反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進展

1、反義核酸技術(shù)及其在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用進展    反義核酸是指能與特定mRNA精確互補、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達，使之低表達或不表達，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)1-3。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調(diào)節(jié)作用因子，在抑制一些有害基因的表達和失控基因的過度表達上發(fā)揮著重要作用。隨著反義核酶技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應(yīng)用于抗某些人體寄生蟲病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點作一簡要概述，著重闡述其在寄生蟲領(lǐng)域中的應(yīng)用進展。 1反義核酸的作用原理反義核酸目

2、前有三種來源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應(yīng)用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類，其中以PSAON應(yīng)用最廣泛。ANO設(shè)計合成簡單，只要其順序與靶mRNA部分順序互補即可，而對基因的讀碼框無要求；二是更具有實用價值的工人表達載體，包括單個基因和多個基因的聯(lián)合反義表達載體3，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動子和終止子之間，通過轉(zhuǎn)錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前分離純化尚存在困

3、難。1.1反義RNA和反義DNA反義RNA是指能和mRNA完全互補的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補結(jié)合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過mRNA的翻譯和基因DNA的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用10：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過與靶mRNA結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mRNA結(jié)合，另一方面其與mRNA結(jié)合后激活內(nèi)源性RNase或ribozyme，降解mRNA3；2)抑制轉(zhuǎn)錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈延長3。此外，反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后

4、mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mRNA由細胞核向細胞漿內(nèi)運輸。1.2核酶Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲核糖體RNA前體在成熟過程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱之為核酶11,12。核酶廣泛存在于生物細胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結(jié)構(gòu)。酶活性中心由兩個臂和中間的功能區(qū)組成13。兩個臂序列高度保守，與靶RNA特異互補結(jié)合，相當(dāng)于一種反義RNA，而功能區(qū)則可通過降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過程中并不消耗。核酶裂解分子依賴嚴格的空間結(jié)構(gòu)形成，裂解部位總是位于靶RNA

5、分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3'端12。核酶除天然存在外，也可人工合成。根據(jù)核酶的作用位點、靶mRNA周圍的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工設(shè)計合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動子下游，通過轉(zhuǎn)錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達，特別是阻斷有害基因的表達成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達載體的適當(dāng)位置，這樣轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有十分誘人的

6、前景，第一個應(yīng)用核酶進行艾滋病基因治療的臨床計劃已獲準，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。2反義核酸的作用特點反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統(tǒng)藥物相比具有諸多優(yōu)點。1)高度特異性：反義核酸藥物通過特異的堿基互補配對作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導(dǎo)彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變?nèi)f化，不可窮盡。3)高效性：直接阻止疾病基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設(shè)計：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應(yīng)用基因的天然順序信息，實際上是最合理的藥物設(shè)計。5)低毒、安全：反義核酸尚未發(fā)現(xiàn)其有顯著毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時間有

7、長有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。3反義核酸技術(shù)在寄生蟲學(xué)中的應(yīng)用反義核酸技術(shù)的飛速發(fā)展和成熟，使其逐漸滲透并應(yīng)用到寄生蟲學(xué)領(lǐng)域，豐富和發(fā)展了寄生蟲病的基因治療策略。反義核酸技術(shù)在抗寄生蟲病研究的應(yīng)用主要集中于原蟲類，如瘧原蟲、錐蟲和利什曼原蟲等，而且反義核酸中又以AON方面的報道最多。下面著重就AON在寄生蟲方面的研究應(yīng)用作用一簡要闡述。3.1瘧原蟲 瘧原蟲嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即無從頭合成途徑，依靠補救合成途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤或嘌呤核苷。瘧原蟲的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶

8、(thymidylate synthase，TS)結(jié)合形成雙功能蛋白(DHFR-TS)，這對于維持瘧原蟲四氫葉酸水平和DNA合成極為重要14，此酶也是瘧原蟲脫氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶?？汞懰幹械目谷~酸代謝藥如乙胺嘧啶，就是通過競爭性抑制DHFR-TS來阻斷蟲體脫氧胸苷酸生物合成15。然而，隨著惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)多藥抗性株的出現(xiàn)和廣為傳播，瘧疾的化療面臨重大挑戰(zhàn)，促使人們尋求新的抗瘧療法。目前，DHFR-TS是AON抗瘧作用首選靶基因。生物大分子進入感染紅細胞中的瘧原蟲，必需穿透三層膜，即紅細胞膜、納蟲泡膜和蟲體的胞質(zhì)膜。研究表明，不能穿透紅細

