SPR技術(shù)和ITC技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用

1、SPR技術(shù)和ITC技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用摘要生物大分子的活性是通過不同分子或相同分子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域中，單純解析生物大分子的結(jié)構(gòu)已不能滿足現(xiàn)代科研的基本要求，所以研究其生物學(xué)功能受到了越來越多的重視。本文主要介紹現(xiàn)在常用的SPR技術(shù)和ITC技術(shù)以及它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞SPR技術(shù)ITC技術(shù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)前言結(jié)構(gòu)生物學(xué)是前個(gè)世紀(jì)后半葉才蓬勃發(fā)展起來的重要學(xué)科，通過研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間結(jié)構(gòu)，可以為生物大分子發(fā)揮生理功能的機(jī)理提供關(guān)鍵解釋1。生物分子之間的相互作用奠定了生物生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，因此研究生物分子之間的相互作用可以在分子水平上更加精

2、細(xì)地闡述生物反應(yīng)發(fā)生的機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)2。關(guān)于蛋白質(zhì)相互作用的檢測手段已有很多，但是其缺點(diǎn)也很明顯。SPR（表面等離子共振）生物傳感技術(shù)作為一種新興的光學(xué)生物化學(xué)檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)的生化分析方法相比，具有無需標(biāo)記、靈敏準(zhǔn)確、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)檢測等優(yōu)點(diǎn)3。止匕外，在生物體中的各種生物分子之間的相互作用并不像化學(xué)反應(yīng)那樣劇烈。通過熱力學(xué)研究，它能夠在結(jié)合機(jī)制的闡明中起重要作用，為藥物的設(shè)計(jì)提供合理的理論模型4。為了研究分子間弱的相互作用力，ITC（等溫滴定量熱分析）技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生，它在生物熱力學(xué)模型的建立、蛋白質(zhì)和配體的結(jié)合以及表面活性劑和聚合物的相互作用中都扮演了關(guān)鍵角色。SPR技術(shù)

3、SPR（表面等離子共振）是指在光波的作用下，在金屬和電介質(zhì)的交界面上形成的改變光波傳輸?shù)闹C振波6。在介質(zhì)（一般為玻璃）表面涂上一層金屬薄膜（一般為金屬），入射光在界面處發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)，產(chǎn)生的消逝波滲透到金屬薄膜內(nèi)，可以激發(fā)金屬表面等離子體使之產(chǎn)生等離子波。當(dāng)入射光的入射角和波長在某一適當(dāng)值時(shí)，表面等離子波與消逝波的頻率和波數(shù)相等，此時(shí)兩者將發(fā)生共振，入射光能量被吸收，反射光強(qiáng)大幅度減弱，可以從反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線看到一個(gè)最小的尖峰，此為共振峰，對(duì)應(yīng)的入射角為SPR角2。SPR角隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合的分子的質(zhì)量成正比。當(dāng)目標(biāo)分子結(jié)合到傳感器表面時(shí)（圖1）,能夠

4、引起SPR角度的變化，我們可以通過檢測諧振角、諧振波長或諧振強(qiáng)度的變化來反應(yīng)生物分子之間的相互作用7。7"ranucIionsignal圖1光學(xué)無標(biāo)記生物傳感器插圖7SPR的實(shí)驗(yàn)方法：將需要檢測的分子鍵合到生物傳感器的芯片上（該步驟可以委托公司完成），然后將蛋白分子溶液以恒定的流速流過芯片表面。如果檢測的分子能夠與與蛋白分子相互作用，那么生物傳感器表面的質(zhì)量便會(huì)增加，改變傳感器表面折射率，從而使共振角度發(fā)生改變。折射率每變化1000RU,那么表示芯片表面每平方毫米有1納克的質(zhì)量發(fā)生改變網(wǎng)?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的表面等離子共振傳感器有Biacore系列，它們的光學(xué)檢測部件一般包括光源、T

