、硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什么作用？ 作作 業(yè)業(yè)氨基酸的測定氨基酸的測定Determination of amino acid in Food氨基酸的測定方法氨基酸的測定方法 氨基酸

14、分析儀法（國標(biāo)法）氨基酸分析儀法（國標(biāo)法） 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC)HPLC) 氣相色譜法（氣相色譜法（GC)GC) 熒光分光光度法熒光分光光度法 紫外紫外- -可見分光光度法可見分光光度法氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法1、原理、原理 利用氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，利用氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。當(dāng)樣液加入色使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后，采用不同的譜柱頂端后，采用不同的pHpH值和離子濃度的緩沖溶液即可值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯

15、色，將它們依次洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯色，再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。再通過分光光度計比色測定氨基酸含量。定量依據(jù)：是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物的定量依據(jù)：是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波長處定量測定。長處定量測定。 氨基酸自動分析儀氨基酸自動分析儀氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法2. 操作方法操作方法 （1 1）樣品處理：）樣品處理：測定樣品中各種游離氨基酸含量，可測定樣品中各種游離氨基酸含量，

16、可以除去脂肪等雜質(zhì)后，直接上柱進行分析。以除去脂肪等雜質(zhì)后，直接上柱進行分析。 測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時樣品必須經(jīng)酸水解，使蛋測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時樣品必須經(jīng)酸水解，使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進行分析。白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進行分析。酸水解的方法：稱取經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)樣品鹽酸，置于酸水解的方法：稱取經(jīng)干燥的蛋白質(zhì)樣品鹽酸，置于110110 C C烘箱內(nèi)水解烘箱內(nèi)水解2424小時，然后除去過量的鹽酸，加緩沖小時，然后除去過量的鹽酸，加緩沖溶液稀釋到一定體積，搖勻。取一定量的水解樣品上柱溶液稀釋到一定體積，搖勻。取一定量的水解樣品上柱進行分析。進行分析。 氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法

17、如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜如果樣品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、無機鹽等雜質(zhì)，必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進行酸水解處理。去除質(zhì)，必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進行酸水解處理。去除雜質(zhì)的方法如下雜質(zhì)的方法如下: : 去糖和淀粉去糖和淀粉：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗：把樣品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗滌，得蛋白質(zhì)沉淀物；滌，得蛋白質(zhì)沉淀物； 去脂肪：去脂肪：先把干燥的樣品經(jīng)研碎后用丙酮或乙醚等有機先把干燥的樣品經(jīng)研碎后用丙酮或乙醚等有機溶劑離心或過濾抽提，得蛋白質(zhì)沉淀物；溶劑離心或過濾抽提，得蛋白質(zhì)沉淀物； 去核酸：去核酸：將樣品在將樣品在10%10%氯化鈉溶液中，氯化鈉

18、溶液中，8585加熱加熱6 6小時，小時，然后用熱水洗滌，過濾后將固形物用丙酮干燥即可；然后用熱水洗滌，過濾后將固形物用丙酮干燥即可；去無機鹽：樣品經(jīng)水解后含有大量無機鹽時還必須用陽離去無機鹽：樣品經(jīng)水解后含有大量無機鹽時還必須用陽離子交換樹脂進行去鹽處理。子交換樹脂進行去鹽處理。氨基酸分析儀法氨基酸分析儀法（2 2）樣品分析：）樣品分析： 經(jīng)過處理后的樣品上柱進行分析。上柱的樣品量視所經(jīng)過處理后的樣品上柱進行分析。上柱的樣品量視所用自動分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸用自動分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸 molmol左右左右( (水解樣品干重為左右水解樣品干重為左右) )；生成的紫色物質(zhì)在