電子顯微鏡免疫組織化學技術

1、第七章第七章 免疫電鏡免疫電鏡一一 電鏡免疫組織化學技術概述電鏡免疫組織化學技術概述二二 幾種常用的透射電鏡方法要點幾種常用的透射電鏡方法要點一一 電鏡免疫組織化學技術概述電鏡免疫組織化學技術概述 特異性抗體用電子致密物質，如鐵蛋白、膠體金等標記后，特異性抗體用電子致密物質，如鐵蛋白、膠體金等標記后，使之與組織超薄切片中的抗原結合，在電鏡下觀察到標記物所使之與組織超薄切片中的抗原結合，在電鏡下觀察到標記物所在位置，即為抗原抗體反應的部位。在位置，即為抗原抗體反應的部位。 v（一）組織固定與取材（一）組織固定與取材v（二）免疫染色（二）免疫染色v（三）包埋（三）包埋 v（四）對照試驗（四）對照試

2、驗（一）組織固定與取材（一）組織固定與取材v原則：原則：既要保存良好的細胞超微結構，又要注意保持組織的抗原性。既要保存良好的細胞超微結構，又要注意保持組織的抗原性。v固定：固定： 固定劑的要求：固定劑的要求： 不損害細胞內抗原的活性；不損害細胞內抗原的活性； 固定速度快、效果好；固定速度快、效果好； 分子量小，易于滲透；分子量小，易于滲透； 固定后固定后, ,不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標記抗體進入不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標記抗體進入抗原位?？乖?。 影響固定的因素有：影響固定的因素有： 固定劑的種類；固定劑的種類； 固定劑的濃度，濃度過大，對抗原的活性有影響，濃度固定劑的濃度，濃

3、度過大，對抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；過小，固定效果差； 固定劑的固定劑的pHpH； 固定劑的溫度固定劑的溫度, ,一般采用一般采用2244冷固定；這樣能降低細冷固定；這樣能降低細胞自溶作用和水分抽提；胞自溶作用和水分抽提； 固定時間與溫度有關，溫度高，固定快，也與緩沖系的固定時間與溫度有關，溫度高，固定快，也與緩沖系的離子強度有關，離子強度大，滲透壓大，穿透力強，固定要離子強度有關，離子強度大，滲透壓大，穿透力強，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時間也不一致；間也不一致； 與被固定的細胞類型有關。與被固定

4、的細胞類型有關。 選用固定劑不宜過強。常采用灌注固定法。選用固定劑不宜過強。常采用灌注固定法。 多聚甲醛多聚甲醛戊二醛混合液戊二醛混合液 過碘酸過碘酸賴氨酸一多聚甲醛液賴氨酸一多聚甲醛液(PLP(PLP液液) )： 對含糖類豐富的組織固定效果特佳。對含糖類豐富的組織固定效果特佳。（使用前必須用已知效價的抗原做一系列預實驗。如固定劑的（使用前必須用已知效價的抗原做一系列預實驗。如固定劑的種類濃度、溫度、種類濃度、溫度、pHpH及固定時間等。然后做出預處理的效價，及固定時間等。然后做出預處理的效價，作為失活參考以再選擇最適條件。）作為失活參考以再選擇最適條件。）v取材：取材：免疫電鏡技術較光鏡免疫

5、化學技術要求更迅速、精細。免疫電鏡技術較光鏡免疫化學技術要求更迅速、精細。灌流后需續(xù)固定：四氧化鋨（二）免疫染色（二）免疫染色v包埋前染色包埋前染色 v包埋后染色包埋后染色 v超薄切片免疫染色超薄切片免疫染色 1 1 包埋前染色包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修塊；常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包出，修塊；常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋。埋。 特異性免疫反應的范圍太小，可作二次包埋：特異性免疫反應的范圍太小，可作二次包埋： 即第一次包埋時將組織置于兩層塑料片之間，中夾環(huán)氧樹即第一次包埋時

6、將組織置于兩層塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。需要部位作第二次包埋。 包埋前染色的組織，以中層較為理想。包埋前染色的組織，以中層較為理想。 表層因受機械修整，結構保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。表層因受機械修整，結構保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。 半薄切片可在相差顯微鏡下不染色觀察（半薄切片可在相差顯微鏡下不染色觀察（PAPPAP），免疫反應部位呈黑點狀；），免疫反應部位呈黑點狀； HEHE或甲苯胺藍染色的半薄切片上，免疫反應部位呈棕黃色?；蚣妆桨匪{

