BrdU標記在大鼠睪丸支持細胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用

1、BrdU標記在大鼠睪丸支持細胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用        【摘要】  目的: 探討大鼠睪丸支持細胞原代培養(yǎng)5溴2脫氧尿苷（BrdU）的最佳標記時間、 劑量。方法: 大鼠睪丸支持細胞進行體外原代培養(yǎng); 以終濃度分別為5、 10、 15、 20 mol/L的BrdU檢測睪丸支持細胞的最佳標記劑量; 在細胞培養(yǎng)的12、 24、 36、 48 h摻入BrdU, 使終濃度為15 mol/L, 測定BrdU的最佳標記時間; 免疫細胞化學法跟蹤觀察大鼠睪丸支持細胞在體外培養(yǎng)中的分化發(fā)育情況和BrdU標記率。結(jié)果:

2、免疫組化檢查提示最終濃度為15 mol/L和孵育36 h BrdU標記率均>90%, 并且連續(xù)傳3代均可檢測到。結(jié)論: 終濃度15 mol/L及孵育36 h為BrdU標記睪丸支持細胞的最佳劑量及時間, 表明BrdU 標記可用于睪丸支持細胞體內(nèi)后的存活、 生長的動態(tài)觀察。 【關(guān)鍵詞】  睪丸支持細胞 體外培養(yǎng) BrdU    5溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記法作為一種簡便、 敏感、 特異的檢測方法, 在醫(yī)學的各個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。BrdU摻入合成的強度可直接顯示細胞增殖的能力, 同時能避免以往應(yīng)用3HTdR檢測對細胞的放射性損害1。睪丸支持細胞缺

3、乏有效的標記方法, 因此本實驗的目的是應(yīng)用BrdU體外標記原代大鼠睪丸支持細胞（sertoli cell）, 觀察最佳標記時間及標記量, 從而為追蹤BrdU標記的睪丸支持細胞移植入體內(nèi)后的存活、 生長及分化的動態(tài)變化過程打下基礎(chǔ)。1  材料和方法1.1  材料 SD雄性大鼠（體質(zhì)量約100 g, 1722 日齡）購于第四軍醫(yī)大學動物試驗中心;  DMEMF12培養(yǎng)基、 優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Gibco公司, 膠原酶、 胰酶、 BrdU購自Sigma公司; 抗 BrdU抗體及SABC試劑盒均購自武漢博士德公司。1.2  方法取大鼠睪丸, 剝除被膜, 收

4、集睪丸實質(zhì)于50 mL離心管中, 4 900 r/min離心4 min, 傾去上清。按每克睪丸組織加8 mL 2.5 g/L胰蛋白酶, 32 210 r/min振蕩、 消化30 min。加入培養(yǎng)液終止消化, 待組織沉降后, 棄去上清。重復此步驟3次。再以每克睪丸組織加6 mL1 g/L 型膠原酶, 34 210 r/min振蕩, 消化30 min。用100目鋼篩過慮收集細胞, 900 r/min離心10 min, 收集細胞, 用含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液洗3次（900 r/min, 3 min）, 稀釋細胞至1.5×109/L, 接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶。34、 CO2培

5、養(yǎng)箱中50 mL/LCO2培養(yǎng)48 h, 于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況（圖1）, 吸去培養(yǎng)液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl緩沖液低滲處理3 min后, 用培養(yǎng)液洗滌2次, 洗去大部分生精細胞。加入含100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 逐日更換培養(yǎng)液并進行觀察。將培養(yǎng)的支持細胞用2.5 g/L胰酶消化并洗滌后, 接種到1個6孔板中, 并在6孔板中各孔加入1塊經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片, 將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 待細胞生長于載玻片后, 將載玻片取出, 在Carnoy中固定12 min。950 mL/L、 700 mL/L乙醇、 蒸餾水及鹽酸分步漂

6、洗; 置于60的1 mmol/L HCl 12 min后在冷鹽酸中漂洗; chiff試劑內(nèi)2 h; 入100  mL/L偏重亞硫酸鈉溶液除去非特異染色后, 經(jīng)自來水、 蒸餾水、 700 mL/L、 950 mL/L及1000 mL/L乙醇分步洗滌, 固綠染色; 顯微鏡下觀察并攝片（圖1）。收集培養(yǎng)68 d的支持細胞, 在25 g/L戊二醛固定液中預固定, 經(jīng)鋨酸后固定、 脫水、 包埋、 半薄切片定位、 超薄切片等步驟后, 在JEOL JEM1220透射顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。每日觀察細胞生長情況, 繪制大鼠睪丸支持細胞生長曲線。以1×105/L將睪丸支持細胞接種于爬片處理的

