植物響應寒冷脅迫的CBF基因表達調(diào)控

1、植物響應寒冷脅迫的CBF®因表達調(diào)控寒冷脅迫是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中一種嚴重的自然災害，世界每年因此造成的損失十分巨大。自然環(huán)境下溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，在栽培條件下更影響著農(nóng)作物及園藝植物等的產(chǎn)量和品質(zhì)，低溫對植物的影響尤為突出。低溫脅迫常使某些起源于熱帶、亞熱帶地區(qū)的植物因冷敏感性而無法在溫帶以北地區(qū)露地安全越冬，這就給引種帶來不利，因此，探明植物抗寒性形成的生理機制和遺傳因素，不僅在理論上具有重要的科學意義，在解決生產(chǎn)實際問題上也具有廠泛的應用價值。經(jīng)過研究，至今人們己在植物抗寒的形態(tài)學、生理生化、生物物理、生態(tài)及細胞遺傳學方面取得廣泛進展，隨著生物技術的發(fā)展，有關植物抗寒

2、的分子生物學研究成為近十年的研究熱點之一，導入外源基因提高植物的抗寒性已成為現(xiàn)代植物育種的主要手段，并開始逐步探索利用基因工程手段進行植物抗寒育種及有關生理研究。1 CBF家族擬南芥CBF/DREB僖因家族是一個包括CBF1CBF2CBF3CBF4CBF5CBF6的小基因家族。雖然CBF4與其他CBF具有相同保守的AP2區(qū)域，但CBF4不受低溫誘導，而是受干旱誘導，是一個抗旱轉(zhuǎn)錄因子。過量表達的CBF4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，其抗旱性和抗寒性均明顯提高。CBF么CBF2和CBF3基因在擬南芥中屬于一個編碼同蛋白的基因小家族，具有快速冷誘導表達特性。這3個基因連鎖于擬南芥4號染色體的短臂上，與分子標記

3、m60QpG11緊密連鎖。CBF4定位于5號染色體上1。CBF1/2/3蛋白結(jié)構(gòu)中有pkkpagrkkfretRhifadsawR特異氨基酸識別蛋白，還發(fā)現(xiàn)具有與蛋白激酶C和酪蛋白激酶n結(jié)合的位點2oCBFs與它們靶細胞的啟動子中CRT/DRT（C-重復元件/干旱響應元件）元件結(jié)合并且誘導這些基因的轉(zhuǎn)錄以響應低溫。CBF碓寒冷馴化過程中是重要的組件；三個低溫誘導CBFs的過表達植株導致了在溫暖條件下CBF靶基因的誘導，并且不需要經(jīng)過寒冷馴化就可具有耐寒性的能力3。2 CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控網(wǎng)絡2.1 CBF/DREB1春化途徑春化發(fā)育特性是植物的重要性狀，由春化相關基因調(diào)控，低溫是春化發(fā)育中

4、關鍵因素。許多植物在遭受嚴寒前,若經(jīng)過一個緩慢的降溫過程,抗寒性會逐漸提高,這一過程稱為低溫馴化。CBF基因在耐寒方面的作用對擬南芥進行了詳細的研究，低溫馴化期間擬南芥大約20%勺基因表達都直接或間接受CBFW錄因子的調(diào)控4。擬南芥中CBFs直接靶基因包括CORE因強烈的誘導表達5。谷物中類似的CBF靶基因，其上游調(diào)控區(qū)域也含有CRT/DRE%件6。圖1Stockinger等7大麥5號染色體長臂在FR-H2基因位點上CBF基因和VRN-H1/Fr-H1基因的示意圖.CB崔因不僅受寒冷誘導，而且也受VRN-H1負調(diào)控影響。冬季型大麥表達VRN-H1蛋白的vrn-H1基因需要經(jīng)過越冬才表達，因為V

