各突變檢測(cè)方法比較

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí)，RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí)，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個(gè)條鏈，突變檢出率只有30，如同時(shí)分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于1-2kb的大片段進(jìn)行檢測(cè)，并能確定突變位點(diǎn)。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對(duì)未知突變進(jìn)行分析。電泳法（不能

2、確定突變位點(diǎn)，都要通過測(cè)序等解決）2、變性梯度凝膠電泳（DGGE）雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長(zhǎng)度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來。一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)

3、域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加達(dá)到其最低的解鏈區(qū)域濃度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈。當(dāng)濃度度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域濃度時(shí)，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到變性劑濃度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域濃度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA 完全解鏈。如果不同DNA 片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時(shí)，這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問題。含有GC 夾子的DNA 片段最高的解鏈區(qū)域在GC 夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC

4、 夾子后，DNA 片段中基本上每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。3、 PCR-SSCP法 單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)是一種分離核酸的技術(shù)，可以分離相同長(zhǎng)度但序列不同的核酸（性質(zhì)類似于DGGE和TGGE，但方法不同）。實(shí)驗(yàn)步驟利用PCR從提取出的DNA中擴(kuò)增16S rRNA基因。利用-外切核酸酶消化掉一條鏈（其中一個(gè)PCR引物被磷酸化，這條鏈將被去除）。 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。 應(yīng)用：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性可用于預(yù)篩選克隆文庫?？蓪?duì)其中的某一個(gè)條帶進(jìn)行測(cè)序，并與數(shù)據(jù)庫中已知序列比對(duì)。原理：?jiǎn)捂?/p>

5、DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使是一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)并引起在非變性電泳條件不同的電泳遷移率。4、雜合雙鏈分析法(HA)由突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一個(gè)凸起,在非變性膠中電泳時(shí),會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率,從而使兩者被分離開。該方法原理與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)相似,只不過SS-CP分離的是單鏈,而HA法分離的是雙鏈。HA法簡(jiǎn)單迅速,但只適用于200300pb的片段,且不能確定突變位置,檢出率只有80%左右,有人建議將HA法和SSCP法聯(lián)合使用,可能將檢出率提高到接近100%,也有科研工作者建

6、議使用缺失的野生型等位基因來提高該方法的靈敏度。5、化學(xué)切割錯(cuò)配(CCM)化學(xué)切割錯(cuò)配是在Maxam-Gilbert測(cè)序的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)突變檢測(cè)技術(shù),在DNADNA或DNARNA異源雜合雙鏈核酸分子中,錯(cuò)配的C能被羥胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,錯(cuò)配的T能被四氧化鋨(Osmiumtetroxide)所切割,切割產(chǎn)物跑變性膠電泳即可確定是否存在突變。只要操作得當(dāng),不會(huì)發(fā)生非特異性切割,如果對(duì)正義鏈和反義鏈都進(jìn)行分析,可使檢出率達(dá)到100%;使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)將會(huì)大大增強(qiáng)該方法的靈敏度,從而可檢測(cè)出十個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)突變細(xì)胞。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)長(zhǎng)至2kb

7、的片段分析,并能確定突變位置,缺點(diǎn)是步驟多,費(fèi)時(shí),且需接觸有毒的化學(xué)物質(zhì)。6、碳化二亞胺檢測(cè)(Carbodiimide,CDI)與CCM法相似,CDI能夠?qū)﹀e(cuò)配的G和T進(jìn)行修飾,當(dāng)用標(biāo)記的引物對(duì)CDI修飾過的雙鏈DNA進(jìn)行DNA合成時(shí),延伸會(huì)在修飾過的堿基處終止下來,合成產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測(cè)出是否有突變。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)也是能對(duì)12kb的片段進(jìn)行分析,突變檢出率達(dá)到100%,能確定突變位置,并且CDI是一種沒有毒性的物質(zhì),有報(bào)道曾用該法檢測(cè)出了7.2kbDNA片段中的一個(gè)點(diǎn)突變,但當(dāng)一個(gè)DNA片段中存在多個(gè)突變時(shí),該方法就不適用。7、酶促切割錯(cuò)配(EnzymeMismatchC