5、M波偏振器、棱鏡、檢測芯片、信號(hào)檢測器這六個(gè)大的部分（圖2）。光源發(fā)出的光經(jīng)過透鏡后，能產(chǎn)生平行的光束，透過棱鏡，再檢測芯片上質(zhì)量的改變情況，最后的反射光經(jīng)過各級(jí)的檢測器、放大器進(jìn)行處理，在記錄儀上顯示其變化情況。通過系統(tǒng)自帶的計(jì)算軟件，計(jì)算反應(yīng)的平衡常數(shù)、解離常數(shù)。圖2光學(xué)SPR傳感系統(tǒng)SPR在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用SPR技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，比如藥物代謝分析，生物檢測,免疫檢測、蛋白質(zhì)功能分析等。下面，主要介紹一下SPR在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的最新應(yīng)用和成果。DemeJC等9利用SPR技術(shù)研究了人類溶酶體維生素B12的兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子LMBD1和ABCD4功能的結(jié)合特性，實(shí)驗(yàn)表明：LMBD1和

6、ABCD4有低納摩爾親和相互作用；細(xì)胞質(zhì)維生素B12進(jìn)程蛋白MMACHC與LMBD1和ABCD4也有低納摩爾親和相互作用。LandryJP等10報(bào)道了一個(gè)使用SPR技術(shù)，利用高通量的方法測量單克隆抗體的親和力。他們測量了超過1410種兔的單克隆抗體和46種小鼠的單克隆抗體的親和常數(shù)，實(shí)驗(yàn)測得的親和常數(shù)變化范圍在10200pM之間，平均值在66pM。這一實(shí)驗(yàn)，為單克隆抗體在疾病的診斷和試劑的研究提供了基礎(chǔ)。HuangY等11使用SPR研究了RGD-水蛭素與凝血酶的結(jié)合常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RGD-水蛭素的六個(gè)突變體與凝血酶的Kd值高于野生型，這個(gè)發(fā)現(xiàn)有助于新型的RGD-水蛭素與凝血酶的相互作用的理

7、解。等溫滴定量熱法等溫滴定量熱法（IsothermalTitrationCalorimetry,ITC）是根據(jù)熱效應(yīng)隨時(shí)間變化特征確定化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為的一種先進(jìn)的現(xiàn)代測量技術(shù)。在類似于化學(xué)滴定的過程中，通過測量滴定過程中分子之間熱量的釋放和吸收，跟蹤化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)熱量隨著時(shí)間的變化而變化12,ITC技術(shù)提供了一個(gè)快速、精確地測量分子相互作用的實(shí)驗(yàn)方法13。在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中，ITC技術(shù)能夠測定分子之間的親和力常數(shù)K,化學(xué)計(jì)量數(shù)N、始變H以及反應(yīng)嫡變SoITC實(shí)驗(yàn)儀器重要由主機(jī)和控制器組成?？刂破鳛榘惭b有控制軟件的電腦，主機(jī)包括塔臺(tái)，樣品注射器，測量池、樣品池以及清洗單元等部件組成（圖3）。40微升

8、的注射器中裝配體小分子，樣品池為蛋白樣品（對(duì)ITC200型號(hào)的樣品池，工作體積為200微升，但是需要向樣品池中加入280微升的樣品），參比池中通常加入等體積的水。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，系統(tǒng)給樣品池和參比池一個(gè)能量，保證兩個(gè)池子中的溫度相等。當(dāng)注射器中的配體與樣品結(jié)合的時(shí)候，其產(chǎn)生或者吸收了熱量，使兩個(gè)池中的溫度平衡被打破。這時(shí)系統(tǒng)通過減少能量供給或者增加能量輸入，保證兩個(gè)池中的溫度達(dá)到平衡，輸出的數(shù)據(jù)即為系統(tǒng)的能量變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過每次滴定過后能量變化的情況，用origin軟件進(jìn)行擬合計(jì)算。關(guān)于C值。C值的定義是C=樣品池濃度N/D準(zhǔn)確的濃度定量與滴定實(shí)驗(yàn)一樣重要。如果C值太低，始變小和化學(xué)計(jì)量比

9、N將不準(zhǔn)確；小分子實(shí)驗(yàn)卻通常不得不采用低的C值；假如C值太低，可以通過提高樣品池濃度來對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)證明，如果樣品池中濃度超過其KD值的2-10倍時(shí)，低C值的滴定是可靠的7。但是，一旦C值過高，由于沒有足夠的數(shù)據(jù)點(diǎn)描述綜合的飽和過程，因此由數(shù)據(jù)擬合得到的K值不準(zhǔn)確。合適的C值帶來理想的擬合曲線。當(dāng)C值在10-100之間時(shí)，我們認(rèn)為這是一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)條件。圖3ITC實(shí)驗(yàn)裝置圖2ITC在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子不論它們的分子間或分子內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)，在反應(yīng)過程中總會(huì)伴隨著一定程度的熱量變化，這在很大程度上為ITC技術(shù)在它們的研究中提供了理論基礎(chǔ)。從最新的研究進(jìn)展來看，ITC

