樹脂型PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒操作方法

1、樹脂型 PCR 產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒操作方法一從反響液中回收 PCR產(chǎn)物1將0.4ml純化樹脂使用前充分混勻與50100卩l(xiāng)無石蠟油的PCR反響液 顛倒混勻 3 分鐘。然后裝入離心純化柱， 13,000rpm 離心 30 秒，倒掉收集管 中的廢液。2. 參加500卩l(xiāng) 80瞬丙醇或乙醇，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢 液。重復(fù)第 2步一次，此步驟 13,000rpm 離心 2分鐘，務(wù)必將異丙醇或乙醇 除盡。如果離心純化柱上還殘留有異丙醇或乙醇，13,000rpm再離心1分 鐘。3. 將離心純化柱套入干凈的 1.5ml 或 2ml 離心管中，開蓋放置 23分鐘，使殘 留的乙醇充

2、分揮發(fā)干凈。參加50卩l(xiāng) TE緩沖液假設(shè)用于測序，那么加50 1超純 水于純化樹脂上，不能粘在管壁上。放置2分鐘后，13,000rpm離心30秒。 TE緩沖液或超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。離心柱放入離心管中， 假設(shè)蓋不上蓋子，亦沒有關(guān)系，可開蓋離心。4. 離心管中的液體即是純化的 PCF產(chǎn)物，取4卩1電泳0.8%瓊脂糖，120V, 10 分鐘檢測并目測定量。-20 C保存?zhèn)溆?。二從普通瓊脂糖凝膠中回收 DNA片段1將無石蠟油的PCR反響液或酶切反響液50卩l(xiāng)100卩l(xiāng)反響體系在1%勺普 通瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的 DNA條帶裝入2ml離心管中。盡量切掉不含DNA勺瓊脂糖凝膠，這樣可

3、簡化操作、提高回收量及DNA片段的質(zhì)量。2. 200mg400m瓊脂糖凝膠中參加0.4ml純化樹脂使用前充分混勻，70C保 溫 510 分鐘，每兩分鐘顛倒混勻 1 次，使瓊脂糖凝膠完全融化。對于高濃度的瓊脂糖凝膠2%，每200mg的瓊脂糖凝膠中參加0.5ml純化 樹脂，加熱融膠的時間延長到 15分鐘。3將混和液轉(zhuǎn)移入離心純化柱，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。4. 參加500卩I 80瞬丙醇或乙醇，13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢 液。重復(fù)第4步一次，此步驟13,000rpm離心2分鐘，務(wù)必將異丙醇或乙醇 除盡。如果離心純化柱上還殘留有異丙醇或乙醇，13,000

4、rpm再離心1分 鐘。5. 將離心純化柱套入干凈的1.5ml或2ml離心管中，開蓋放置23分鐘，務(wù)必 使乙醇充分揮發(fā)干凈，參加40卩I TE緩沖液假設(shè)用于測序，那么加40卩1超純水 于純化樹脂上，不能粘在管壁上。放置 2分鐘后，13,000rpm離心30秒。TE緩沖液或超純水的用量視用戶對濃度的要求而定。離心柱放入離心管中， 假設(shè)蓋不上蓋子，亦沒有關(guān)系，可開蓋離心。6. 離心管中的液體即是純化的 DNA片段，取4卩1電泳0.8%瓊脂糖，120V, 10 分鐘檢測并目測定量。-20 C保存?zhèn)溆?。常見問題及參考意見常見問題可能原因參考意見回收率低瓊脂糖膠塊未完全融化盡量切掉不含DNA勺瓊脂糖凝膠4

5、00卩I的純化樹脂中不要超過400mg® 脂糖凝膠增加溫育時間至15分鐘，每2分鐘混勻 一次瓊脂糖凝膠濃度過高配制0.8%1.0%勺瓊脂糖凝膠進行回收某些瓊脂糖凝膠不容易被融化更換瓊脂糖，情況可能會變好純化樹脂于GS結(jié)合液中有 結(jié)晶出現(xiàn)將純化樹脂于GS結(jié)合液中置于37C 溫浴30min以上，使結(jié)晶完全溶解，且在 使用前要充分混勻洗脫溫度過低參加無菌超純水或TE浸透樹脂后，于37 T溫育2分鐘回收片段過大或過小最適宜的回收片段為200bp5Kb回收的DNA片 段在后續(xù)實 驗中出現(xiàn)問 題例如連接 失敗鹽的濃度過高用80%L醇漂洗回收產(chǎn)物增加漂洗次數(shù)殘留有有機試劑增加離心時間，將80%醇或異丙醇去 除干凈EB染色須在紫外線下切膠，紫 外線的照射損傷了 DNA片段在長波紫外線下切膠盡量縮短切膠時間建議用其它 DNA染料代替EB 例如GoodView?染料，在自然光下切膠在膠里和電泳緩沖液中參加 DNA紫外防 護劑局部雙鏈DNA變性為單鏈DNA在進行后續(xù)酶反響時，參加除酶以外的 其它成份，通過95C 2分鐘，再緩慢冷 卻至室溫25E以下，使單鏈DNA重新 退火為雙鏈DNA然后參加酶，繼續(xù)進 行酶反響用含有10mM NaC的Tri