歐蒙抗核抗體譜IgG檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、抗核抗體譜(IgG)檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1 .目的規(guī)范抗核抗體譜(IgG)檢測，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。2 .適用范圍檢驗(yàn)科免疫組工作人員。3 .試劑規(guī)格名稱與組成型號名稱：ANA譜1靶抗原：nRNP/Sm，Sm，SS-A，Ro-52，SS-B，Scl-70，Jo-1，CENPB，dsDNA，核小體，組蛋白，核糖體P蛋白類型：IgG基質(zhì)：抗原包被的檢測膜條規(guī)格：16X01(16)4 .預(yù)期用途：用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗nRNP、Sm>SS-A(天然SS-A和Ro-52)、SS-B、Scl-70、PM-Sc、lJo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白和AMA

2、M2共14種不同抗原IgG類抗體。5 .適應(yīng)癥：夏普綜合征（MCTD），系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），干燥綜合征，進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥，多肌炎皮肌炎、重疊綜合征、局限型進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征），原發(fā)性膽汁性肝硬化。6 .臨床意義：抗核抗體識別是各種細(xì)胞核組分（細(xì)胞核的生化成份）1,2，包含核酸、細(xì)胞核蛋白及核糖蛋白。可特征性地出現(xiàn)于許多疾病中，尤其是風(fēng)濕性疾病3,4,5。在炎癥性風(fēng)濕性疾病中，這些抗核抗體的陽性率在20%到100%之間，以風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的陽性率最低，在20%至40%之間。因此，ANA鑒別診斷在對個別風(fēng)濕疾病的確認(rèn)十分必要，而且對自身免疫性疾病的進(jìn)一步診斷也很有價值。3,6

3、,7,8,9,10,11風(fēng)濕疾病一夏普綜合征（混合結(jié)締組織病=MCTD）8系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）8,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22干燥綜合征（原發(fā)性干燥綜合征）5,系統(tǒng)性硬化癥（系統(tǒng)性硬皮病,SSc）1,23,一局限型系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征）28多肌炎/皮肌炎12,15類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎57.主要組成成分：8儲件效2-保不未除別試自日穩(wěn)個稀的合清成份規(guī)格規(guī)格標(biāo)識存條及有期：8°C存，要冷凍。開封刖，非特說明，劑盒生產(chǎn)起可定18月。釋后酶結(jié)物和洗緩1.包被抗原的檢測膜條：nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl

4、-7RPM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白、AMAM2。16條4x16條STRIP：>2.陽性對照人IgG,100倍濃縮1x0.02ml4x0.02mlPOSCONTROL(100x3.酶結(jié)合物堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG,10倍濃縮1x3ml4x3mlCONJUGATE回4.樣本緩沖液直接使用1x100ml3x100mlSAMPLEBUFFER5.清洗緩沖液10倍濃縮1x50ml1x100mlWASHBUFFER10)6.底物液NBT/BCIP（四晚硝基苯胺蘭/5-澳-4-氯噬-3引珠-磷酸鹽），直接使用1x30ml4X30mlSUBS

5、TRATE7.溫育盤2x8槽8.產(chǎn)品說明書1份1份沖液需在一個工作日內(nèi)用完。9 .樣本要求樣本：人血清或EDTA、肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿。穩(wěn)定性：待檢患者樣本于2-8°C可穩(wěn)定14天，稀釋后的樣本應(yīng)在同一個工作日內(nèi)檢測。樣本稀釋：患者樣本用樣本緩沖液1:101稀釋，如可取15ul血清用1.5ml樣本緩沖液稀釋并用漩渦混勻器充分混勻。不可用加樣器混勻。10 .檢驗(yàn)方法10.1 試劑的準(zhǔn)備和穩(wěn)定性注意：使用前所有試劑均必須于室溫（18-25°C）平衡30分鐘。從第一次使用起，試劑盒如保存在2-8C,并且在沒有污染的情況下，可穩(wěn)定至所標(biāo)示的有效期。- 包被抗原的檢測膜條：直接使

