基因工程筆記

1、 1 .什么叫基因工程（Gene Engineering），試從理論和技術(shù)兩個方面談?wù)凣ene Engineering誕生的基礎(chǔ)？基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原來沒有這類分子的宿主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖。理論基礎(chǔ)： 1944年，美國生物學(xué)家Avery等通過細菌轉(zhuǎn)化研究，證明DNA是基因載體，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；1953年Watson和Crick建立了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型， 1958年至1972年揭示了先后確立了中心法則，破譯了64種密碼子技術(shù)基礎(chǔ)：20世紀(jì)60年代末70年代初

2、，限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)使DNA分子進行體外的切割和連接成為可能；1972年首次構(gòu)建了一個重組DNA分子，提出了體外重組的DNA分子如何進入宿主細胞，并在其中進行復(fù)制和有效表達等問題。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒分子是承載外源DNA片段的理想載體，病毒，噬菌體的DNA(或RNA)也可改造成載體1973年大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，這實驗結(jié)果說明基因工程問世，不僅宣告質(zhì)粒分子可作為基因克隆載體，能攜帶外源DNA導(dǎo)入宿主細胞，并且證實真核生物基因可轉(zhuǎn)移到原核生物細胞中，并在其中實現(xiàn)功能的表達（基因工程誕生的元年）克?。鹤鳛槊~使用時，是指某一個體（或細胞、分子等）通過無性繁殖的方式產(chǎn)生的具有相同遺傳

3、背景的后代（或子細胞、分子等）組成的集體（或群體）；作為動詞使用時，指產(chǎn)生上述集體或群體的過程。質(zhì)粒小量提取中,溶液、作用是什么?溶液是使細胞完全分散溶液是使細胞壁破裂，DNA變性溶液是使質(zhì)粒選擇性復(fù)性，而染色體DNA隨同SDS和蛋白質(zhì)一起沉淀下來限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)限制片段長度多態(tài)性：指用某一種限制性內(nèi)切酶來切割來自不同個體的基因組DNA或某一個基因，會

4、得到不同長度的DNA片段?？捎糜诨蚪M圖譜構(gòu)建、致病基因檢測、基因定位、生物進化和分類的研究等v限制性圖譜（restriction map):是指一系列限制酶的特異識別序列在DNA鏈上的出現(xiàn)頻率和它們之間的相對位置。又稱物理圖譜（physical map)核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性特性I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：A

5、AC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG切割位點在距離識別位點至少1000 bp處隨機切開一條單鏈。位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3端2426bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用常用的DNA聚合酶的特點共同特點：把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端。主要區(qū)別：持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。2 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶

6、只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。3. 常用DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中Taq DNA聚合酶無有快高Taq聚合酶：TaqDN聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。最適溫度高75-80 oC功能缺點，具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但沒有35外切酶活性。因此不能修復(fù)錯誤的堿基配對！Taq DNA聚合

7、酶的激活劑金屬離子敏感（尤其是Mg2+末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）：特性：（1） 53DNA聚合酶活性需要3OH、二甲胂酸緩沖液。不需要模板！底物可以是單鏈DNA、是3OH突出的雙鏈DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。隨機添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。（2）再生酶切位點，便于回收克隆片斷。（3）非放射性標(biāo)記DNA片斷的3端催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片斷的3端。（生物素-11-dUTP等）S1核酸酶：特性（1）高度單鏈特異

8、性（2）反應(yīng)條件：低水平Zn2+ ， pH4.04.3、S1核酸內(nèi)切酶的功能（1）催化單鏈RNA或DNA降解。（2）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)。發(fā)卡或有缺口的部位。3）降解限制酶切形成的單鏈突出端。（4）不能降解雙鏈DNA或RNA-DNA雜交鏈. S1核酸酶的用途（1）定位RNA 內(nèi)切酶位點不能位于內(nèi)含子序列中?。?）用mRNA測定基因中的外顯子序列不能配對的內(nèi)含子區(qū)域形成的單鏈環(huán)被S1切掉。 pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。（1）元件來源復(fù)制起點ori pMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因T

9、etr基因 pSC101的Tetr基因。（2）長度（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點24個克隆位點。其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。見圖P93 （5）pBR322的優(yōu)點 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記插入失活，分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細胞 在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamH I ：Amp中存活，但在Tet中死亡外源基因Pst I：Tet中存活，但在Amp中死亡分子小，克隆能力大載體越小越好。 10kb的DNA在純化過

10、程中容易斷裂。 高拷貝數(shù)氯霉素擴增之后，每個細胞可達10003000copy 安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。（6）pBR322的缺點保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點。能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移?。?）PBR322的改進刪除mob識別位點（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從pBR322上切去HaeII片斷，既除去了mob識別位點，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。改造EcoR I 位點 pBR325：使EcoRI也成為插入失活型位點。在pBR322位點上接入一段來自噬菌體PICm的HaeII酶切

