SPR技術和ITC技術在結構生物學中的應用

1、SPR技術和ITC技術在結構生物學中的應用摘要生物大分子的活性是通過不同分子或相同分子之間的相互作用來實現(xiàn)其生物學功能。在結構生物學研究領域中，單純解析生物大分子的結構已不能滿足現(xiàn)代科研的基本要求，所以研究其生物學功能受到了越來越多的重視。本文主要介紹現(xiàn)在常用的SPR技術和ITC技術以及它們在結構生物學中的應用。關鍵詞SPR技術ITC技術結構生物學前言結構生物學是前個世紀后半葉才蓬勃發(fā)展起來的重要學科，通過研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的空間結構，可以為生物大分子發(fā)揮生理功能的機理提供關鍵解釋1。生物分子之間的相互作用奠定了生物生命現(xiàn)象的基礎，因此研究生物分子之間的相互作用可以在分子水平上更加精

2、細地闡述生物反應發(fā)生的機理，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)2。關于蛋白質(zhì)相互作用的檢測手段已有很多，但是其缺點也很明顯。SPR（表面等離子共振）生物傳感技術作為一種新興的光學生物化學檢測技術，與傳統(tǒng)的生化分析方法相比，具有無需標記、靈敏準確、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)檢測等優(yōu)點3。止匕外，在生物體中的各種生物分子之間的相互作用并不像化學反應那樣劇烈。通過熱力學研究，它能夠在結合機制的闡明中起重要作用，為藥物的設計提供合理的理論模型4。為了研究分子間弱的相互作用力，ITC（等溫滴定量熱分析）技術便應運而生，它在生物熱力學模型的建立、蛋白質(zhì)和配體的結合以及表面活性劑和聚合物的相互作用中都扮演了關鍵角色。SPR技術

3、SPR（表面等離子共振）是指在光波的作用下，在金屬和電介質(zhì)的交界面上形成的改變光波傳輸?shù)闹C振波6。在介質(zhì)（一般為玻璃）表面涂上一層金屬薄膜（一般為金屬），入射光在界面處發(fā)生全內(nèi)反射時，產(chǎn)生的消逝波滲透到金屬薄膜內(nèi)，可以激發(fā)金屬表面等離子體使之產(chǎn)生等離子波。當入射光的入射角和波長在某一適當值時，表面等離子波與消逝波的頻率和波數(shù)相等，此時兩者將發(fā)生共振，入射光能量被吸收，反射光強大幅度減弱，可以從反射光強響應曲線看到一個最小的尖峰，此為共振峰，對應的入射角為SPR角2。SPR角隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結合的分子的質(zhì)量成正比。當目標分子結合到傳感器表面時（圖1）,能夠

4、引起SPR角度的變化，我們可以通過檢測諧振角、諧振波長或諧振強度的變化來反應生物分子之間的相互作用7。7"ranucIionsignal圖1光學無標記生物傳感器插圖7SPR的實驗方法：將需要檢測的分子鍵合到生物傳感器的芯片上（該步驟可以委托公司完成），然后將蛋白分子溶液以恒定的流速流過芯片表面。如果檢測的分子能夠與與蛋白分子相互作用，那么生物傳感器表面的質(zhì)量便會增加，改變傳感器表面折射率，從而使共振角度發(fā)生改變。折射率每變化1000RU,那么表示芯片表面每平方毫米有1納克的質(zhì)量發(fā)生改變網(wǎng)。現(xiàn)在實驗室廣泛使用的表面等離子共振傳感器有Biacore系列，它們的光學檢測部件一般包括光源、T