7、染色的半薄切片上，免疫反應部位呈棕黃色。 取相連續(xù)的超薄切片取相連續(xù)的超薄切片 為避免電鏡鉛、鈾染色反應與免疫反應之間的混淆，分別以兩個銅網(wǎng)撈取，為避免電鏡鉛、鈾染色反應與免疫反應之間的混淆，分別以兩個銅網(wǎng)撈取，其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。v包埋前染色法的優(yōu)點是：包埋前染色法的優(yōu)點是： 切片染色前不經(jīng)固定、脫水及包埋等過程，不破壞抗原。切片染色前不經(jīng)固定、脫水及包埋等過程，不破壞抗原。 在免疫反應陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢在免疫反應陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。適用含抗原量較少的組

8、織。出率。適用含抗原量較少的組織。2 2 包埋后染色（載網(wǎng)染色）包埋后染色（載網(wǎng)染色）v組織標本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片；組織標本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片； 免疫組化染色（載網(wǎng)染色）免疫組化染色（載網(wǎng)染色）注意事項：注意事項： 四氧化鋨具有保存抗原的作用，但應用四氧化鋨可使抗四氧化鋨具有保存抗原的作用，但應用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。后固定中一般以不用四氧化鋨為佳，或盡原活性明顯減低。后固定中一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時間。量縮短在四氧化鋨中停留的時間。 在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學物質產(chǎn)生反應，故需選在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學物

9、質產(chǎn)生反應，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。 在免疫組化處理的全過程中，應注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)在免疫組化處理的全過程中，應注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性。面干燥會影響抗體活性。優(yōu)點：優(yōu)點：超微結構保存較好，方法簡便，陽性結果有高度的可重復性，超微結構保存較好，方法簡便，陽性結果有高度的可重復性，還能在同一超薄切片上進行多重免疫染色。還能在同一超薄切片上進行多重免疫染色。缺點：缺點： 抗原活性在樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；抗原活性在樣品處理過程中可能減弱甚至喪失； 環(huán)氧樹脂中可與組織成份發(fā)生反應而改變抗原性質；環(huán)氧樹脂中可與組織成份發(fā)生反應而改變抗原性質； 包埋在環(huán)氧樹脂中的

10、組織不易進行免疫反應等。包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進行免疫反應等。解決對策：解決對策：去除包埋劑：去除包埋劑：飽和苯溶液，無水酒精中飽和苯溶液，無水酒精中NaOHNaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等。飽和溶液或乙氧化鈉溶液等。去除四氧化鋨：去除四氧化鋨：免疫染色前，將載網(wǎng)超薄切片以免疫染色前，將載網(wǎng)超薄切片以H H2 20 02 2液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和增強樹脂的穿透性。增強樹脂的穿透性。3 3 超薄冰凍切片超薄冰凍切片 v將組織置于蔗糖保護液中，以液氮速凍；將組織置于蔗糖保護液中，以液氮速凍；v在冰凍超薄切片機上切片；在冰凍超薄切片機上切片；v免疫染色。免疫染色。 不需經(jīng)固

11、定、脫水、包埋等步驟，所以抗原性保存不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，所以抗原性保存 較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。但技術條較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。但技術條 件要求較高、難度較大件要求較高、難度較大。（三）包埋（三）包埋樹脂包埋、低溫包埋樹脂包埋、低溫包埋1 1 樹脂包埋樹脂包埋 環(huán)氧樹脂包埋法環(huán)氧樹脂包埋法 直接脫水后包埋直接脫水后包埋 原位包埋：將小片組織或半薄切片貼在載片上，原位包埋：將小片組織或半薄切片貼在載片上， 將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置 于切片上聚合、硬化，進行包埋。于切片上聚合、硬化，進行包埋。2 2 低溫包埋低溫包埋 低溫包埋劑：低溫包

12、埋劑： （1 1）LowicrylsLowicryls： 是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學物質，包括是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學物質，包括K4MK4M、HM20HM20、K1lMK1lM、KM23KM23等系列等系列產(chǎn)品。產(chǎn)品。 特點：特點： 是能在低溫下保持低粘度；是能在低溫下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用與溫度無關。具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用與溫度無關。K4MK4M和和K11MK11M具有親水性，能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色；具有親水性，能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色；HM20HM20和和HM23HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于