11、片斷（帶有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也帶一個EcoRI位點。pUC系列University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19（3）元件來源復(fù)制起點：pBR322的oriAmpr基因pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位點。lacZ的啟動子：大腸桿菌lacZ基因：大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。（2）長度約2.7kb（3）克隆位點 10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ基因的5端T

12、i質(zhì)粒: 存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）天然Ti質(zhì)粒作載體的缺點（1）分子量太大（200kb）?。?）限制性酶切位點太多。（3）被轉(zhuǎn)化的植物細胞成為腫瘤，不能再分化。（4）在大腸桿菌中不能復(fù)制。. Ti質(zhì)粒的改造（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因，左右邊界）。（2）減少限制性酶切位點，引入單一插入位點。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植物細胞不再成為腫瘤，能正常分化。（4）冠癭堿合成對于植物無意義。應(yīng)剔除掉。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇標(biāo)記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號和結(jié)束信

13、號以及添加polyA的信號序列。改造后的Ti質(zhì)粒載體模式雙元質(zhì)粒載體和共整合載體應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）：在體外特異性地擴增某個基因?？捎糜谀康幕虻臄U增和分離Primer設(shè)計的一般原則：1 位置：與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩3端序列互補（ 5端相同）的短DNA2 引物長度至少16bp,一般引物設(shè)計為長1530bp3 引物的堿基序列 3端必須與模板正確配對，5端可以不配對4 引物的堿基組成1）盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結(jié)合力2）避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列. 5 避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以

14、上的連續(xù)堿基序列互補6 當(dāng)引物中的（G+C）含量低于50%時，復(fù)性溫度低于55 oC。實際復(fù)性溫度選擇低于Tm值5 oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)7 引物的濃度一般使用終濃度各0.5mmol/L8 簡并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。 需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物9 套嵌引物（nested primers)設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。PCR技術(shù)的原理模板DNA變性引物DNA復(fù)性引物DNA延伸1）DNA模板變性9

15、5oC雙鏈DNA在受熱后，配對堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為單鏈。（2）DNA模板與引物復(fù)性40-65oC引物（primer）: 人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴增的模板DNA雙鏈的5端相同。（3）DNA鏈的延伸72oC DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸DNA鏈。PCR的過程（1）第一步變性（denature）94-95 oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步復(fù)性（anneal）50-60 oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。引物的濃度高，引物的鏈短。（3）第三步延伸（extend）72oC下1-2分鐘，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。

16、（4）第四步變性（denature）94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（5）第五步重復(fù)（repeat）溫度循環(huán)95oC 5min94oC 1min72oC 2min50oC 1min PCR的特點（1）特異性強PCR使用專門合成的DNA引物。延伸過程是在高溫下進行。這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。（2）敏感性高需要的模板量極低。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條?。?）快速整個PCR過程約4小時即可完成。（4）簡便對模板的純度要求低，不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。（5）

17、可以擴增mRNA先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。目的基因的制備：目的基因：即供體，準(zhǔn)備要分離、改造、擴增或表達的基因。主要是編碼蛋白質(zhì)（酶）的結(jié)構(gòu)基因 。是能滿足人們特殊需要有價值的基因目的基因的制備方法：（已知目的基因序列：直接分離法，PCR法，化學(xué)合成法;未知目的基因序列：構(gòu)建基因(DNA）文庫分離法，差別雜交法和差示分析法） 直接分離法:限制性內(nèi)切酶法隨機片斷化(1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法2. 機械切割法)化學(xué)合成法:磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。PCR擴增獲得目的基因1. 直接從基因組中擴增（1）提取基因組DNA作模板（

18、2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物（3）PCR擴增適合擴增原核生物基因。真核生物基因組含有內(nèi)含子！2. 從mRNA中擴增: RT-PCR（1）提取基因組 total RNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物（4）PCR擴增適合擴增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。.什么是Gene library？它與cDNA library有何區(qū)別？ 由大量的含有基因組DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體, 稱之為基因文庫。一個完全的基因文庫，應(yīng)該能夠保證從中篩選到目的基因。由某一生物的特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)

19、反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，它們所構(gòu)成的重組DNA克隆群體，則稱之為cDNA基因文庫區(qū)別：基因組文庫克隆的是任何，包括未知功能的DNA序列、調(diào)控基因，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因?；蚪M文庫克隆的的全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育的調(diào)控因子的影響。基因組文庫中的編碼基因是真實的基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因 基因組文庫：構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。（1）對載體的要求載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（2）目前

20、常用的載體l載體系列：容量為 24 kpcosmid載體：容量為 50 kb YAC：容量為 1 Mb BAC: 容量為 300 kbYAC載體基因組文庫的大小一個完整的基因組文庫所需的克隆總數(shù)應(yīng)取決于外源基因組的大小以及切割片段的大小估算方法：基因組文庫的克隆數(shù)目=基因組DNA總長/DNA插入片段的平均長例：某生物基因組總長3*106kb，酶切切后片段平均長15kb，理論上，基因組文庫含的克隆數(shù)為3*106/15=2*105一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。p: 文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f: 插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所