9、胞膜和納蟲泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗體和蛋白A等，可經(jīng)過納蟲微管(parasitophorous duct)進入蟲體，蟲體通過胞吞作用直接從細胞外攝入大分子物質(zhì)16。因此，對于小分子的AON而言，作用于感染紅細胞中的蟲體完全成為可能，下述眾多研究已充分證明了這一點。Rapaport等(1992)研究發(fā)現(xiàn)17，以DHFR-TS為靶21 nt PS AON能選擇性地進入惡性瘧原蟲感染紅細胞，對體外培養(yǎng)的氯喹敏感株和耐藥株蟲體具有同等的抑制效果，而未感染瘧原蟲的紅細胞則完全為不攝入AON，因此這對應(yīng)用反義核酸于抗瘧治療非常有利。諸多研究表明，AON越長，對轉(zhuǎn)譯的抑制作用就越強；AON濃度越高

10、，非特異性抑制作用越明顯，在低濃度時則呈特異性抑制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA為靶合成系列AON，利用兔網(wǎng)織紅細胞翻譯系統(tǒng)，探討AON對體外轉(zhuǎn)譯的抑制作用18。在DHFR翻譯起始位點處合成了6條2149nt不等長的AON，在TS編碼區(qū)全成的30nt、39nt和49nt三條AON。當(dāng)AON長度為30nt或更長時，呈明顯轉(zhuǎn)譯抑制作用，抑制率可高達50以上。其中，TS編碼區(qū)的49nt aON(OTS49)抑制效果最高，當(dāng)濃度在45mlo/L時的抑制率幾乎達90，主要是因為OTS49與DHFR-TS靶mRNA結(jié)合抑制TS合成，這從翻譯產(chǎn)物的分子量(55

11、kDa)要比天然DHFR-TS(71 kDa)小且無TS活性可看出。Ramasamy等和Clark等研究表明，在較高濃度下，無論DHFR-TS正義還是反義的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵紅細胞19,20。究其原因，可能與高濃度的AON帶有較多的負電荷有關(guān)。Kanagaratnam等(1998)分析了瘧原蟲裂殖子表面蛋白基因的反義和正義寡聚核苷酸對瘧原蟲體外生長的影響21，無論AON單獨使用抑或與脂質(zhì)體混合使用，均未觀察到特異抑制效應(yīng)。但在相同濃度范圍內(nèi)，反義和正義寡核苷酸以及具有多聚陰離子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵紅細胞。當(dāng)寡聚核苷與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后負電荷被中和時，則

12、對裂殖子入侵紅細胞的抑制作用被取消。由此推測，寡聚核苷酸有可能借助其多聚陰離子特性干擾裂殖子與細胞上受體結(jié)合，多聚陰離子可能對瘧疾病治療有幫助。最近，Barker等以DHFR-TS基因為靶，比較了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修飾AON，以及不同空間結(jié)構(gòu)AON對體外培養(yǎng)蟲體生長抑制作用22。結(jié)果顯示，5'和3'端至少含有3個PS基因的PO-PS雜合體AON、全部為PS修飾的AON，與部分PS修飾的AON抑制作用相同。在低濃度下(1mol/L)，PO-PS aON和PS AON比PS-甲基化AON抑制率高25。此外，通過延長AON序列增加干-環(huán)結(jié)構(gòu)形成，提高AO

13、N的自我穩(wěn)定性，結(jié)果獲得2個有干-環(huán)結(jié)構(gòu)的AON(RB39、RB41)，其抑蟲生長率比序列未延長的AON約要高20。AON對不同基因的抑制作用不一致，這和該基因在蟲體代謝過程中是否起舉足輕重作用密切相關(guān)14。AON的抗瘧研究主要集中在DHFR-TS基因，這固然與其在瘧原蟲核苷酸代謝中的特殊地位有關(guān)(見前述)。Barker等(1996)對惡性瘧原蟲耐藥株多個靶基因的AON作用進行了比較研究23，方法是將PS aON加入到瘧原蟲體外培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48小時后，通過鏡檢和3氚-次黃嘌呤摻入試驗觀察AON對蟲體的生長抑制作用。結(jié)果表明，抑制作用與AON濃度密切相關(guān)。當(dāng)AON濃度為1mol/L時，AON呈

