纖維素酶最適反應(yīng)溫度的測定

1、本科學生實驗報告學號 104120434 姓名 穆志國 學院 生命科學學院 專業(yè)、班級 10生物技術(shù) 實驗課程名稱 纖維素酶最適反應(yīng)溫度的測定 指導教師及職稱 李俊俊 開課時間 2012 至 2013 學年 下 學期填報時間 2013 年 4 月 17 日一、實驗?zāi)康?、了解不同溫度條件對酶活性的影響2、掌握酶最適反應(yīng)溫度的測定方法二、實驗原理 溫度對酶促反應(yīng)速率的影響有兩方面：一方面，溫度升高可加快分子運動速率，提高分子碰撞概率，從而使反應(yīng)速率加快；另一方面，溫度升高可能使酶蛋白逐步變性而失活，從而降低酶促反應(yīng)速率。溫度對酶促反應(yīng)速率的影響是這兩方面作用的綜合結(jié)果。所以只有在某一溫度范圍內(nèi)時

2、，酶促反應(yīng)速率才會隨著溫度的升高而升高，達到最大反應(yīng)速率時的溫度稱為酶作用的最適溫度（Optimum Temperature）。 將其它條件（如酶濃度、底物濃度、pH、反應(yīng)時間等）固定在最適狀態(tài)，然后在一系列不同溫度條件下進行酶活力測定。繪制得到溫度酶活力曲線。 酶的最適溫度并不是酶的特征常數(shù)，受其它因素的影響。3、 實驗試劑1、檸檬酸鈉緩沖液，0.05mol/L pH4.（適用于酸性纖維素酶）2、磷酸緩沖液， 0.1mol/L pH6.0（適用于中性纖維素酶）3、CMC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0 ）4、DNS試劑（CMCA-DNS）5、纖維素酶液（ pH4.8和pH6.0）

3、4、 實驗儀器 1、分光光度計 2、沸水浴 3、恒溫水浴（100±0.1） 4、分析天平（感量0.1mg） 5、移液器 6、計時器 7、磁力攪拌器5、 實驗方法1、 本實驗在室溫至90之間選擇不同溫度測定酶活力，以找出纖維素酶在此條件下的最適溫度。2、 待測酶液制備 稱取固體纖維素酶1g，精確至0.1mg，用蒸餾水溶解，準確稀釋定容（使試樣液與空白液的吸光度之差落在0.20.5范圍內(nèi)，不在此范圍內(nèi)，酶液要進行重新稀釋），待測。3、測定步驟（1）取3支25mL刻度具塞試管（1支做空白管，2支做樣品管）。（2）分別向3支管中準確加入用相應(yīng)pH緩沖液配制的CMC-Na溶液2.00mL 注意

4、：加入CMC-Na溶液時應(yīng)緩慢，不可粘在試管壁上。（3）分別準確加入稀釋好的待測酶液0.5mL于2支樣品管中（空白管不加） 用渦旋混合器混勻。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可順 著試管壁加入）（4）將3支試管同時置于不同溫度水浴中，準確計時，反應(yīng)30min，取出。（5）迅速準確地向3支管中加入3mLDNA試劑（加液順序和加酶液順序相同以保證反應(yīng)時間相同），振蕩搖勻，于空白管中準確加入稀釋好的待測酶液0.5mL，搖勻。將3支管同時放入沸水浴中，準確計時，煮沸10min取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25mL。（6）以空白管調(diào)零，在分光光度計540nm波長下，用1cm比色皿，分別測量2支

5、樣品管中樣液的吸光度OD值，分別記為ODE1、ODE2 ，取二者平均值。帶入標準曲線方程計算酶活力。注意：不同溫度指室溫、30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 4、纖維素酶酶活力計算纖維素酶酶活力（U/g）=(K×平均OD+b) ×N / 0.5×0.5式中： K標準曲線的斜率b標準曲線的截距N試樣的總稀釋倍數(shù)0.5反應(yīng)酶液的體積，mL0.5反應(yīng)時間，h酶活力的計算值保留3位有效數(shù)字注意：同一試樣兩個平行測定值的相對偏差在±8%以內(nèi)，二 者的平均值為最終的酶活力測定值。5、葡萄糖標準曲線圖一:葡萄糖標準曲線（注：在前面的實驗中

6、已經(jīng)測得，可以沿用前面中實驗所得的結(jié)果）6、 實驗結(jié)果（1）、實驗所測得的數(shù)據(jù)溫度（）平均OD值平均OD值（PH=4.8）平均OD值（PH=6.0）室溫（約為26）0.22050.0685300.28450.2475400.28300.340500.38300.2205600.39550.189700.50250.145800.4390.089900.0820.049表一：在不同溫度條件下，當PH值分別為4.8和6.0是測得的吸光度注：當溫度為50和60時，使用的酶液稀釋倍數(shù)為10000倍，而其它的溫度時刻，稀釋的倍數(shù)都是為5000倍（2） 、應(yīng)用公式進行計算酶活，可以得到下表當Ph=4.8時

7、 溫度（）酶活（u/ml)室溫（約為26）2025.12302834.08402815.12508158.24608474.24705589.6804786.9690274.48表二：PH=4.8時，不同溫度下的酶活當PH=6.0時溫度（）酶活（u/ml)室溫（約為26）103.84302366.4403535.6504050.24603253.92701070.880362.9690-142.64表二：PH=6.0時，不同溫度下的酶活為更直觀的表示，纖維素酶在不同溫度下的變化，做出如下散點圖圖二：不同溫度下的酶活力的變化（3） 、實驗結(jié)果分析、由圖二可以看出，當PH為4.8時比PH=6.0時酶的活力更高，說明在偏酸性的時候，纖維素酶的活力更強；、由圖二可以看出，隨溫度的變化，酶的活力呈正態(tài)分布，溫度過低時酶的活力較低，而溫度過高時酶的活力也會變低，甚至失活；、由圖二可以看出，當PH=4.8時，溫度為60時，為纖維素酶的最適酶活力溫度；、由圖二可以看出，當PH=6.0時，溫度為50時，為纖維素酶的最適酶活力溫度；（4） 、實驗總結(jié) 通過本實驗，在不同的溫度條件下纖維素的酶活，讓我們掌握了變溫對酶活力的影響，同時也對溫度對酶活力的影響有一個直觀的了解。同時在實驗中需