21、需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性（基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率）外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件:重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力克隆載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選噬菌體基因組文庫的構(gòu)建：噬菌體基因組文庫的構(gòu)建步驟：獲得含目的基因的DNA片段與噬菌體克隆載體進行重組連接產(chǎn)物在體外進行包裝基因組文庫擴增或目的基因的篩選一種方法經(jīng)過分級分離：以EMBL3載體構(gòu)建文庫為例另一種不經(jīng)分級分離，通過填

22、充基因組DNA，也是一種較優(yōu)良的方法（P173cDNA library：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。代表特定細胞或組織中mRNA的文庫cDNA文庫的特點（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。RACE法(rapid amplification of cDNA ends)cDNA末端快速擴增技術(shù)，是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA順序來獲得完整cDNA5和3端的方法，也稱錨定PCR和單邊PCR 書P186是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合

23、成cDNA的第一條鏈，然后用PCR技術(shù)擴增出從某個特定位點到3端或到5端之間的未知核苷酸序列cDNA文庫的大小：豐度等級相應(yīng)豐度等級的mRNA群體占總mRNA的百分數(shù)（%）在相應(yīng)豐度等級中所含的不同種類mRNA序列的數(shù)目(個）每個細胞所含的相應(yīng)豐度mRNA序列的拷貝數(shù)（個）高豐度22303500中豐度491090230低豐度291067014cDNA基因文的大小可按以下理論公式估算： 基因文庫中cDNA的克隆數(shù)目=細胞中總mRNA的數(shù)目/細胞中某種mRNA的拷貝數(shù) 例：獲得一個能夠代表全部低豐度mRNA的cDNA文庫的克隆數(shù)為=（30*3500+1090*230+10670*14）/14=35

24、750但實際上所需構(gòu)建的cDNA文庫的實際值遠遠超過理論值估算cDNA基因文庫大小的經(jīng)驗公式：N-cDNA基因文庫必須的克隆數(shù)P-文庫中含目的基因DNA片段的出現(xiàn)概率f-某種mRNA的豐度與總mRNA數(shù)的比值例：以上述生物為例，若p-99%則N=ln(1-0.99)/ln(1-14/500500)=16000目前用同聚物加尾法或雙銜接物法，每微克cDNA都能產(chǎn)生出1*105-6*105個菌落cDNA文庫對真核生物基因的分析是十分有用的只含有編碼蛋白質(zhì)的基因文庫，減少了無功能基因cDNA沒有內(nèi)含子，基因可直接在E.Coli中表達對鑒別新基因是十分有用的具有組織和細胞類型特異性一般不用原核生物的m

25、RNA構(gòu)建cDNA文庫原核生物的mRNA是很不穩(wěn)定的原核生物的基因組文庫包括了所有的基因組序列，而且是比較容易構(gòu)建的cDNA文庫優(yōu)越性：1、 cDNA克隆以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，2、 cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行，一個完整的cDNA基因文庫所含克隆數(shù)，要比一個完全的基因組文庫所含的克隆數(shù)少得多3、 cDNA克隆出現(xiàn)的假陽性概率比較低（陽性克隆含有目的基因的序列）4、 cDNA克隆可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆，直接用于基因工程的操作5、 cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究局限性：1、cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠遠少于基因組DNA文庫，并且受

26、細胞來源或發(fā)育時期的影響2、cDNA基因文庫雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因的內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面的信息3、在cDNA基因文庫中，相應(yīng)于高豐度的mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來容易，反之mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR：分離鑒定差別表達基因 P223mRNA差別顯示法的優(yōu)點： 放大后，靈敏度高，快速，重復(fù)性好，所需材料少 可以同時比較多種細胞類型，展現(xiàn)所有差異 可用回收并經(jīng)擴增的cDNA直接作探針 缺點： 需大范圍的篩選 出現(xiàn)漏檢，高頻率假

27、陽性 間距小，切割難度大抑制性減法雜交（SSH) P231抑制性減法雜交（suppression subtractive hybridization,SSH)是RDA技術(shù)的發(fā)展，它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交技術(shù)結(jié)合為一體的技術(shù)。用于分離兩組基因表達差異較小的基因（2）SSH技術(shù)的優(yōu)點： 特異性強，假陽性率低 高靈敏性，保證低豐度mRNA檢出 速度快、效率高不足之處： 對起始材料要求較多，一般需要微克量級的的Mrna 得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不是全長Cdna 所研究材料的差異不能太大，最好是細微差異因此，SSH法成為目前尋找有差別表達的基因的適用方法EST(Expressed Sequence Tags)：基因表達的短cDNA序列ST（sequence tag)：寡核苷酸序列標(biāo)