8、leavage,EMC)EMC是一種與RNaseA切割相類似的方法。T4核酸內(nèi)切酶 是一種分解酶(resolvase),能夠識(shí)別12種錯(cuò)配的堿基并在錯(cuò)配堿基的附近進(jìn)行切割，酶切產(chǎn)物跑變性膠或中性膠即可檢測(cè)出是否有突變，電泳產(chǎn)物的檢測(cè)可用放射自顯影，也可用銀染。由于該法能對(duì)DNADNA異源雜合分子進(jìn)行分析，因而省去了體外轉(zhuǎn)錄的步驟，其最長(zhǎng)檢測(cè)片段可達(dá)到1.5kb，該法的缺點(diǎn)是存在非特異性切割現(xiàn)象，并且對(duì)有些錯(cuò)配堿基的識(shí)別不是100%，因此在每次檢測(cè)時(shí)都必須設(shè)有一個(gè)內(nèi)對(duì)照。8、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism , RFLP)連瑣

9、分析技術(shù)RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長(zhǎng)度的差異，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取用限制性內(nèi)切酶酶切DNA用凝膠電泳分開DNA片段把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（）和結(jié)果分析。其檢測(cè)特點(diǎn)是：具有較高的特異性，可以確定突變的部位及性質(zhì)，重復(fù)性好。但不足之處是僅適合于多態(tài)性的檢測(cè)：即突變頻率大于1%才能被檢測(cè)到；因此，RFLP分析對(duì)于檢測(cè)突變的早期，尤其是在野生型遠(yuǎn)多于突變型時(shí)其敏感性就顯得不足了。發(fā)展：反向限制性位點(diǎn)突變分析（iRSM），

10、進(jìn)行低突變頻率等位基因的檢測(cè)。其方法主要用于突變?cè)缙诘臋z測(cè)，當(dāng)某一野生型序列發(fā)生突變導(dǎo)致原有酶切位點(diǎn)（E1位點(diǎn)）的消失，產(chǎn)生一新的酶切位點(diǎn)（E2位點(diǎn)），稱之為E1E2突變，但突變頻率較低常規(guī)RFLP無法檢測(cè)。此時(shí)，用一內(nèi)切酶(E1)對(duì)其進(jìn)行酶切，這樣可選擇性地移去大部分的野生型序列（>99%）。無酶切位點(diǎn)的部分通過PCR擴(kuò)增（引物被設(shè)計(jì)在E2位點(diǎn)的一側(cè)），產(chǎn)物用另一內(nèi)切酶（E2）進(jìn)行RFLP分析，根據(jù)產(chǎn)物中是否存在E2位點(diǎn)即可判斷有無突變發(fā)生。由于該方法在RFLP分析之前用另一種內(nèi)切酶對(duì)靶序列進(jìn)行消化，減少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突變序列的檢出率。值

11、得注意的是：只要選擇適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，此項(xiàng)技術(shù)適應(yīng)于任何基因、突變或生物體。但是，由于聚合酶的關(guān)系，可能在PCR擴(kuò)增后導(dǎo)致iRSM分析出現(xiàn)假陽性。這可以通過使用高保真聚合酶進(jìn)行修正；同時(shí)為了提高檢出率，iRSM分析可于其它分析技術(shù)聯(lián)合使用或增加目的基因的含量。9、切割片段長(zhǎng)度多態(tài)性(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技術(shù)是在限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)和SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因突變檢測(cè)技術(shù)，其原理是:雙鏈DNA變性后形成的單鏈在中性條件下形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(包含多個(gè)折疊的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)),正如SSCP一樣,這種二級(jí)結(jié)構(gòu)取決于DNA

12、的核苷酸組成和順序,即使有一個(gè)堿基的差異,也會(huì)形成不同數(shù)目的折疊狀發(fā)夾結(jié)構(gòu),而CleavaseI外切酶能識(shí)別這種發(fā)夾結(jié)構(gòu),并在該結(jié)構(gòu)的附近進(jìn)行切割,切割產(chǎn)物跑變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè),突變的DNA將出現(xiàn)與正常對(duì)照不同的酶切圖譜。10、PCR-ELISA結(jié)合微測(cè)序檢測(cè)點(diǎn)突變（PCR-ELISA & mini-sequencing） 新近有報(bào)道稱：使用PCR-ELISA結(jié)合微測(cè)序檢測(cè)到無臨床癥狀且未經(jīng)抗病毒藥物治療的乙肝患者HBV基因的YMDD主題突變區(qū)存在天然Lamivudine耐藥基因。其檢測(cè)原理如下：探針結(jié)合區(qū)野生型HBV基因序列：5-739ATA CGG744 A-3, 針對(duì)突變區(qū)域