5、rn-H1是不表達的。不同因素會影響Vrn-H1的表達。VRN-H1的活性可能直接抑制CBF表達，或者可能導致中間物質(zhì)激活來抑制CBF表達，或者兩者同時在轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后水平上起作用。如圖1所示，冬麥基因型已經(jīng)分離出兩個主要基因座，F(xiàn)r-1和Fr-28。Fr-1和Fr-2位于部分同源群5號染色體上，之間距離20-50cm取決于群體定位不同9。大麥中Fr-1基因表示為Fr-H1（H表示大麥）。VRN1編碼蛋白為MAD嬖轉(zhuǎn)錄因其受低溫誘導促進開花，是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關鍵因子10 。VRN-1共同隔離的Fr-19,兩個關鍵位點之一均可調(diào)節(jié)小麥的春花需求。對于Fr-2上CBF同源基因表達的

6、調(diào)控可能是復雜的，這種復雜性取決于內(nèi)源性和外源性的相互作用。VRN-1/Fr-1是一個部分負調(diào)控在Fr-2的某些CBF基因。VRN-H1通過一個連鎖基因在VRN-H1/Fr-H1發(fā)揮多效性作用對CBF表達產(chǎn)生負影響。因為VRN-1是一個MADSDN結(jié)合蛋白，它可能直接結(jié)合到CBF基因組區(qū)域，或者可能間接影響其他調(diào)控因子來控制CBF表達。冬季中攜帶vrn-1等位基因的基因型的CB崔因表達比春季生長中攜帶vrn-1等位基因的基因型的CB法達水平更高7。除此之外，一旦冬季攜帶等位基因vrn-1的基因型受到春化作用，其CBFW錄水平抑制到與非春化植物相同的水平7o這表明，VRN-1會抑制在FR-2位置

7、的CBFs的表達，從而降低抗凍性。群體分離的VRN-H1攜帶隱性vrn-H1等位基因的植株比攜帶顯性vrn-H1等位基因的植株具有更高的CBF和COFg因的轉(zhuǎn)錄水平7。此外，當植物受到冷脅迫后，短日照下植株（減少VRN-H1水平）的CBF和COR專錄水平明顯高于長日照處理的植物。植物體內(nèi)多種CBF基因以及下游COR®基因轉(zhuǎn)錄水平的降低伴隨著VRN-1轉(zhuǎn)錄水平增加可以為植物進入生殖生長階段后對寒冷耐受性降低提供合理的解釋。擬南芥成花激活MAD流式基因SOC隨過直接抑制CBFg因作為冷響應途徑的負調(diào)控子11o擬南芥哥倫比亞野生型株系，SOC休E葉片中表達最強烈，在根尖花序和莖段中也可檢測

8、到其表達。socl突變型和SOCti表達株系中三個CBF基因表達水平增加了，而CBF的調(diào)控基因ICE1,HOS1和ZAT12的轉(zhuǎn)錄水平均未受到影響。染色質(zhì)免疫沉淀實驗證明相比socl突變型，SOC他表達植株體內(nèi)CBF啟動子中富集了CArG盒式區(qū)域，這說明SOC1®過直接抑制CBF基因轉(zhuǎn)錄來負調(diào)控寒冷響應11。有趣的是，小麥中與擬南芥SOC1WSOC的同源基因表達不受春化作用和光周期的影響，這表明不同物種同種基因不同功能10。雖然擬南芥SOC休口谷物VRN-1似乎與葉片中CBF和CORE因下調(diào)控制相關，擬南芥中VRN-1對CBF基因的影響似乎不同于SOC1MCBF基因的直接影響。擬南芥

9、soc1突變型表現(xiàn)為CBF基因?qū)漤憫鰪娨约疤岣叩目箖鲂裕@說明秋季SOCM氐水平轉(zhuǎn)錄有利于植物適應寒冷環(huán)境11oSOC轉(zhuǎn)錄水平伴隨著擬南芥開花初始時間強烈增加，這表明SOC扃轉(zhuǎn)錄水平將會對CBF基因和他們的下游CO砌基因進行下調(diào)控制。2.2 響應低溫的CBFs調(diào)控表達當植物暴露于4環(huán)境后，15min內(nèi)低溫響應轉(zhuǎn)錄因子CBF1,2和3的積累會快速表達12o還冷中植物CBF轉(zhuǎn)錄因子在2左右出現(xiàn)高峰，然后會下降到一定程度略高于溫暖環(huán)境下它們的表達。一旦將植物移入溫暖環(huán)境，CBFW錄因子便快速降解12。ICE1,一個類似MYCbHLH!以結(jié)合到MYCH別位點的蛋白，研究表明它參與CBFs的誘導1