10、技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-小分子相互作用，蛋白質(zhì)-核酸相互作用等各方面的研究中。王雪松等14總結(jié)了ITC在淀粉樣蛋白的研究中的一些基本成果。比如使用ITC對(duì)AB纖維的形成機(jī)理進(jìn)行了解釋，認(rèn)為AB在聚集過程中從具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)轉(zhuǎn)化為以&折疊形態(tài)起始的纖維是一個(gè)二態(tài)過程；使用ITC證明質(zhì)膜可以使AB的聚集加快；通過測定金屬離子與AB的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了銅離子與AB結(jié)合的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)各自的解離常數(shù)進(jìn)行了計(jì)算。楊少梅等15研究了人血清白蛋白與抗癌藥紫杉醇的相互作用，使用ITC技術(shù)，計(jì)算了兩者結(jié)合的始變、嫡變，化學(xué)計(jì)量數(shù)等一系列數(shù)值，說明二者的非特異性結(jié)合

11、有利于紫杉醇在血液中的運(yùn)輸與交換，為紫杉醇在血液中的運(yùn)輸提供理論支持。楊炳君16使用ITC技術(shù)與光譜學(xué)技術(shù)結(jié)合，研究了谷胱甘肽包被的CdTe量子點(diǎn)與血清白蛋白、過氧化氫酶以及銅/鋅-SOD的相互作用，表明CdTe量子點(diǎn)與這三種蛋白質(zhì)是以疏水作用力結(jié)合，且結(jié)合后的兩種抗氧化酶類催化功能未受到影響AndrasiM等17使用各種不同的方法研究抗人白蛋白單克隆抗體和其抗原蛋白之間的相互作用，實(shí)驗(yàn)表明由ITC獲得的解離常數(shù)數(shù)值與使用ACE（一種研究分子結(jié)合的方法）獲得的值是一致的。BrathU等18在研究鈣調(diào)蛋白中與麻醉劑七氟醴的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，使用了ITC去測量它們之間的親和力。實(shí)驗(yàn)表明，七氟醴在同與鈣離

12、子結(jié)合的鈣調(diào)蛋白作用時(shí)，有低的親和力，然而當(dāng)缺乏鈣離子時(shí)，它們之間沒有相互作用。除此之外，ITC還用在其他許多研究領(lǐng)域。比如馮雪等19采用等溫滴定量熱法考察了益氣復(fù)脈凍干干粉針與VC注射液及5%的葡萄糖注射液之間的相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)產(chǎn)生了的能量變化大小，益氣復(fù)脈凍干干粉與VC注射液的反應(yīng)屬于化學(xué)反應(yīng)范疇，而益氣復(fù)脈凍干干粉與葡萄糖注射液的反應(yīng)屬于擴(kuò)散引起的物理變化。討論與展望以上兩種實(shí)驗(yàn)研究方法因其優(yōu)越性已經(jīng)越來越多地用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究之中，但是，以上兩種方法也有各自的問題需要解決。SPR技術(shù)待測的分子只局限于大分子，小分子會(huì)對(duì)其造成嚴(yán)重的誤差；對(duì)于金屬芯片的要求也比較嚴(yán)格；不能消除

13、非特異性結(jié)合帶來的影響。ITC技術(shù)很少能夠與其他儀器聯(lián)合，缺乏特異性，對(duì)樣品組成要求很高。兩種技術(shù)共有的問題是這兩種儀器都很昂貴，成本較高。以上這些缺點(diǎn)都限制了它們的發(fā)展。我們有理由相信，在今后的研究中，隨著這這兩種技術(shù)越來越完善，它們的應(yīng)用必將得到更多的發(fā)展，其前景也會(huì)越來越廣闊。參考文獻(xiàn)1王宏偉.冷凍電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的現(xiàn)狀與展望J.中國科學(xué):生命科學(xué),2014,10:1020-10282孫小婷，靳嵐，凌沛學(xué).表面等離子共振和等溫滴定量熱技術(shù)及其在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用J.藥物生物技術(shù)，2012,06:540-5453孟慶石，勞文燕，潘映紅.表面等離子共振生物傳感器技術(shù)及在生命研

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