CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達

1、CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達 作者：趙瓊 廖敏 丁維俊 李秀亮 瞿佳【摘要】 目的探討膽囊收縮素受體CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達及加減益胃湯對其表達的影響。方法借助特制飼料喂養(yǎng)幼齡厭食大鼠模型，采用RT-PCR技術(shù)檢測CCKB-R在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達，并觀察加減益胃湯對該模型CCKB-R表達的影響。結(jié)果正常大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中CCKB-R有低水平表達，特制飼料喂養(yǎng)造模后其表達水平異常增高，與空白對照組比較有極顯著的統(tǒng)計學意義（P0.001）；加減益胃湯高、中、低劑量組均能顯著抑制或下調(diào)CCKB-R的高表達，且有一定的量

2、-效趨勢。結(jié)論CCKB-R基因高表達可能是厭食發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)之一，抑制或下調(diào)CCKB-R基因表達可能是加減益胃湯厭食癥的主要作用靶點之一。 【關(guān)鍵詞】 膽囊收縮素受體；厭食Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on it.MethodsThe anorexia rat model was establisb

3、ed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.ResultsCompared with blank control, the expression of CCKB-R mRNA in anorexia

4、rats was significantly increased (P0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of CCKB-R mRNA as compared with model group(P0.001).ConclusionThe expression of CCKB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth muscle cells of the a

5、norexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.Key words：CCKB-R; Anorexia 近年來研究證實膽囊收縮素（CCK）等腦腸肽在小兒厭食癥的發(fā)病中起著重要的作用，但對其受體表達及進一步的分子信號轉(zhuǎn)導機制還不十分清楚。本研究在近年來中藥復方加減益胃湯治療小兒厭食癥取得良好

6、臨床療效和我們前期研究1的基礎(chǔ)上，借助特制飼料喂養(yǎng)幼齡厭食大鼠模型，對CCKB-R在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達及加減益胃湯對其表達的影響進行了初步研究?，F(xiàn)報道如下。1 材料與儀器2 方法2.1 分組及造模2.2 樣本提取與保存大鼠處死后，迅速剪取結(jié)腸中段, 生理鹽水洗盡血跡，去除黏膜層, 取肌層組織并置于液氮中保存待測。2.3 RTPCR檢測CCKB-R表達從美國國立衛(wèi)生院所維護的國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得最新版本的CCKB-R和內(nèi)參基因-actin的mRNA序列。利用引物設(shè)計專業(yè)軟件Primer Primier 5.0設(shè)計其引物。然后委托大連寶生物完成引物合成。將引物溶于去離子水之中，終

7、濃度調(diào)整為20 pmol/l，20保存?zhèn)溆?。CCKB受體引物：5-CTAAGAACGGTCACCAACG；3-GTGTAAGTAGAAGCCGTG。采用美國TriZol試劑(Cat NO: 15596-018)，按試劑盒提供的方法提取結(jié)腸中段組織中的總RNA，各組使用相同劑量的結(jié)腸中段組織總RNA。1.5%瓊脂糖電泳確定質(zhì)量與含量后，80保存?zhèn)溆谩? 按試劑盒說明程序進行，先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)合成cDNA。PCR儀進行CCKB-R擴增，取10 l cDNA反應液進行PCR。PCR的條件：變性：94預變性5 min，94變性1 min；退火：54，30 s；延伸72，30 s。30個循環(huán)后，72再延

8、伸10 min終止反應，4。CCKB-R PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳（電壓100 V，時間30 min），取出后于紫外線下觀察，利用凝膠成像系統(tǒng)分別測定擴增條帶的積分光密度值。比較各組CCKB-R相對光密度值并進行組間統(tǒng)計，判定CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細胞中的表達及加減益胃湯對其表達的影響。2.4 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)用SAS 軟件包處理，計量資料均以s表示。多組資料比較用方差分析，兩組資料比較用t檢驗。3 結(jié)果 見表1。表1 實驗各組對幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌組織CCKB-R mRNA表達的影響（略）表1所示，模型組CCKB-R mRNA表達與空白組比較有顯著差異（P0.