5、M波偏振器、棱鏡、檢測芯片、信號檢測器這六個大的部分（圖2）。光源發(fā)出的光經(jīng)過透鏡后，能產(chǎn)生平行的光束，透過棱鏡，再檢測芯片上質(zhì)量的改變情況，最后的反射光經(jīng)過各級的檢測器、放大器進行處理，在記錄儀上顯示其變化情況。通過系統(tǒng)自帶的計算軟件，計算反應的平衡常數(shù)、解離常數(shù)。圖2光學SPR傳感系統(tǒng)SPR在結構生物學中的應用SPR技術在生命科學領域都有著廣泛的應用，比如藥物代謝分析，生物檢測,免疫檢測、蛋白質(zhì)功能分析等。下面，主要介紹一下SPR在結構生物學上的最新應用和成果。DemeJC等9利用SPR技術研究了人類溶酶體維生素B12的兩個轉運子LMBD1和ABCD4功能的結合特性，實驗表明：LMBD1和

6、ABCD4有低納摩爾親和相互作用；細胞質(zhì)維生素B12進程蛋白MMACHC與LMBD1和ABCD4也有低納摩爾親和相互作用。LandryJP等10報道了一個使用SPR技術，利用高通量的方法測量單克隆抗體的親和力。他們測量了超過1410種兔的單克隆抗體和46種小鼠的單克隆抗體的親和常數(shù)，實驗測得的親和常數(shù)變化范圍在10200pM之間，平均值在66pM。這一實驗，為單克隆抗體在疾病的診斷和試劑的研究提供了基礎。HuangY等11使用SPR研究了RGD-水蛭素與凝血酶的結合常數(shù)。實驗結果表明，RGD-水蛭素的六個突變體與凝血酶的Kd值高于野生型，這個發(fā)現(xiàn)有助于新型的RGD-水蛭素與凝血酶的相互作用的理

7、解。等溫滴定量熱法等溫滴定量熱法（IsothermalTitrationCalorimetry,ITC）是根據(jù)熱效應隨時間變化特征確定化學反應動力學行為的一種先進的現(xiàn)代測量技術。在類似于化學滴定的過程中，通過測量滴定過程中分子之間熱量的釋放和吸收，跟蹤化學反應的反應熱量隨著時間的變化而變化12,ITC技術提供了一個快速、精確地測量分子相互作用的實驗方法13。在單個實驗中，ITC技術能夠測定分子之間的親和力常數(shù)K,化學計量數(shù)N、始變H以及反應嫡變SoITC實驗儀器重要由主機和控制器組成?？刂破鳛榘惭b有控制軟件的電腦，主機包括塔臺，樣品注射器，測量池、樣品池以及清洗單元等部件組成（圖3）。40微升

8、的注射器中裝配體小分子，樣品池為蛋白樣品（對ITC200型號的樣品池，工作體積為200微升，但是需要向樣品池中加入280微升的樣品），參比池中通常加入等體積的水。實驗開始時，系統(tǒng)給樣品池和參比池一個能量，保證兩個池子中的溫度相等。當注射器中的配體與樣品結合的時候，其產(chǎn)生或者吸收了熱量，使兩個池中的溫度平衡被打破。這時系統(tǒng)通過減少能量供給或者增加能量輸入，保證兩個池中的溫度達到平衡，輸出的數(shù)據(jù)即為系統(tǒng)的能量變化情況。實驗結果是通過每次滴定過后能量變化的情況，用origin軟件進行擬合計算。關于C值。C值的定義是C=樣品池濃度N/D準確的濃度定量與滴定實驗一樣重要。如果C值太低，始變小和化學計量比

9、N將不準確；小分子實驗卻通常不得不采用低的C值；假如C值太低，可以通過提高樣品池濃度來對實驗進行優(yōu)化。實驗證明，如果樣品池中濃度超過其KD值的2-10倍時，低C值的滴定是可靠的7。但是，一旦C值過高，由于沒有足夠的數(shù)據(jù)點描述綜合的飽和過程，因此由數(shù)據(jù)擬合得到的K值不準確。合適的C值帶來理想的擬合曲線。當C值在10-100之間時，我們認為這是一個很好的實驗條件。圖3ITC實驗裝置圖2ITC在結構生物學中的應用蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子不論它們的分子間或分子內(nèi)的生物化學反應，在反應過程中總會伴隨著一定程度的熱量變化，這在很大程度上為ITC技術在它們的研究中提供了理論基礎。從最新的研究進展來看，ITC

