胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的失誤及改進(jìn)

1、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的失誤及改進(jìn)20世紀(jì)90年代初以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日益完善，胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preim plantation genetic diagnosis，PGD)的發(fā)展十分迅速，臨床上可以鑒定性別，診斷多種單 基因病及染色體病，全世界已有近百例嬰兒經(jīng)PGD后誕生。但臨床上PGD仍存在20%左右的誤 診率1，主要在于微活檢技術(shù)的有效性不足和PGD常用的兩種分析方法，即聚合酶 鏈反應(yīng)(PCR)和熒光原位雜交(FISH)在利用單細(xì)胞做底物時(shí)存在著缺陷。許多學(xué)者針對(duì)這些 原因開展了一些新的方法，本文就PGD的誤診原因及改進(jìn)作一綜述。 1顯微活檢技術(shù)的有效性PGD無(wú)論從卵細(xì)胞的極

2、體還是從卵裂球中取材，都需要運(yùn)用微活檢技術(shù)，這是PGD技術(shù)的一 個(gè)難點(diǎn)。Reubinoff2報(bào)道：28%的卵細(xì)胞由于活檢操作失誤而不能用于PGD，原因 在于分離緊密連接的卵裂球能損傷細(xì)胞膜。Shee3把常規(guī)活檢時(shí)分別用來(lái)固定囊 胚、酸溶透明帶、抽吸卵裂球的3個(gè)吸管，減少為用2個(gè)，1個(gè)仍固定囊胚，另1個(gè)先用酸溶蝕 透明帶，然后把酸吸回再抽出卵裂球。這大大縮短了活檢時(shí)間，且在透明帶上溶開的孔徑與 吸管直徑相同但略小于卵裂球的直徑，從而避免活檢后細(xì)胞質(zhì)流出和細(xì)胞膜破裂。該法使活 檢的有效性提高了10%3。另外，Cieslak報(bào)道新開展的三維透明帶部 分切開術(shù)用于卵裂球活檢，是在透明帶上做一個(gè)V形切開

3、(交叉裂口)，造成一個(gè)三角邊口， 足夠微吸管進(jìn)入胚胎取出裂殖細(xì)胞。行胚胎活檢時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)胚胎直至V形切口置于3點(diǎn)處，固定 胚胎，微管進(jìn)入焦距，施少許壓力向上壓開三角形葉片即插入胚胎，能在不扭曲胚胎卵裂球 外形下吸出裂殖細(xì)胞，三角葉片在微管離去后復(fù)位，在移植過(guò)程中可保護(hù)胚胎。該術(shù)不同于 用微針在透明帶上造一裂口的傳統(tǒng)方法，是一種安全、簡(jiǎn)單、有效的機(jī)械性透明帶部分切開 造口術(shù)。Markus用激光在透明帶上打孔但尚未用于人胚檢查?？傊绾翁岣唢@微活檢技術(shù) 的準(zhǔn)確性及有效性還需進(jìn)一步研究。2如何避免PCR中等位基因的缺失及提高PCR的效率1985年P(guān)CR技術(shù)建立后，Handyside于1990年首先應(yīng)用

4、于臨床PGD，1994年Ray利用單細(xì)胞底 物以PCR診斷囊性纖維病(CF)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了等位基因的缺失現(xiàn)象(allele drop-out，ADO)，即 ：以單細(xì)胞底物診斷單基因缺陷病時(shí)，如在雜合子的單細(xì)胞中，兩個(gè)等位基因之一未被擴(kuò)增 。這是導(dǎo)致PGD誤診的主要原因。ADO在理論上由Navidi和Arnheim在1991年提出，1994年才 在臨床上引起足夠重視。Grifo在1994年、Verlinsky在1996年相繼報(bào)道過(guò)ADO導(dǎo)致誤診的病 例。Ray在診斷CFF508基因突變時(shí)，出現(xiàn)了25%的ADO率4。Levinson在1992年利 用多重PCR鑒定胎兒性別的研究中其ADO率是21%。最

5、低的ADO率是Storm在168個(gè)雜合子細(xì)胞的 擴(kuò)增中僅一個(gè)表現(xiàn)為ADO(0.6%)1。在原位PCR中，ADO的發(fā)生率也有12%5 。ADO發(fā)生的原因主要為：染色體嵌合體，尤其是除了具有二倍體細(xì)胞外，有些細(xì)胞是單 倍體時(shí)，易致誤診，減少這類誤診的唯一辦法是從1個(gè)囊胚中取2個(gè)細(xì)胞來(lái)分析。在操作前 溶細(xì)胞的方法對(duì)ADO率的影響較大，用強(qiáng)堿溶解，ADO率較低，Gitlin、Wu等用強(qiáng)堿和DTT及 蛋白酶K兩種方法溶細(xì)胞，然后用PCR診斷CFF508時(shí)，ADO率分別為10%和19%。PCR開始時(shí) 的變性溫度也非常關(guān)鍵，變性溫度分別為90、93、96時(shí)，用PCR診斷CFF508基因突 變時(shí)，ADO率依次