13、掃描、透射電鏡和暗視具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。野觀察切片的制作。K4MK4M應用較多應用較多 1 1）包埋劑的配制：）包埋劑的配制： 由三個部分組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。由三個部分組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。 調整單體、交聯(lián)劑比例，增加交聯(lián)劑，可增加組織塊的硬度。調整單體、交聯(lián)劑比例，增加交聯(lián)劑，可增加組織塊的硬度。 中等硬度的組織塊，其配制比例如下：中等硬度的組織塊，其配制比例如下： K4MK4M：單：單 體體 17.30g 17.30g 交聯(lián)劑交聯(lián)劑 2.70g2.70g 引發(fā)劑引發(fā)劑 0.10g0.10g 可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕

14、色玻璃容器避光，用可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用玻棒輕攪玻棒輕攪3 35 min5 min或用一小管通入液氮氣泡攪拌。勿過分攪拌，或用一小管通入液氮氣泡攪拌。勿過分攪拌，以防氧的氣泡進入包埋劑中。以防氧的氣泡進入包埋劑中。K4M K4M 的應用的應用 2) 2) 生物樣品處理程序生物樣品處理程序 取材，以多聚甲醛一賴氨酸取材，以多聚甲醛一賴氨酸過碘酸鈉固定；過碘酸鈉固定； 含含7 7蔗糖蔗糖PBSPBS，沖洗過夜；，沖洗過夜； 0.1 mol 0.1 molLPBSLPBS， pH 7.2pH 7.2沖洗；沖洗； 系列脫水；系列脫水； 包埋：包埋： 新鮮新鮮K4MK4M置

15、于膠囊內，將組織塊移入，在置于膠囊內，將組織塊移入，在-30-30-40-40以紫外線燈照射以紫外線燈照射24h24h使之聚合。如為使之聚合。如為100W100W燈泡，照射距離應大于燈泡，照射距離應大于85 cm85 cm。聚合后的膠囊移。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2 23 3天，可增加其硬度，便于切片。天，可增加其硬度，便于切片。 3) 3) 免疫染色免疫染色 切片貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上；切片貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上； 正常羊血清正常羊血清30 min30 min； 稀釋一抗，稀釋一抗，372h372h； 可用燒杯法可用燒杯法( (或塑料壺噴洗法或塑

16、料壺噴洗法) )，以鑷夾鎳網(wǎng)在燒杯中洗蕩；，以鑷夾鎳網(wǎng)在燒杯中洗蕩； 正常羊血清正常羊血清30min30min。 二抗以正常羊血清稀釋，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育。二抗以正常羊血清稀釋，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育。 沖洗如沖洗如。 覆于覆于2 2OsO4OsO4水溶液上，水溶液上，30min30min。 沖洗如沖洗如。 干燥后在電鏡下觀察。干燥后在電鏡下觀察。 注意事項：注意事項：所有步驟在室溫、濕盒內進行；所有溶液需經(jīng)微孔濾紙濾過。所有步驟在室溫、濕盒內進行；所有溶液需經(jīng)微孔濾紙濾過。 LowicrylsLowicryls 應保存在暗處，一應保存在暗處，一44，該物質有刺激性，在配制時應戴手套，該物

17、質有刺激性，在配制時應戴手套，以免觸及皮膚。在通風櫥內操作，以免蒸汽刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，以免觸及皮膚。在通風櫥內操作，以免蒸汽刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應立即以水沖洗局部。應立即以水沖洗局部。 （2 2）LR whiteLR white和和LR goldLR gold 是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂；是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂； 具有極低粘度和較強嗜水性，穿透性強，有利于抗體具有極低粘度和較強嗜水性，穿透性強，有利于抗體( (或抗原或抗原) ) 和免疫化學物質穿過和免疫化學物質穿過LRLR樹脂，達到組織結合部位；樹脂，達到組織結合部位； 在免疫細胞化學的光鏡在免疫細胞化學的光