10、技術已經(jīng)被廣泛的應用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-小分子相互作用，蛋白質(zhì)-核酸相互作用等各方面的研究中。王雪松等14總結了ITC在淀粉樣蛋白的研究中的一些基本成果。比如使用ITC對AB纖維的形成機理進行了解釋，認為AB在聚集過程中從具有二級結構的狀態(tài)轉化為以&折疊形態(tài)起始的纖維是一個二態(tài)過程；使用ITC證明質(zhì)膜可以使AB的聚集加快；通過測定金屬離子與AB的結合，發(fā)現(xiàn)了銅離子與AB結合的兩個結合位點，并對這兩個位點各自的解離常數(shù)進行了計算。楊少梅等15研究了人血清白蛋白與抗癌藥紫杉醇的相互作用，使用ITC技術，計算了兩者結合的始變、嫡變，化學計量數(shù)等一系列數(shù)值，說明二者的非特異性結合

11、有利于紫杉醇在血液中的運輸與交換，為紫杉醇在血液中的運輸提供理論支持。楊炳君16使用ITC技術與光譜學技術結合，研究了谷胱甘肽包被的CdTe量子點與血清白蛋白、過氧化氫酶以及銅/鋅-SOD的相互作用，表明CdTe量子點與這三種蛋白質(zhì)是以疏水作用力結合，且結合后的兩種抗氧化酶類催化功能未受到影響AndrasiM等17使用各種不同的方法研究抗人白蛋白單克隆抗體和其抗原蛋白之間的相互作用，實驗表明由ITC獲得的解離常數(shù)數(shù)值與使用ACE（一種研究分子結合的方法）獲得的值是一致的。BrathU等18在研究鈣調(diào)蛋白中與麻醉劑七氟醴的結合位點時，使用了ITC去測量它們之間的親和力。實驗表明，七氟醴在同與鈣離

12、子結合的鈣調(diào)蛋白作用時，有低的親和力，然而當缺乏鈣離子時，它們之間沒有相互作用。除此之外，ITC還用在其他許多研究領域。比如馮雪等19采用等溫滴定量熱法考察了益氣復脈凍干干粉針與VC注射液及5%的葡萄糖注射液之間的相容性。實驗結果表明，根據(jù)產(chǎn)生了的能量變化大小，益氣復脈凍干干粉與VC注射液的反應屬于化學反應范疇，而益氣復脈凍干干粉與葡萄糖注射液的反應屬于擴散引起的物理變化。討論與展望以上兩種實驗研究方法因其優(yōu)越性已經(jīng)越來越多地用于結構生物學的研究之中，但是，以上兩種方法也有各自的問題需要解決。SPR技術待測的分子只局限于大分子，小分子會對其造成嚴重的誤差；對于金屬芯片的要求也比較嚴格；不能消除

13、非特異性結合帶來的影響。ITC技術很少能夠與其他儀器聯(lián)合，缺乏特異性，對樣品組成要求很高。兩種技術共有的問題是這兩種儀器都很昂貴，成本較高。以上這些缺點都限制了它們的發(fā)展。我們有理由相信，在今后的研究中，隨著這這兩種技術越來越完善，它們的應用必將得到更多的發(fā)展，其前景也會越來越廣闊。參考文獻1王宏偉.冷凍電子顯微學在結構生物學研究中的現(xiàn)狀與展望J.中國科學:生命科學,2014,10:1020-10282孫小婷，靳嵐，凌沛學.表面等離子共振和等溫滴定量熱技術及其在蛋白質(zhì)相互作用中的應用J.藥物生物技術，2012,06:540-5453孟慶石，勞文燕，潘映紅.表面等離子共振生物傳感器技術及在生命研

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