6、為21%、13%、5%6。此外，為了降低ADO率，除了上述嚴(yán)格的溶細(xì)胞條件、變性溫度外，許多學(xué)者建立了一些 新方法。Findlay提出熒光PCR，即PCR產(chǎn)物通過(guò)熒光標(biāo)記的引物被標(biāo)記上了熒光，較容易檢 測(cè) ，此項(xiàng)技術(shù)較常規(guī)PCR靈敏7，8。Sermon利用熒光PCR診斷CFF508突變，ADO率 僅5%，用常規(guī)PCR對(duì)比則為21%1。Kuliev9利用細(xì)胞的第一、二極體 診斷-地中海貧血時(shí)，從一個(gè)雜合子細(xì)胞中同時(shí)擴(kuò)增二個(gè)突變基因，如擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)為純 合子，則表明出現(xiàn)了ADO。Sermon又介紹了多態(tài)PCR：擴(kuò)增CFF508突變和其附近的具有多態(tài) 性的第六內(nèi)含子。根據(jù)兩個(gè)位點(diǎn)的一致性結(jié)果來(lái)做出診

7、斷是否出現(xiàn)了ADO，從而避免誤診 1。3FISH和原位PCRFISH運(yùn)用于PGD，首先是鑒別胎兒性別以避免性連鎖遺傳病的發(fā)生，因可 同時(shí)檢測(cè)X、Y染色體，準(zhǔn)確性較PCR高；其次可用來(lái)診斷染色體非整倍體。重要的是FISH可 以診斷復(fù)雜的染色體易位、轉(zhuǎn)位等畸變，但目前關(guān)于這方面的進(jìn)展不大，主要是卵裂球中期 核染色體不易獲得；且每例病人都要用一種特異的DNA探針，探針的制備又較繁雜，一般實(shí) 驗(yàn)室無(wú)法開展。針對(duì)這種情況，許多學(xué)者進(jìn)行了嘗試：Munne10用自第一極體中 獲得的涂染染色體去分析第一極體中的染色體易位。共檢測(cè)8例平衡易位攜帶者，其中5例已 妊娠，2例健康的新生兒娩出，使平衡易位攜帶者的流產(chǎn)

8、率從95%降到12.5%；Conn11 用點(diǎn)探針檢測(cè)羅伯遜易位攜帶者的非整倍體，亦獲得一定效果。但這兩種方法只能檢 測(cè)來(lái)自母體的易位情況，比較局限。湖南醫(yī)科大學(xué)介紹了一種新的探針標(biāo)記方法：直接對(duì)涂 染探針進(jìn)行PCR標(biāo)記，通過(guò)合適的PCR引物擴(kuò)增，把生物素滲入到被擴(kuò)增的DNA鏈中，該技術(shù) 縮短了探針制備的過(guò)程12。有專家預(yù)言：隨著DNA探針標(biāo)記技術(shù)、制備技術(shù)、雜 交結(jié)果及像分析技術(shù)的發(fā)展以及高分辨的FISH作技術(shù)、比較基因組雜交技術(shù)的問(wèn)世，F(xiàn)I SH會(huì)得到不斷創(chuàng)新和發(fā)展，尤其是染色體平衡易位的診斷將廣泛應(yīng)用于臨床，從而可大大提 高PGD的準(zhǔn)確性和IVF的成功率。為了進(jìn)一步提高以單細(xì)胞底物進(jìn)行PG

9、D的效率，Thornhill13提出了原位PCR： 在固定于載玻片上的同一個(gè)單細(xì)胞上，先用PCR原位擴(kuò)增，再用FISH檢測(cè)。該技術(shù)可使性別 鑒定、單基因病和染色體病的診斷同在一個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行，被稱為目前最先進(jìn)的技術(shù)。經(jīng)過(guò)一 段時(shí)間的探索和研究，目前PGD中應(yīng)用原位PCR時(shí)，PCR的有效率為65%，F(xiàn)ISH達(dá)85%。遺憾的 是Rechisty報(bào)道ADO率較常規(guī)PCR高。相信隨著引物設(shè)計(jì)及熒光PCR與原位PCR有效的結(jié)合，原 位PCR的不足會(huì)得到克服且可能逐步替代FISH在PGD中的作用。4結(jié)語(yǔ)經(jīng)過(guò)近10年的發(fā)展，利用PGD已能成功地診斷囊性纖維化病、-地中海貧血，馬凡綜合征 、Staeinert病

10、、1-抗胰蛋白酶缺乏病、Lesch-Nyhan綜合征等近50種單基因病及染色體 病。據(jù)美國(guó)的一項(xiàng)問(wèn)卷調(diào)查：PGD避免了流產(chǎn)的痛苦，倫理上易于接受。但在臨床應(yīng)用中，P GD仍有幾個(gè)問(wèn)題值得重視。首先，由于試管嬰兒成功率較低，妊娠率約20%，分娩率約10%， 而接受PGD的病人一般都有正常的生育率，故對(duì)他們而言臨床妊娠率低難以接受。其次，PGD 費(fèi)用昂貴，其研究工作主要集中在英美等發(fā)達(dá)國(guó)家，如何降低PGD的費(fèi)用，從而使PG D廣泛開展，也是亟待解決的的問(wèn)題。最后，PGD的歷史較短，對(duì)經(jīng)PGD而誕生的兒童的未來(lái) 健康 狀況，尚需長(zhǎng)時(shí)間隨訪。有理由相信，隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的日新月異，PGD的前景將是

11、 非常令人振奮的!作者單位：朱前勇(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院婦產(chǎn)科 重慶，400042)顏建華(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院婦產(chǎn)科 重慶，400042)參考文獻(xiàn)1,Willy Lissens ,Karen Sermon.Preimplantation genetic diagnosis:curre nt status and new developments.Hum Reprod,1997;12(80):17562,Reubinoff BE,Shushan A.Preimplantation diagnosis in older patients to biopsy or not to biops

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