18、鏡( (半薄切片半薄切片) )和電鏡水平應用都具有良好和電鏡水平應用都具有良好 效果。效果。 標本脫水至標本脫水至7070乙醇即可，能較好地保持抗原性。乙醇即可，能較好地保持抗原性。 生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。 （3 3）GMAGMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）（乙二醇甲基丙烯酸酯） 優(yōu)點：優(yōu)點： 電子密度大；電子密度大； 影像反差好。影像反差好。 缺點：缺點： 包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。 聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫脹。聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫脹。 缺乏穩(wěn)定性，不

19、能承受電子束轟擊，包埋劑遇熱升缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。 環(huán)氧樹脂：環(huán)氧樹脂：有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形；有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形；影像反差好，分辨率高；影像反差好，分辨率高；半薄切片染色不夠滿意，效果不如半薄切片染色不夠滿意，效果不如GMAGMA包埋切片的染色效果。包埋切片的染色效果。改進方法：改進方法：增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇400400改變其硬度。使之變軟；改變其硬度

20、。使之變軟；加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯以增強其抗電子束加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯以增強其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。轟擊的穩(wěn)定性。選用低溫型引發(fā)劑選用低溫型引發(fā)劑過氧化苯甲酰避免聚合時過快，產(chǎn)生過氧化苯甲酰避免聚合時過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結構。高溫，損傷組織結構。GMAGMA已廣泛應用于半薄切片已廣泛應用于半薄切片(1(13 um)3 um)的光鏡觀察，特別是的光鏡觀察，特別是組織化學方面的研究和電鏡水平的免疫細胞化學技術。組織化學方面的研究和電鏡水平的免疫細胞化學技術。 1) 1) 過濾過濾: : GMA GMA單體溶液在出廠時都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須單體溶液在出廠時都加有氫醌

21、類穩(wěn)定劑，用前須以每以每25ml25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5 min5 min，過，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。濾以除去氫酯，以免影響聚合。 2) 2) 包埋劑的配制：包埋劑的配制： a. 100a. 100GMAGMA N- N-甲基丙烯酸丁酯甲基丙烯酸丁酯 66.5ml66.5ml 5 5乙烯二甲丙烯酸酯乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml28.5ml 1.5 1.5過氧化苯甲酰過氧化苯甲酰 1.0g1.0g 1.0 1.0PEG 400 1.0mlPEG 400 1.0ml GMAGMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免包埋劑的配制

22、、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細胞化學染色方法：疫細胞化學染色方法：b bA A液：液： GMAGMA單體液單體液 90ml90ml PFG z300 5 PFG z300 59.4 ml9.4 ml 過氧化苯甲酰過氧化苯甲酰 0.20.20.69 g0.69 g 攪拌溶解后置棕色瓶內；攪拌溶解后置棕色瓶內；44保存。保存。 B B液：液： PEG z400 20 ml PEG z400 20 ml 二甲基苯胺二甲基苯胺 1 ml1 ml 應用時應用時A A：B B按按1010：1 1比例充分混。比例充分混。3) 3) 生物樣品處理：生物樣品處理： 組織固定可用組織固定可用PLPPLP液或液或

23、1 1戊二醛溶液戊二醛溶液( (磷酸緩沖液配制，磷酸緩沖液配制，Ph7.4)Ph7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMAGMA單體溶液中浸單體溶液中浸24h24h。 以上步驟可在室溫或以上步驟可在室溫或44進行。進行。 4) 4) 包埋聚合：包埋聚合： 組織移入盛滿包埋液的膠囊內，放在真空泵內以去除包組織移入盛滿包埋液的膠囊內，放在真空泵內以去除包埋液中的氣泡，然后在埋液中的氣泡，然后在44，以紫外線燈，以紫外線燈( (波長波長360nm)360nm)在距膠在距膠囊底部囊底部101020cm20cm處進行照射處進行照射121216h16h，以手指捏膠囊試其硬，以手指捏膠囊

24、試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟人熱水中以度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟人熱水中以去除膠囊外殼去除膠囊外殼。 5)5) 包埋后染色包埋后染色: :切片貼在鎳網(wǎng)上，按膠體金標記蛋白切片貼在鎳網(wǎng)上，按膠體金標記蛋白A A技術（技術（PAgPAg法）進行包埋后染色，鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。法）進行包埋后染色，鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。 低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術的低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術的 包埋后染色。能檢出應用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的包埋后染色。能檢出應用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的 多種抗原。多種抗原。（四）對照試驗（四）對照試驗: 略略免疫電