7、6孔板中, 并以終濃度分別為5、 10、 15、 20 mol/L的BrdU檢測睪丸支持細胞的最佳標記劑量; 在細胞培養(yǎng)的12、 24、 36、 48 h摻入BrdU, 使終濃度為15 mol/L, 測定BrdU的最佳標記時間; 設(shè)定正常對照組觀察BrdU有無細胞毒性。隨機數(shù)取10個非重疊視野（×100）, BrdU 陽性細胞占總細胞數(shù)的比例。具體步驟如下: （1）PBS清洗標本3 次各1 min; （2）40 g/L多聚甲醛固定30 min, PBS沖洗5 min, 3次; （3）30 mL/L H2O2于室溫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶30 min, PBS沖洗5 min, 3次; （4

8、）2N HCl于室溫下變性3045 min, 使其雙螺旋打開暴露BrdU標記部位。（5）120正常山羊血清封閉20 min, 甩去多余的液體不洗; （6）抗BrdU 一抗（130） 4濕盒中過夜、 PBS沖洗5 min, 3次; （7）山羊抗小鼠cy3孵育45 min, PBS漂洗3次, 每次3 min; （8）DAPI復染, 熒光倒置顯微鏡觀察（圖1）。以上每步間必須用PBS緩沖液充分振洗后方可繼續(xù)下一步驟。陽性對照為BrdU標記的睪丸支持細胞, 陰性對照為未經(jīng)BrdU標記的睪丸支持細胞, 空白對照以PBS替代一抗。各組BrdU 標記率的比較采用2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

9、2  結(jié)果2.1  睪丸支持細胞的傳代、 擴增與純化 單個睪丸支持細胞懸液接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶,支持細胞貼壁性比較強, 培養(yǎng)24 h之后, 大多數(shù)細胞開始貼壁, 培養(yǎng)液中漂浮著較多生精細胞。培養(yǎng)48 h之后, 胞質(zhì)逐漸增多, 折光性減弱。34 d后支持細胞胞質(zhì)鋪展, 細胞間隙變小。46 d后胞質(zhì)完全鋪開, 細胞相互連接, 鋪展成膜狀單層。吸去培養(yǎng)液后加入20 mmol/L, pH7.4的TrisHCl緩沖液低滲處理3 min后, 用培養(yǎng)液洗滌2次, 洗去大部分生精細胞。加入含50 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 逐日更換培養(yǎng)液并進行觀察。經(jīng)胰酶消化后1

10、2傳代, 培養(yǎng)48 h后, 支持細胞胞體進一步增大, 呈膜狀鋪在培養(yǎng)瓶壁上。細胞核圓形或橢圓形, 居中或稍偏位, 核仁清晰, 胞質(zhì)中可見較多的顆粒狀物質(zhì)或空泡, 突起進一步增多, 并密集交織在一起(圖1), 仍有少量的生精細胞存在; 隨著培養(yǎng)時間的延長, 培養(yǎng)到第34天后, 支持細胞融合成片, 折光性減弱。根據(jù)Moss等形態(tài)學及胞內(nèi)空泡的檢測, 支持細胞約占細胞總量的90%以上。Sertoli細胞在體外培養(yǎng)增殖旺盛, 培養(yǎng)至20 d細胞仍存活良好。2.2  Feulgen染色和透射電鏡觀察 對培養(yǎng)8 d的Sertoli細胞進行Feulgen染色（圖1）, 胞質(zhì)不著色, 核內(nèi)

11、淡染, 核內(nèi)有著色的顆粒, 為核仁周圍的衛(wèi)星核小體。透射電鏡下觀察細胞質(zhì)可見很多線粒體、 溶酶體、 脂滴、 糖原顆粒、 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。Sertoli細胞的核呈不規(guī)則形, 核膜具有較多的皺褶, 核染色質(zhì)稀疏, 染色淺, 核仁明顯, 核仁周圍有衛(wèi)星核小體。國外學者多強調(diào)觀察到核仁兩側(cè)的衛(wèi)星核小體, 可確定是支持細胞。Feulgen染色和電鏡都觀察到了衛(wèi)星核小體, 證實了確實為Sertoli細胞。1         2.3  BrdU標記率 以不同濃度標記發(fā)現(xiàn), 15 mol/L的Brd