13、設(shè)計(jì)的探針，Wild-Probe: 5-ATA CGG-3；Val-Probe: 5- ATG TIG-（針對(duì)741742位點(diǎn)突變，743位點(diǎn)設(shè)計(jì)擺動(dòng)配對(duì)）；Ile-Probe: 5-ATA TAG-3、5-ATA TCG-3、5-ATATCG-3（針對(duì)743位點(diǎn)突變）。變性的擴(kuò)增產(chǎn)物與上述3種類型探針雜交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微測(cè)序緩沖液55溫育。如果Val或Ile探針與靶DNA完全匹配，探針3末端延伸一個(gè)帶標(biāo)記的腺嘌呤。反之，不匹配時(shí)，探針Tm降低，3末端游離而不延伸標(biāo)記的腺嘌呤。利用鏈酶親和素酶標(biāo)系統(tǒng)檢測(cè)探針上標(biāo)記的生物素，可判斷樣品中是否存在點(diǎn)突變。

14、而近期我們所進(jìn)行的點(diǎn)突變檢測(cè)是基于PCR-ELISA和雜交鏈穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要是利用野生型和突變型序列與探針結(jié)合后在Tm值上的差異進(jìn)行檢測(cè)。 近年來隨著新技術(shù)、新材料的不斷涌現(xiàn)，已知基因單位點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)將會(huì)得到迅速的發(fā)展，從而距離理想的突變掃描方法（即：對(duì)大片段DNA進(jìn)行突變掃描，100%的檢出率，無假陽性或假陰性現(xiàn)象，不需復(fù)雜的設(shè)備、花費(fèi)低、不需使用有害試劑和同位素、高效率、耗時(shí)短。）越來越近。 11、變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）優(yōu)點(diǎn)：高通量檢測(cè)、自動(dòng)化程度高、靈敏度和特異

15、性較高、檢測(cè)DNA片段和長(zhǎng)度變動(dòng)范圍廣、相對(duì)價(jià)廉等。在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。DHPLC高度自動(dòng)化，可以自動(dòng)取樣，檢測(cè)每個(gè)樣品只需要8分鐘左右。DHPLC與其他檢測(cè)DNA突變方法的最大不同在于，它能夠純化DNA片斷。當(dāng)然，只能檢測(cè)雜合突變是DHPLC的不足之處，但是這可以利用混合的方法（即將純合突變樣品和野生型樣品混合）來解決。在很多的研究中，DHPLC色譜

16、圖有改變的樣本經(jīng)測(cè)序均顯示DNA有變異；在我們的前期工作中曾用該方法檢測(cè)了大量樣本，特異性及敏感性均接近100%，提示該方法是一種高效、可靠的突變檢測(cè)方法。該方法的不足之處是無法得出具體的突變位點(diǎn)及突變類型，還需DNA測(cè)序方法證實(shí)。12、DNA測(cè)序(Sequencing)由各種突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到的突變最后都得由測(cè)序來確定突變類型及突變位置,而且測(cè)序法檢測(cè)突變的效率達(dá)到100%。但缺點(diǎn)是花費(fèi)昂貴,所以對(duì)一些較大的,外顯子較多的基因不宜用測(cè)序法直接檢測(cè)突變,同時(shí)也不適用于臨床對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),此外,測(cè)序也不能被當(dāng)成是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測(cè)序

17、獲得精確的數(shù)據(jù)。Sanger法測(cè)序：利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠

18、片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。13、雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)由于SSCP檢測(cè)方法的靈敏度受到電泳溫度、PCR片段大小等因素的影響,而直接DNA測(cè)序的方法又費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢，因此有研究工作者在實(shí)際應(yīng)用中將SSCP和Sanger雙脫氧測(cè)序法結(jié)合起來形成一種新的突變檢測(cè)方法,即ddF。該方法的基因原理是:將PCR產(chǎn)物回收純化后用兩個(gè)引物分別做Sanger雙脫氧測(cè)序反應(yīng),但不同的是僅加入一種雙脫氧終止劑,反應(yīng)產(chǎn)物跑中性聚丙烯酰胺凝膠電泳如果確有突變的話,在病人的電泳圖譜上將會(huì)丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會(huì)發(fā)生改變。在ddF方法中,DNA鏈的遷