25、鏡技術存在的問題：免疫電鏡技術存在的問題： 戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構的保存，但對抗原活戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構的保存，但對抗原活性有影響；性有影響； H H2 20 02 2能增加樹脂穿透性，但對微細結構有損傷，能使反應部能增加樹脂穿透性，但對微細結構有損傷，能使反應部位產(chǎn)生孔洞。位產(chǎn)生孔洞。 染色中清洗工作不徹底，可產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和其他污染染色中清洗工作不徹底，可產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和其他污染物，影響特異性反應產(chǎn)物的顯示和觀察。物，影響特異性反應產(chǎn)物的顯示和觀察。二、幾種常用的透射電鏡方法要點二、幾種常用的透射電鏡方法要點 （一）鐵蛋白標記免疫電鏡技術一）鐵蛋白標記免疫電鏡

26、技術 （二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術（二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術 （三）膠體金標記免疫電鏡技術（三）膠體金標記免疫電鏡技術 （四）凝集素標記免疫電鏡技術（四）凝集素標記免疫電鏡技術（一）鐵蛋白標記免疫電鏡技術（一）鐵蛋白標記免疫電鏡技術 1 1 原理原理 鐵蛋白：鐵蛋白：是一種含鐵約占是一種含鐵約占2323的蛋白質，鐵蛋白含有致密的鐵離子核的蛋白質，鐵蛋白含有致密的鐵離子核 心，含心，含2000200030003000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密 區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。 抗體與鐵

27、蛋白通過雙功能試劑結合為一種雙分子復合物?？贵w與鐵蛋白通過雙功能試劑結合為一種雙分子復合物。此復合物保留了抗體的免疫活性，通過電鏡可定位抗原。適于細胞表面此復合物保留了抗體的免疫活性，通過電鏡可定位抗原。適于細胞表面抗原的定位抗原的定位 優(yōu)點：優(yōu)點：鐵蛋白易從馬脾中獲得，呈顆粒狀，易分辨；鐵蛋白易從馬脾中獲得，呈顆粒狀，易分辨；缺點：缺點：分子量較大，不易穿透細胞膜和組織，對于細胞分子量較大，不易穿透細胞膜和組織，對于細胞內抗原的定位較困難。只適合電鏡檢查，不能用普通光學顯微鏡觀察。內抗原的定位較困難。只適合電鏡檢查，不能用普通光學顯微鏡觀察。因此，在近年來逐漸被免疫酶和膠體金取代。因此，在近

28、年來逐漸被免疫酶和膠體金取代。 2 2 電鏡標本的制備電鏡標本的制備v（1 1）固定）固定 同常規(guī)電鏡（醛類和四氧化鋨雙固定）同常規(guī)電鏡（醛類和四氧化鋨雙固定） 鐵蛋白標記抗體分子量大，如用于細胞表面抗原的定位研究，鐵蛋白標記抗體分子量大，如用于細胞表面抗原的定位研究，可將樣品直接放入固定液；細胞內抗原測定需：可將樣品直接放入固定液；細胞內抗原測定需：凍融法：凍融法：固定后凍融使細胞膜破裂，標記抗體能進入細胞內。固定后凍融使細胞膜破裂，標記抗體能進入細胞內。冰凍切片法：冰凍切片法：固定后速凍，切成固定后速凍，切成10-15um10-15um薄片，融化的切片直接薄片，融化的切片直接浸泡于鐵蛋白標

29、記的抗體液中。浸泡于鐵蛋白標記的抗體液中。戊二醛固定后，浸入洋地黃皂甙液中戊二醛固定后，浸入洋地黃皂甙液中1-2min1-2min，增強細胞膜穿透性，增強細胞膜穿透性，使標記抗體進入細胞內使標記抗體進入細胞內冰凍超薄切片鐵蛋白標記抗體免疫電鏡圖冰凍超薄切片鐵蛋白標記抗體免疫電鏡圖 艾滋病患者血清的免疫電鏡所見。艾滋病患者血清的免疫電鏡所見。在病毒顆粒表面可見鐵蛋白顆粒的吸附。在病毒顆粒表面可見鐵蛋白顆粒的吸附。 在細胞質的空泡內可見到大量的與細胞在細胞質的空泡內可見到大量的與細胞外所見相同的病毒顆粒。外所見相同的病毒顆粒。 培養(yǎng)的成纖維細胞質膜對培養(yǎng)的成纖維細胞質膜對LDLLDL的內吞作用的內