14、非特異性抑制；當(dāng)濃度在0.50.005mol/L范圍時，以DHFR-TS、二氫喋呤合成酶、核苷酸還原酶、裂殖體多基因家族和紅細胞結(jié)合抗原-175為靶的PS aON與對照組相比，均能特異地顯著抑制蟲體生長(P0.0001)，而DNA聚合酶的PS aON抑制作用更弱，磷酸丙糖異構(gòu)酶的PS AON抑制作用則與對照組相同。瘧原蟲感染紅細胞中，近75血紅蛋白被滋養(yǎng)體降解而形成大量對蟲體有害的血紅素，必須在消化泡中聚集成對蟲體無毒的瘧色素24,25。研究表明，惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRP和HRP有明顯的促進瘧色素形成功能26。因此，如能特異阻斷這些基因表達，抑制瘧色素的形成，有可能使之

15、成為一種抗瘧新途徑。HRP與HRP從同一祖先基因分化而來，二者高度同源，翻譯起始位點附核苷酸序列則完全相同27,28。3.2錐蟲屬于動基體目的布氏錐蟲(Trypanosoma burcei)通過抗原不斷變異逃避宿主的免疫力，抗原變異是由于不同的變異體專一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG)基因呈間斷表達所致，VSG基因表達產(chǎn)物在錐蟲表面形成外膜，覆蓋蟲體29,30。研究表明，VSG mRNA可分為二部分31,32：一部分是各種變異體特有的主外顯子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外顯子序列，通常為35個核苷酸長，幾乎所

16、有的VSG mRNA均含有此序列。實際上，除VSG外，錐蟲的鈣調(diào)蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖異構(gòu)酶mRNA中也存在共同的5'端小外顯子序列，這似乎是動基體目寄生原蟲編碼基因的共同結(jié)構(gòu)特征32。由于宿主mRNA無這種小外顯子序列，以小外顯子序列為靶的AON就很容易實現(xiàn)抑制眾多基因表達的效果，使反義核酸抗錐蟲感染成為可能。Cornelissen等應(yīng)用麥胚提取物轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)、35S-甲硫氨酸摻入試驗和蛋白質(zhì)SDS-PAGE方法33，對與錐蟲小外顯子序列不同位點互補和不同長度的AON體外轉(zhuǎn)譯抑制作用進行了比較分析。結(jié)果所有AON均能抑制轉(zhuǎn)錄，且抑制程度與AON長度和濃度有關(guān)，AON越長，濃度越高則抑制

17、作用越強。如3個12nt和AON抑制率達3560，而22nt和34nt aON在濃度為1530mol/L時對錐蟲總RNA轉(zhuǎn)錄抑制率高達95100。在同一轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，BMV病毒(Brome mosaic Virus)和無小外顯子序列的錐蟲磷酸甘油酸激酶mRNA卻完全不受34 nt AON的抑制，與錐蟲小外顯子序列不互補的18 nt AON對錐蟲轉(zhuǎn)譯則無任何影響。上述發(fā)現(xiàn)充分證明，以錐蟲5'端小外顯子mRNA序列為靶的AON對轉(zhuǎn)譯具有特異抑制作用。Walder等用兔網(wǎng)織紅細胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，也獲得上述相類似的結(jié)果31。Verspieren等研究表明34，小外顯子AON的二級結(jié)構(gòu)和堿基的修飾會直接影響其與靶mRNA的親和性，從而間接影響AON的轉(zhuǎn)譯抑制效果。如上述與小外顯子第2位至第13位堿基互補的12nt aON，雖然抑制布氏錐蟲轉(zhuǎn)譯，但不能抑制活動錐蟲(Trypanosoma vivax)mRNA轉(zhuǎn)譯，這顯然與二種蟲體的小外顯子第3位和第7位堿基不同有關(guān)。Verspieren等首次嘗試用吖啶衍生物(acridine derivative)修飾布氏錐蟲5'端小外顯子序列的AON，觀察