19、移率不僅取決于其二級(jí)結(jié)構(gòu),而且與其大小相關(guān),因而較SS-CP法更為靈敏。MartincicD等曾經(jīng)將SSCP法和ddF法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)ddF能將10種已知的p53抑瘤基因突變?nèi)繖z測(cè)出來,而SSCP法只能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)到10種突變中的6種。ddF法的靈敏度不受電泳溫度的影響,所能檢測(cè)的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度也能達(dá)到近500bp,并且該法還能對(duì)突變位置進(jìn)行相對(duì)定位。該法的主要缺點(diǎn)是需要使用同位素,同時(shí)對(duì)回收的PCR產(chǎn)物純度要求較高,非特異的PCR產(chǎn)物將嚴(yán)重影響到最后結(jié)果的分析。14、寡核苷酸連接分析法(oligonucleotide ligati

20、on assay，OLA)該技術(shù)使用1對(duì)標(biāo)記的探針，其中1條探針3'端包含等位基因特異性堿基。先用PCR擴(kuò)增包含HPA基因SNP位點(diǎn)的基因片段，然后探針和擴(kuò)增的等位基因片段互補(bǔ)結(jié)合，在DNA連接酶的作用下，2條探針連接形成一個(gè)雙標(biāo)記的產(chǎn)物。這個(gè)雙標(biāo)記產(chǎn)物的一端連于固相表面，另一端的標(biāo)記物作為指示物，可以用ELISA方法檢測(cè)。該法快速、可靠，可以用于大量樣本的基因分型，但是OLA法也需要一些PCR后的操作，需要序列特異性探針。15、熔解曲線分析法：染料法和FRET法 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理的熔解曲線分析法是羅氏公司的專利技術(shù)。FRET法使用2個(gè)探針，一條探針橫跨HPA（血小

21、板特異性抗原）的SNP位點(diǎn)，稱為檢測(cè)探針。另一條探針與第一條探針相距15個(gè)堿基稱為錨定探針。兩條探針互相鄰近的3'端和5'端分別標(biāo)記上熒光物質(zhì)FITC和LightCycler Red 640。在PCR過程中，兩條探針和擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，熒光物質(zhì)FITC和LightCycler Red 640相互靠近。FITC受激發(fā)產(chǎn)生熒光，又激發(fā)Red640，使其發(fā)出波長(zhǎng)為640的熒光，通過檢測(cè)器檢測(cè)熒光信號(hào)。在PCR反應(yīng)后，降低體系溫度到探針退火的溫度以下，然后緩慢提高溫度，檢測(cè)探針發(fā)生解鏈從模板脫離，產(chǎn)生1個(gè)熔解曲線。如果檢測(cè)探針和靶基因完全互補(bǔ)，將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)較高的解鏈溫度（Tm），如果發(fā)生錯(cuò)

22、配將會(huì)產(chǎn)生1個(gè)較低的Tm，依據(jù)Tm的不同而將其分離。但該方法需要特殊的儀器LightCycler熒光定量PCR儀。除了使用FRET技術(shù)之外，還可以使用DNA熒光染料作為熒光的來源，通過擴(kuò)增子或未標(biāo)記探針的熔解分析法來進(jìn)行基因分型。Liew等使用該法對(duì)HPA進(jìn)行了基因分型并和FRET探針法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這2種方法的一致性達(dá)98.8。Liew等進(jìn)一步的研究表明，使用擴(kuò)增子的熔解分析法在分析長(zhǎng)片段的擴(kuò)增子時(shí)，存在一定的錯(cuò)誤率，而使用未標(biāo)記探針的結(jié)果則是完全準(zhǔn)確的。這種點(diǎn)突變分析技術(shù)的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化程度較高，易于推廣?；跓晒馊玖系娜劢夥治龇o需價(jià)格昂貴的熒光標(biāo)記的雙雜交探針，而且每一個(gè)反應(yīng)

23、體系可以同時(shí)鑒定HPA兩個(gè)系統(tǒng)的等位基因，比FRET探針法更有優(yōu)勢(shì)。但是其需要特殊的熔解分析儀以及一種特殊的DNA熒光染料。16、PyrosequencingPyrosequencing是對(duì)短到中等長(zhǎng)度的DNA序列樣品進(jìn)行高通量的、精確和重復(fù)性好的分析的技術(shù)。第一步測(cè)序引物和PCR擴(kuò)增的、單鏈的DNA模板雜交，與酶DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）和底物adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、熒光素（luciferin）孵育。