30、吞作用LDLLDL顆粒與含鐵的轉鐵蛋白共價相連，顆粒與含鐵的轉鐵蛋白共價相連， 電子顯微鏡下所見的黑點是小分子電子顯微鏡下所見的黑點是小分子的鐵。（的鐵。（a a）LDLLDL與細胞表面的受體結合并形成有網(wǎng)格蛋白包被的小窩；（與細胞表面的受體結合并形成有網(wǎng)格蛋白包被的小窩；（b b） 含有含有LDLLDL的被膜小窩向下凹陷逐漸形成被膜小泡；（的被膜小窩向下凹陷逐漸形成被膜小泡；（c c） 含有轉鐵蛋白標記的含有轉鐵蛋白標記的LDLLDL被膜小泡；（被膜小泡；（d d）含有轉鐵蛋白標記的）含有轉鐵蛋白標記的LDLLDL顆粒的無被小泡（初級內體）。顆粒的無被小泡（初級內體）。 （2 2） 免疫染色

31、方法免疫染色方法 常采用包埋前免疫染色，分為直接法和間接法。常采用包埋前免疫染色，分為直接法和間接法。 （1 1）直接法：）直接法： 切片直接浸于標記的特異性抗體內，室溫或切片直接浸于標記的特異性抗體內，室溫或3713712h2h以上；以上； 緩沖液浸漂，除去未結合的標記抗體溶液；緩沖液浸漂，除去未結合的標記抗體溶液； 再按常規(guī)電鏡后固定、脫水、包埋。再按常規(guī)電鏡后固定、脫水、包埋。 （2 2）間接法：）間接法： 將切片浸入一抗室溫孵育將切片浸入一抗室溫孵育303060min60min； 大量冷緩沖液充分洗滌大量冷緩沖液充分洗滌(3(330min)30min)； 浸入鐵蛋白標記二抗中，室溫孵育

32、浸入鐵蛋白標記二抗中，室溫孵育30min30min； 充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片；充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片； 將離心沉淀小塊，用四氧化鋨固定將離心沉淀小塊，用四氧化鋨固定3030分鐘；分鐘； 常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。（二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術（二）過氧化物酶標記免疫電鏡技術 1 1 原理：原理：利用酶作為抗原抗體復合物的標記物，再經(jīng)酶對底物作用生成利用酶作為抗原抗體復合物的標記物，再經(jīng)酶對底物作用生成有較高電子密度的產(chǎn)物。有較高電子密度的產(chǎn)物。HRPHRP分子量小分子量小(40 000)(40

33、000)，穿透力強，有利于標記抗，穿透力強，有利于標記抗體進入細胞內，適于細胞內的抗原定位。體進入細胞內，適于細胞內的抗原定位。2 2 方法方法（1 1）單層細胞培養(yǎng)物免疫酶染色法）單層細胞培養(yǎng)物免疫酶染色法 用用4%4%多聚甲醛原位固定多聚甲醛原位固定1h;1h; PBS PBS充分洗滌，用充分洗滌，用HRPHRP標記的抗體血清作用標記的抗體血清作用18h18h，再用，再用PBSPBS水洗；水洗； 2%2%戊二醛固定戊二醛固定1h1h，再水洗；，再水洗； DABDAB顯色顯色 鋨酸固定、樹脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片鋨酸固定、樹脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片 （2 2）組織切片酶標記抗

34、體染色法）組織切片酶標記抗體染色法 1mm1mm厚組織塊，固定后如蔗糖保護液厚組織塊，固定后如蔗糖保護液; ; 做做10-40um10-40um冰凍切片，放入一抗血清作用冰凍切片，放入一抗血清作用12-18h12-18h，用含蔗糖，用含蔗糖的的PBSPBS水洗；水洗； 置于置于HRPHRP標記抗體液標記抗體液4 4 過夜，再水洗，浸漂過夜；過夜，再水洗，浸漂過夜； 戊二醛再固定戊二醛再固定1h1h，用含蔗糖的，用含蔗糖的PBSPBS水洗；水洗； DABDAB顯色；顯色； 鋨酸固定、脫水、樹脂包埋，切片復染和觀察鋨酸固定、脫水、樹脂包埋，切片復染和觀察 vHRPHRP標記抗體，通過標記抗體，通過