9、001）；與模型組比較，陽性藥組、加減益胃湯高劑量組、中劑量組、低劑量組均使結(jié)腸平滑肌組織CCKB-R mRNA表達下調(diào)（P0.001）；與陽性藥組比較，加減益胃湯各組下調(diào)CCKB-R mRNA表達程度高于陽性藥組，但差異不顯著；加減益胃湯各組間比較無顯著性差異（P0.05），但下調(diào)CCKB-R mRNA表達水平表現(xiàn)為高劑量組中劑量組低劑量組，有一定量-效關(guān)系趨勢。4 討論 膽囊收縮素（cholecystokinion, CCK）是一種廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的典型的腦腸肽，具有調(diào)節(jié)胃腸運動、消化液分泌、攝食、情緒、記憶等多種生理功能。研究結(jié)果已證實，小兒厭食癥的臨床表現(xiàn)與八肽膽囊收縮素（

10、CCK-8）等腦腸肽水平和胃腸運動功能狀態(tài)有著密切的關(guān)系。報道“病因模擬”厭食模型鼠中樞和外周CCK-8均顯著增高3，但CCK受體在厭食癥發(fā)病中的具體作用機制尚不十分清楚。 CCK對胃竇、幽門、小腸、膽囊平滑肌細胞有收縮作用，能增強膽囊收縮和小腸結(jié)腸的動力，且通過其受體及信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮其生理作用。通常認為CCK與胃腸平滑肌細胞膜上的CCK-B受體結(jié)合后使G蛋白活化，激活膜上的磷脂酶C（PLC）信號級聯(lián)，通過Ca2+-CaM途徑產(chǎn)生胃腸平滑肌細胞收縮。據(jù)此，本實驗研究中幼齡厭食大鼠模型結(jié)腸CCK-B受體基因較空白組表達顯著增高(P0.05), 提示幼齡厭食大鼠模型結(jié)腸CCK耦聯(lián)Ca2+-CaM

11、信號通過高度活化，受體上調(diào)，使胃腸平滑肌收縮增強。然而近年的研究表明，CCK 對進食后的胃排空有抑制作用。Wechsung 等4研究發(fā)現(xiàn),CCK通過舒張近端胃和提高幽門括約肌張力以及改變胃排空模式對胃排空發(fā)揮抑制作用。也有學者發(fā)現(xiàn)，即使是膽囊平滑肌收縮“正?！钡哪懩医Y(jié)石患者,其CCK 受體mRNA 表達亦顯著低于正常人5。因此本實驗特制飼料喂養(yǎng)幼齡大鼠后CCK受體表達上調(diào)，可能使胃腸平滑肌收縮異常，平滑肌處于緊張或痙攣狀態(tài)，胃排空抑制，胃腸運動減弱，排空減慢，進而產(chǎn)生飽脹感、厭食等。而加減益胃湯通過下調(diào)胃腸CCK-B受體基因表達，使高表達的CCK-B受體恢復正常，胃腸平滑肌緊張或痙攣狀態(tài)緩解，

12、胃腸運動恢復正常，從而達到厭食的目的。 我們推測，由于CCK-8對攝食的控制有兩種作用方式，一是腦組織分泌的CCK-8的中樞作用，二是腹迷走神經(jīng)傳入纖維介導的外周CCK-8的作用。而CCK 對消化管運動的調(diào)節(jié)有神經(jīng)介導和直接作用于平滑肌兩種途徑。CCK 直接作用于平滑肌, 因需較高濃度的CCK, 故認為只有較低的親和力。CCK 對消化管的調(diào)節(jié)被認為主要是以高親和力的神經(jīng)調(diào)節(jié)為主。因此，CCK對胃腸道平滑肌的作用主要依靠的是神經(jīng)調(diào)節(jié)。但由于生理狀態(tài)下體內(nèi)CCK 的作用濃度還不清楚，其他激素、神經(jīng)遞質(zhì)等與CCK在厭食發(fā)生中的相互作用影響又是怎樣的，CCK受體在厭食癥發(fā)病中的具體作用機制還需要我們進一步深入研究和探討?！疚墨I】 1趙瓊，徐世軍，崔敏俐.加減益胃湯治療小兒脾胃陰虛厭食癥的實驗研究J.成都中醫(yī)藥大學學報，2005,28（3）：15.2汪受傳,張月萍.特制飼料喂養(yǎng)幼齡大鼠建立小兒厭食模型J.南京中醫(yī)藥大學學報，1999，15（3）：148.3彭玉,吳高鑫.運脾散對厭食大鼠下丘腦和血漿CCK8的調(diào)節(jié)作用J.中醫(yī)兒科雜志，2007，3(2):20.4Wechsung E, Houvenag