12、U標記率>90%, 與20 mol/L的BrdU無統(tǒng)計學意義（P>0.05）, 與10 mol/L(LI約70%)有統(tǒng)計學意義（LI約75%, P<0.05）。不同孵育時間標記發(fā)現(xiàn),  孵育12 h即可見BrdU陽性染色細胞, 標記率約為12%; 隨著標記時間延長陽性細胞數(shù)增多, 標記36 h細胞陽率>90%。但標記時間繼續(xù)延長標記細胞數(shù)目無明顯增多, 標記36 h組與48 h組之間的陽性細胞數(shù)無統(tǒng)計學意義（圖2）。為此, 我們發(fā)現(xiàn)選用標記36 h、 終濃度為15 mol/L作為標記時間, 完全能夠滿足移植細胞的標記需要, 連續(xù)傳代3次后仍可見BrdU免疫染色

13、陽性。在相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、 生長、 增殖與對照組相比無統(tǒng)計學意義。3  討論    睪丸支持細胞是睪丸生精上皮中惟一的非生殖細胞, 對生精細胞起支持和營養(yǎng)作用2。近年來研究表明, 支持細胞還能分泌多種物質(zhì), 包括轉(zhuǎn)運蛋白, 調(diào)節(jié)蛋白, 生長因子, 類固醇及其他一些活性物質(zhì), 這些物質(zhì)在精子發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。另外對支持細胞生物特性的研究還揭示, 支持細胞表達一種特殊的表面分子FasL, 它可以與免疫細胞表面的Fas受體結(jié)合, 誘導免疫細胞的凋亡2, 故可利用睪丸支持細胞作為各種免疫豁免細胞來源, 可植入體內(nèi)發(fā)揮其免疫豁免作用, 但是體

14、內(nèi)細胞移植的眾多問題之一是如何簡便有效的標記移植細胞并跟蹤其在體內(nèi)的存活、 生長和分化過程3。細胞標記的方法有多種方法4, 當 BrdU存在于細胞DNA合成期的時候, BrdU就會摻入到新合成的DNA中, 這種存留是永久性的, 經(jīng)免疫組織化學染色可觀察在摻入細胞中的BrdU, 故BrdU標記和檢測是反映細胞增殖及跟蹤檢測移植細胞動態(tài)變化的理想指標3。研究表明, BrdU標記結(jié)合免疫細胞化學技術(shù)和 3HTDR放射自顯影技術(shù)2種方法的結(jié)果十分相似5。本試驗首次采用BrdU標記大鼠睪丸支持細胞, 并用抗BrdU mAb進行免疫細胞化學染色, 研究結(jié)果表明使用BrdU進行標記不會影響細胞的生長、 增殖

15、及分化, 故應(yīng)用BrdU標記細胞較為安全可靠。BrdU標記細胞48 h, 終濃度為15 mol/L, 時標記率>90%, 且傳代細胞可連續(xù)標記, 提示移植細胞可在體內(nèi)連續(xù)追蹤觀察。為我們進一步追蹤睪丸支持細胞植入體內(nèi)后的生長分化提供了理論指導。    通過本試驗我們BrdU標記大鼠睪丸支持細胞的優(yōu)點是6: （1）簡單、 快速、 安全檢測敏感性好; （2）BrdU即可用于活體標記, 亦可用于細胞原代培養(yǎng)與鑒定; （3）BrdU標記是一種快速、 簡便、 可靠的方法, 并可選擇適合的雙標記或多標記方法, 同時顯示2種以上的標記物質(zhì); （4）短時間內(nèi)可對批量試驗動物

16、的標本同時進行檢測; （5）使用BrdU對標記細胞、 活體細胞無毒副作用, 為動態(tài)觀察移植細胞在動物體內(nèi)的生存、 生長和分化過程提供了理論依據(jù)。 【】  1 李春暉, 焦保華, 康春生, 等. 骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)、 鑒定及標記的初步研究J. 細胞與分子免疫學雜志, 2006, 22(05): 601-602.2 于 磊, 王 禾. 睪丸支持細胞(sertoli細胞)與器官移植J. 國外醫(yī)學·泌尿系統(tǒng)分冊, 2001, 21（6）: 245-247.3 Kaminker P, Plachot C, Kim SH, et al. Higherorder nuclear

17、 organization in growth arrest of human mammary epithelial cells: a novel role for telomereassociated protein TIN2J. J Cell Sci, 2005, 118(3): 1321-1330.4 Staub C, Hue D, Nicolle JC, et al. The whole meiotic pocess can occur in vitro in untransformed rat spermatogenic cellsJ. Exp Cell Res, 2000, 260(1): 85-95.5 Kadiyala