6、用。為防止膜條發(fā)生冷凝，只有當(dāng)膜條平衡到室溫后才可打開包裝。取出膜條后應(yīng)立即密封好原包裝并將其保存于2-8°C。- 陽性對照：100倍濃縮。使用時用干凈的吸管從瓶中吸取所需陽性對照，用樣本緩沖液1:101稀釋如：15ul陽性對照用1.5ml樣本緩沖液稀釋并充分混勻。已稀釋的陽性對照應(yīng)在同一個工作日用完。- 酶結(jié)合物：10倍濃縮。使用時用干凈的吸管從瓶中吸取所需酶結(jié)合物，并用樣本緩沖液1:10稀釋。如需溫育一條檢測膜條，用1.35ml樣本緩沖液稀釋0.15ml酶結(jié)合物已稀釋的酶結(jié)合物應(yīng)在同一個工作日用完。- 樣本緩沖液：直接使用。- 清洗緩沖液：10倍濃縮。使用時用干凈的吸管從瓶中吸取

7、需要量用蒸餾水1:10稀釋。如需溫育一條膜條，用9ml蒸餾水稀釋1ml濃縮緩沖液。稀釋后的緩沖液應(yīng)在同一個工作日用完。- 底物液：直接使用，對光敏感，使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋。10.2操作流程預(yù)處理:取出所需的膜條，將其放入溫育槽內(nèi)。膜條上有編號的一面朝上。在溫育槽中分別加入1.5ml樣本緩沖液，于室溫在搖擺搖床上溫育5分鐘后，吸去溫育槽中的液體。血清溫育第一次:在溫育槽中分別加入1.5ml已稀釋的血清樣本，在搖擺搖床上室溫(18°C-25C)溫育30分鐘。清洗：吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5ml清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5分鐘。酶結(jié)合物溫育第二次:在溫育槽中加入1.5ml已稀釋的

8、酶結(jié)合物(堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG)，于搖擺搖床上室溫溫育30分鐘。清洗：吸去槽內(nèi)液體，在搖擺搖床上用1.5ml清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5分鐘底物溫育第三次:在溫育槽中分別加入1.5ml底物液，于搖擺搖床上室溫(18°C-25C)溫育10分鐘。終止:吸去槽內(nèi)液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次1分鐘。結(jié)果判斷:將檢測膜條放置在結(jié)果判定模板中，風(fēng)干后判斷結(jié)果。在歐蒙印跡法自動操作儀(EUROBlotMaster)中使用該產(chǎn)品時，請選擇方法列表中的Euro01AAbEL30。抗核抗體譜(IgG)檢測試劑盒(歐蒙印跡法)實(shí)驗(yàn)操作預(yù)處理將愴翦藤條放人程育植乎,并在寫糟中腐入L5ml祥本班腫

9、液搖掛播床溫百所有獻(xiàn)血員均為11參考范圍：檢測50例健康獻(xiàn)血員血清的中ANA譜水平，結(jié)果顯示:陰性。12:檢測結(jié)果的解釋方法：對已溫育的檢測膜條，我們推薦使用EUROLineScan軟件評價結(jié)果。采用去離子水或者蒸儲水終止反應(yīng)后，用銀子將檢測膜條放在綠色紙的粘性塑料膜上。當(dāng)膜條還是濕的時候，可以調(diào)整位置。當(dāng)把膜條置于結(jié)果判定模板中的塑料膜上，并與標(biāo)志對齊，用力按壓，膜條完全干后將粘附于塑料膜上。干透后的檢測膜條，可用臺式掃描儀(EUROIMMUNAG)掃描，并采用EUROLineScan軟件評價結(jié)果。關(guān)于EUROLineScan程序的相關(guān)信息，請參照EUROLineScan使用手冊(EUROI