10、3o這個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的一個點突變會造成低溫響應CBF3表達劇烈減少。ICE1是HOS值素化目標蛋白，HOS傀一個E3連接酶也是寒冷馴化的負調(diào)控子14。SIZ1,一個SUMO-E31接酶，可以阻止ICE1的泛素化，導致低溫響應的CBFs表達量增加15o雖然CBF1和CBF2的啟動子中具有MYCH別序列，ice1突變體中CBF1和CBF2的表達水平受到影響，說明低溫響應的三個CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控表達可能是想法獨立的。對比ice1突變體，這個基因完全敲除后CBF1/2/3的表達水平并沒有顯著影響，說明除了ICE1之外還可能有別的因子調(diào)控CBFs的表達。過表達ICE1植株內(nèi)增加了低溫響應轉(zhuǎn)錄因子C

11、BF2和CBF3mRNA勺積累。然而，溫暖條件下ICE1過表達植株內(nèi)并沒有誘導出三個CBFs，說明ICE1單獨表達不足以誘導CBFs。植物體內(nèi)可能具有ICE1無法克服的抑制因子，ICE1修飾或者僅在低溫環(huán)境時另一些調(diào)節(jié)子會發(fā)揮作用或者CBFmRN照定性的改變。環(huán)己酰亞胺處理也會誘導CBFmRNA）積累，這種結(jié)果的一個解釋是一個潛在負調(diào)控元件對于CBFs的溫暖抑制重要性12oMYB1導口ZAT12作為CBFs的負調(diào)控子。MYB1序口ZAT12的過表達均會減少CBFs低溫誘導的積累16oMYB1馱失植株會增加某些低溫響應的潛在因子的積累16。然而，MYB1喊ZAT12基因敲除后CBFs的影響不受影

12、響，可能由于在擬南芥內(nèi)大型MYB和鋅指結(jié)構(gòu)家族具有冗余基因或者由于在CBF調(diào)控中某些潛在負調(diào)控元件的功能所致。2.3 寒冷馴化的非依賴CBF途徑有趣的是，許多寒冷敏感植物，例如番茄包含低溫誘導的功能性CBF蛋白。番茄中CBF1是受寒冷誘導的，并且與擬南芥的功能相同，當CBF1過表達導致擬南芥獲得連續(xù)耐寒性17。然而，即使擁有這個寒冷誘導的功能性CBF蛋白，番茄依然不具有耐寒性。這說明番茄中CBF下游所需的組件可能丟失或者擬南芥中存在另外的可以提高耐寒所需組件的途徑而番茄中沒有這些途徑。突變體實驗證明影響耐寒性的機制與CBF途徑相互獨立。esk1突變體連續(xù)性耐寒，然而植株并沒有表現(xiàn)出CBFs或一

13、些CBF靶基因水平顯著增加18。esk1突變體內(nèi)積累了高水平脯氨酸（冷凍保護劑），暗示了一個解釋耐寒性增強的可能機制。然而，ESK1編碼一個含有未知功能區(qū)域的新蛋白，所以脯氨酸水平增加以及耐寒性增加的機制仍然未知。MYB專錄因子內(nèi)一個突變,hos10,會影響ABA生物合成基因NCED3勺調(diào)控，最終導致耐寒性降低而CBF調(diào)節(jié)子基因COR15aRD292ADHff口KIN1的表達增加19o耐寒性誘導中存在一個功能性CBF途徑意味著單獨CBF途徑可能不足以完全提供給野生型耐寒性。3應答其他環(huán)境因子的CBFs調(diào)控表達植物對不同環(huán)境信號的重疊響應表達時，研究了響應多種環(huán)境因素的CBFs復雜表達調(diào)控。晝夜