35、DABDAB呈色反應，呈色反應，DABDAB分解產(chǎn)物為不溶性的分解產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過Os04Os04處理后變黑，具有高電子密度，處理后變黑，具有高電子密度，適合于電鏡觀察；適合于電鏡觀察；vHRPHRP分子量比鐵蛋白將近小分子量比鐵蛋白將近小2020倍，酶標抗體較易透過經(jīng)適當倍，酶標抗體較易透過經(jīng)適當處理后的組織細胞膜，能用于定位細胞內抗原。但酶反應產(chǎn)處理后的組織細胞膜，能用于定位細胞內抗原。但酶反應產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標記物高物的分辨率不如顆粒性標記物高( (如鐵蛋白，膠體金如鐵蛋白，膠體金) )。 （3 3）包埋前）包埋前PAPPAP法：常用法：常用

36、固定組織；固定組織； 振動切片機切振動切片機切303050um50um厚片；厚片； 入正常羊血清入正常羊血清(5(51010，PBSPBS稀釋稀釋) )室溫孵育室溫孵育30min30min。 加一抗，加一抗，44濕盒中濕盒中484872h72h。 加二抗，室溫孵育加二抗，室溫孵育30min30min。 PAP PAP復合物復合物( (與一抗同種屬動物制備與一抗同種屬動物制備) )室溫孵育室溫孵育30min30min。 H H2 2O O2 2DABDAB，室溫作用，室溫作用15min15min。 光鏡下選出陽性部位，修整后按常規(guī)電鏡程序，四氧化光鏡下選出陽性部位，修整后按常規(guī)電鏡程序，四氧化

37、鋨后固定、脫水、包埋、超薄切片、觀察。鋨后固定、脫水、包埋、超薄切片、觀察。（4 4）包埋后）包埋后PAPPAP法：法： 載有超薄切片的鎳網(wǎng)入載有超薄切片的鎳網(wǎng)入5 5H H2 2O O2 2液內蝕刻，生理鹽水洗，液內蝕刻，生理鹽水洗， 濾紙吸干。濾紙吸干。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加一抗加一抗) )，44孵育孵育48h48h，TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加二抗室溫加二抗室溫5min5min，后用，后用TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加加PAPPAP復合物室溫復

38、合物室溫3min3min。 H H2 2O O2 2一一DABDAB顯色，室溫顯色，室溫3min3min。 入入1 1四氧化鋨液四氧化鋨液101015min15min后，蒸餾水洗，電鏡觀察。后，蒸餾水洗，電鏡觀察。（5 5）PAPPAP免疫電鏡雙重標記：免疫電鏡雙重標記：連續(xù)超薄切片上進行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同連續(xù)超薄切片上進行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同的抗體進行免疫染色?？稍诔⒔Y構水平判定細胞內抗原共存的情況。的抗體進行免疫染色?？稍诔⒔Y構水平判定細胞內抗原共存的情況。（三）膠體金標記免疫電鏡技術（三）膠體金標記免疫電鏡技術v19711971年首創(chuàng)

39、膠體金標記免疫電鏡技術。年首創(chuàng)膠體金標記免疫電鏡技術。v膠體金在堿性環(huán)境中帶負電，使其與抗體相吸附，從而標記抗體；膠體金在堿性環(huán)境中帶負電，使其與抗體相吸附，從而標記抗體；v金標抗體與抗原反應時，在光鏡膠體金液呈櫻紅色，不需另外染色；金標抗體與抗原反應時，在光鏡膠體金液呈櫻紅色，不需另外染色；v電鏡下，膠體金顆粒，具有高電子密度，清晰可辨；在電鏡比鐵蛋白顆電鏡下，膠體金顆粒，具有高電子密度，清晰可辨；在電鏡比鐵蛋白顆粒更致密，易于辨認，可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標記物；定位粒更致密，易于辨認，可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標記物；定位比酶反應物精確。比酶反應物精確。v膠體金容易和多種大分子