10、MMUNAG)。該檢測膜條相應(yīng)的Test代碼是Ana3bo如果您需要進(jìn)行目測，可以從歐蒙公司訂購結(jié)果判定模板(訂貨號：ZD1590-0101-3G)。檢測膜條上有一條質(zhì)控帶，如果質(zhì)控帶出現(xiàn)強(qiáng)的顏色反應(yīng)說明實(shí)驗(yàn)操作正確。膜條包被抗原的位置上出現(xiàn)的白色條帶應(yīng)判為陰性。抗原及其在檢測膜條上的位置：DL1590-3G歐蒙印跡法檢測膜條包被有如下抗原：nRNP/Sm：小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然U1-nRNP。Sm：牛脾臟和胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然Sm。SS-A牛脾臟和胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然SS-ARo-52:重組的Ro-52(52kDa),相應(yīng)的人cDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在

11、昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。SS-B:小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然SS-RScl-7Q牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然Scl-70(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1)。PM-Scl:重組抗原，相應(yīng)的人cDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。Jo-1:小牛和兔胸腺提取物，經(jīng)親和層析純化的天然Jo-1（組氨酰-tRNA合成酶）。CENPB:重組的著絲點(diǎn)蛋白B,相應(yīng)的人cDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。PCNA:重組的PCNA（36kDa）,相應(yīng)的人cDNA用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。dsDNA:從鞋魚睪丸提取物中高度純化的天然雙鏈DNA。核小體：從牛胸腺提取物中純化的天然核小體。組蛋白：從牛胸腺

12、提取物中純化的各種類型組蛋白的混合物。核糖體P蛋白：小牛和兔胸腺提取物，用親和層析純化的天然核糖體P蛋白。AMAM2:從豬心臟提取物中純化的天然M2抗原（丙酮酸脫氫酶復(fù)合物）。根據(jù)抗原帶著色的深淺，可將結(jié)果分為陰性、可疑和陽性?？乖瓗е纳顪\結(jié)果無色陰性著色非常弱可疑著色中到較強(qiáng)陽性著色與質(zhì)控帶強(qiáng)度相同強(qiáng)陽性根據(jù)EUROLineScan判讀結(jié)果，可將結(jié)果分為陰性、可疑和陽性。等級EUROLineScan著色強(qiáng)度結(jié)果o0-5陰性（十）6-10可疑+11-25弱陽性+26-50陽性+51-256強(qiáng)陽性用歐蒙印跡法檢測自身抗體時，應(yīng)同時采用間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)。這樣一方面可確保結(jié)果的可靠性，排除假陽

13、性反應(yīng)；另一方面，歐蒙HEp-2細(xì)胞，特別是HEp-2細(xì)胞與靈長類肝冰凍組織切片的生物薄片馬賽克的間接免疫熒光法可檢測抗核抗體的范圍非常廣，而歐蒙印跡法檢測膜條上的抗原種類非常有限，只能檢測有限的抗體。13產(chǎn)品性能指標(biāo)13.1 定標(biāo)：檢測膜條上各種抗原的反應(yīng)性已用疾病控制中心（美國亞特蘭大）提供的人參考血清這些CDC血清的特異性已用免疫熒光模型（基質(zhì)：HEp-2細(xì)胞和靈長類肝臟）、雙向免疫擴(kuò)散或?qū)α髅庖唠娪镜慕Y(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，這些血清不是單一特異性的。13.2 檢測范圍：歐蒙印跡法為定性檢測方法，沒有檢測范圍，樣本稀釋度為1:101。13.3 交叉反應(yīng)：高質(zhì)量抗原（抗原和抗原的來源）確保了檢測系統(tǒng)的高特異性。本歐蒙印跡法檢測試劑可特異檢測IgG類抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、PM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白、AMAM2抗體，未發(fā)現(xiàn)與其它自身抗體之間的交叉反應(yīng)。13.4 干擾：血紅蛋白濃度小于5mg/ml的溶血、甘油三脂濃度小于20mg/ml的脂血和膽紅素濃度小于0.4ml/ml的黃疸對檢測結(jié)果沒有影響。13.5 批內(nèi)和批間差異：通過比較同一樣本在相同時間內(nèi)多次檢測結(jié)果的差異來研究批內(nèi)差異；批批差異為用不同批號產(chǎn)品對同一樣本進(jìn)行檢測所得的差異。每一次