14、規(guī)律對CBF誘導也有影響。由于晝夜規(guī)律溫暖條件下CBF3mRN冰平在早晨達到高峰。重要的是，生物鐘對CBF低溫誘導具有影響，鐘門控制著誘導。當植物移入凌晨低溫環(huán)境下，這與CBF渥夜表達的高峰時間相抵觸，寒冷中CBFs的誘導水平高于處于CBF表達低谷移入寒冷環(huán)境的植株20o這說明氧化鐘與冷信號共同作用確保CBFs的誘導以及在合適時間作出寒冷的響應。用相同的方式，證明光量子對寒冷誘導的CBFs以及它們靶基因轉(zhuǎn)錄也有影響。一個與GUSa合并含有四個拷貝CRT勺報告基因發(fā)現(xiàn)需要光照才能進行低溫誘導。一個10min的紅光脈沖足以完成這個低溫響應；然而，當紅光脈沖后緊跟著遠紅光脈沖的話這種低溫響應就會被消

15、除21。這個實驗說明光敏色素可以調(diào)控低溫響應。Kim等證明了這是一個依賴光敏色素B的響應。這個光量子參與調(diào)解CRT元件的實驗說明CBFs本身響應光照后進行積累調(diào)控或者光照信號處于介于CBFmRNAR累和CBF基因調(diào)控之間的下游監(jiān)測點發(fā)揮作用。光量子信號已證明在16調(diào)節(jié)CB腺錄因子的誘導。紅光與遠紅光低的比率就能導致16c時CBF誘導量增加。此外，這種低比率紅光/遠紅光的光照實驗可以在16提高種子的耐寒性，而22下則不能22。因此光信號的參與對CBF的誘導和激活是重要的。除此之外，實驗證實機械力也會誘導CBFs的轉(zhuǎn)錄。接觸或攪拌擬南芥植株后，CBF1/2/3會快速的誘導到平均水平或者高于寒冷誘導

16、的水平1。從CBF調(diào)控的多種方法中整合信息也許會提供給我們理解響應低溫CBF誘導機制的合理解釋。寒冷誘導中鈣離子的參與證明是通過CRTs實現(xiàn)的。岡田酸處理能抑制4個CRTW貝報告基因的寒冷誘導21。岡田酸被證實可抑制鈣離子的順勢急劇積累，但是對鈣離子的緩慢積累沒有影響，通過抑制蛋白磷酸酶活性來減少鈣離子內(nèi)流23。抑制含有4個CRTW貝的報告基因所需的濃度相對2c類型蛋白磷酸酶的抑制是特定的21o兩個2c類型蛋白磷酸酶，ABI1和ABI2是作為擬南芥保衛(wèi)細胞中控制鈣離子內(nèi)流的ABA信號下游的組成成分24。岡田酸對寒冷誘導的鈣離子水平具體影響是未知的；然而，這個實驗提升了鈣離子通過CRT元件來激活

17、CBF靶基因的可能性?；钚匝酰≧OS調(diào)節(jié)信號途徑可能也對誘導CBFs具有重要作用。FRO1是一個線粒體呼吸鏈復合體1的脫氫酶亞基NADHfro1突變體中顯示為RO延續(xù)積累25。fro1突變體對寒冷敏感，寒冷響應的轉(zhuǎn)錄子COR15a,COR47Kin和RD29a的誘導降低。這種降低導致fro1植株耐寒性下降。有趣的是fro1突變體增加的CBF水平與野生型相比，發(fā)現(xiàn)響應低溫的CBF誘導在12小時時有了唯一變化。也許這表明活性氧信號參與了基于晝夜規(guī)律或光照的CBF表達。活性氧信號與鈣離子信號之間存在廣泛的交叉作用。例如，活性氧信號能夠激活質(zhì)膜Ca2嘀子通道通透性，而Ca2何以調(diào)控活性氧清除機制26,27。參與CBFs誘導的鈣離子可能對理解CBF響應多種環(huán)境信號