24、 第二步四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模板配對(duì)（AT，CG），此dNTP與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來。注意：反應(yīng)時(shí)deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因?yàn)镈NA聚合酶對(duì)dATPS的催化效率比對(duì)dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。第三步ATP硫酸化酶在APS存在的情況下催化焦磷酸形成ATP，ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素（oxyluciferin）的轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)。ATP su

25、lfurylasePPi+APS > ATPLuciferase，ATPLuciferin > oxyluciferin     光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)并由軟件pyrogram反應(yīng)為峰。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第四步ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。第五步然后加入下一種dNTP。    在以上步驟循環(huán)進(jìn)行中，互補(bǔ)DNA鏈合成，序列從pyrogram的信號(hào)峰中決定。     利用PSQ96系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序分析可

26、期望得到20-30個(gè)堿基的讀序長(zhǎng)度，但是和任何測(cè)序技術(shù)一樣，最大讀序長(zhǎng)度取決于模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)、堿基組成、PCR產(chǎn)物質(zhì)量和其他參數(shù)。最佳化的Pyrosequencing    Pyrosequencing反應(yīng)利用的是酶級(jí)連系統(tǒng)，簡(jiǎn)單且強(qiáng)有力，給出陽性或陰性結(jié)果，每種成份和參數(shù)已最佳化，以得到高度一致的結(jié)果，精確度為99%。* 底物濃度已最佳化* 選擇了Apyrase的特異濃度，保證了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS* dNTP降解速率慢于摻入速率，有利于dNTP充分摻入* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP濃度和光產(chǎn)生正比于摻入的dNTP 數(shù)目

27、* 仔細(xì)控制的試劑，保證了足夠的活性和質(zhì)量待測(cè)序模扳制備    通過PCR技術(shù)將待測(cè)序列擴(kuò)增，其中引物之一在合成時(shí)用生物素標(biāo)記。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于擴(kuò)增的DNA中，DNA分子通過引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成復(fù)合體。DNA變性后，帶生物素標(biāo)記引物的單鏈在磁場(chǎng)中得到純化，然后就可用于與測(cè)序引物退火，以便進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。PSQ 96系統(tǒng)系統(tǒng)工作流程1, 基因組DNA提取2, 設(shè)計(jì)和合成PCR引物，其中之一標(biāo)記生物素; PCR反應(yīng)3，DNA雙鏈的分離，含生物素的單鏈DNA與測(cè)序引物的退火4，對(duì)含生物素的單鏈DNA的測(cè)序/基于測(cè)序的

28、SNP分析及等位基因頻率確定PSQ96系統(tǒng)包含了進(jìn)行上述工作（3-4）的儀器及配件、軟件、試劑，系統(tǒng)的設(shè)計(jì)滿足高通量、快速、精確和經(jīng)濟(jì)的要求。Pyrosequencing技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)在于Pooling，適用于大規(guī)模的等位基因頻率分析，但需要特殊的儀器，硬件成本高；17、等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)（allele-specific PCR或 amplification , ASPCR或ASA） ASPCR是一項(xiàng)在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新方法，通過PCR和凝膠電泳即可檢測(cè)出DNA中各種點(diǎn)突變。 ASPCR的基本構(gòu)思是設(shè)計(jì)2個(gè)ASO引物，使之與另一引物構(gòu)成PCR反應(yīng)體系。這2個(gè)引物與探針的ASO不同，等位基因特異性堿基不是位于ASO中間，而是置于引物的3端。這種設(shè)計(jì)是基于耐熱Taq DNA聚合酶缺乏35外切校正活性的特點(diǎn)。引物3端的特異堿基分別互補(bǔ)于野生型和突變型等位基因的相對(duì)堿基，若此堿基對(duì)形成錯(cuò)配，鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3,5-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，故此法又稱擴(kuò)增受阻突變體系（amplification refractory mutation system , ARMS）。其擴(kuò)增結(jié)果為：“野生”模板阻礙,“突變”引物放大；或“突變”模板阻礙,“野生”引物放大。 ASPCR點(diǎn)突變的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶DNA錯(cuò)配時(shí)可能發(fā)生的錯(cuò)配延伸，這可通過調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如：引物