40、物質、包括抗體、膠體金容易和多種大分子物質、包括抗體、A A蛋白、凝集素等結合。根蛋白、凝集素等結合。根據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在3-150nm3-150nm之間的各種大小的膠體金顆之間的各種大小的膠體金顆粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標記物，可以在同粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標記物，可以在同- -標本片上標本片上顯示兩種或多種抗原物質，即所謂雙標記或多標記。顯示兩種或多種抗原物質，即所謂雙標記或多標記。 原理：原理： 膠體金是表面帶負電荷的疏水性顆粒，可與抗體相吸附，膠體金是表面帶負電荷的疏水性顆粒，可與抗體相吸附，從而標記抗體。用金標記的抗

41、體與抗原反應時，光鏡觀察從而標記抗體。用金標記的抗體與抗原反應時，光鏡觀察呈櫻紅色。由于金顆粒具有很高的電子密度，電鏡觀察清呈櫻紅色。由于金顆粒具有很高的電子密度，電鏡觀察清晰可辨。晰可辨。 金顆粒可分為三種，小顆粒直徑金顆?？煞譃槿N，小顆粒直徑3 35nm5nm，中顆粒，中顆粒10nm10nm，大，大顆粒顆粒20nm20nm。膠體金可標記許多大分子，最常用的是蛋白。膠體金可標記許多大分子，最常用的是蛋白A A一金和一金和IgIg一金?？梢岳貌煌睆降慕痤w粒標記不同抗體一金。可以利用不同直徑的金顆粒標記不同抗體研究不同物質共存于同一細胞組織；也可以與研究不同物質共存于同一細胞組織；也可以與

42、PAPPAP法相結法相結合進行雙重或多重超微結構定位。合進行雙重或多重超微結構定位。 方法：方法：1 1 電鏡水平的免疫金染色法電鏡水平的免疫金染色法包埋前染色：膠體金對質膜的穿透力較差，只用于細胞表面的抗原標記。包埋前染色：膠體金對質膜的穿透力較差，只用于細胞表面的抗原標記。包埋后染色：現(xiàn)在普遍采用。包埋后染色：現(xiàn)在普遍采用。（1 1）包埋后染色：）包埋后染色：超薄切片置于鎳網(wǎng)上超薄切片置于鎳網(wǎng)上 1 1H H2 2O O2 2液內蝕刻，雙蒸水洗滌液內蝕刻，雙蒸水洗滌3 3次次浮于正常羊血清滴上，室溫浮于正常羊血清滴上，室溫30-60min30-60min；孵育于一抗上，孵育于一抗上， ，4

43、4過夜，過夜，PBSPBS水洗；水洗；PBSPBS（內含（內含1%1%的牛血清白蛋白）的牛血清白蛋白）PH8.2PH8.2，5min5min，為膠體金結合做準備；，為膠體金結合做準備；膠體金標記抗體液，室溫孵育膠體金標記抗體液，室溫孵育10min-1h10min-1h，雙蒸水洗滌；，雙蒸水洗滌；如做雙重染色，則應將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟；如做雙重染色，則應將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟；醋酸鈾染色醋酸鈾染色5min5min，雙蒸水洗滌，枸櫞酸鈾染色，雙蒸水洗滌，枸櫞酸鈾染色5min5min，雙蒸水洗滌；，雙蒸水洗滌；電鏡觀察電鏡觀察（2 2）包埋前染色：）包埋

44、前染色：組織經(jīng)適當固定，為增強細胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；組織經(jīng)適當固定，為增強細胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；TBSTBS洗滌；洗滌；正常羊血清處理；正常羊血清處理；一抗孵育，一抗孵育， 44過夜，過夜，0.05mol/L TBS0.05mol/L TBS水洗；水洗； 0.02mol/L TBS 0.02mol/L TBS水洗，為膠體金結合做準備；水洗，為膠體金結合做準備；正常羊血清再次阻斷非特異性吸附；正常羊血清再次阻斷非特異性吸附； 金標二抗體液，室溫孵育金標二抗體液，室溫孵育1h1h，TBSTBS水洗；水洗；1%1%鋨酸鋨酸1h1h，雙蒸水洗，雙蒸水洗15min15min；系列酒精或丙酮脫水、包埋、超薄切片；系列酒精或丙酮脫水、包埋、超薄切片；枸櫞酸鉛對照染色枸櫞酸鉛對照染色2 2 膠體金標記蛋白膠體金標記蛋白A A技術（技術（PAgPAg法）法）在免疫電鏡中應用較為廣泛。在免疫電鏡