部分古桂遺傳多樣性的ISSR分析初稿

1、古桂遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析段一凡，王賢榮* 作者簡(jiǎn)介：段一凡（1984-），男，博士，主要從事樹(shù)木學(xué)研究；*通訊作者：王賢榮（1966-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分類(lèi)學(xué)和植物資源學(xué)研究，梁麗麗，李雪霞，向其柏，趙正萍(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，南京，210037)摘要：利用ISSR分子標(biāo)記，以云南木犀(Osmanthus yunnanensis (Franchet) P.S.Green)和柊樹(shù)（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）為對(duì)照種，對(duì)6個(gè)省市45份古桂花和2份野生桂花進(jìn)行了遺傳多樣性研究。結(jié)果表明：古桂花具有豐富

2、的遺傳多樣性，選用的14條引物共擴(kuò)增出148條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶131條，占88.51%；平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Neis遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性信息指數(shù)分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688；聚類(lèi)分析結(jié)果表明對(duì)照種與桂花遺傳距離較遠(yuǎn)，最早分開(kāi)；古桂花具有很強(qiáng)的地理相關(guān)性，來(lái)自同一來(lái)源地或具有相似顏色的個(gè)體往往聚在一起；四季桂與其他秋桂類(lèi)個(gè)體遺傳距離較遠(yuǎn)。關(guān)鍵詞：古桂；ISSR；遺傳多樣性；聚類(lèi)分析中圖分類(lèi)號(hào)：S792.95；TQ920.1Analysis of genetic diversity and relationships amo

3、ng ancient sweet osmanthus trees using ISSR markersDUAN Yi-fan,WANG Xian-rong ,LIANG Li-li,LI Xue-xia,QIANG Qi-bai,ZHAO Zheng-pin（College of Forest Resources and Environment, Nanjing Foresty University,Nanjing,210037)Abstract: Interspecific relationships of 45 ancient sweet osmanthus trees from 6 pr

4、ovinces and 2 wild species of sweet osmanthus were evaluated by using ISSR (inter simple sequence repeat) marker with Osmanthus yunnanensis (Franchet) P.S. Green and Osmanthus fordii Hemsl as contrast species. The results showed that ancient sweet osmanthus trees had abundant genetic diversity. Four

5、teen ISSR primers produced a total of 148 bands, of which 131 were polymorphic. The percentage of polymorphic bands was 88.51%. The mean observed number of alleles, effective number of alleles, Neis genetic distance and Shannon index were 1.8851, 1.4106, 0.2415 and 0.3688 respectively. The cluster a

6、nalysis showed that the genetic distance between contrast species and sweet osmanthus was far. Ancient sweet osmanthus trees were closely correlated with geographical locations, and trees from the same place or in similar color often clustered together. The genetic distance between Asiaticus Group a

7、nd others was far. Key words: ancient sweet osmanthus trees, ISSR, genetic diversity, cluster analysis桂花Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.屬木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus Lour.)植物，為我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，在我國(guó)已有2500余年的栽培歷史1。桂花是長(zhǎng)壽樹(shù)種，在我國(guó)很多地方都有樹(shù)齡超過(guò)100年的古桂存在2。中華古桂是中國(guó)古老文明的象征，是活的文物標(biāo)本，也是研究古氣候、古環(huán)境、古樹(shù)種質(zhì)資源以及桂花新品種培育的重要材料，同時(shí)還是重要的旅

8、游資源3。桂花遺傳多樣性研究已多有報(bào)道，但研究材料幾乎都為新近培育的栽培品種，針對(duì)古桂的遺傳多樣性研究還十分有限，其分子層面研究還未見(jiàn)報(bào)道2-15。ISSR（inter simple sequence repeat）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間，是一種基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)。具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，而且ISSR標(biāo)記可以揭示整個(gè)基因組的一些特征，不受季節(jié)、環(huán)境等外在因素的影響。目前已被廣泛用于作物遺傳育種、植物品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中，是木本植物遺傳多樣性分析中的主要技術(shù)手段之一16-22。本研究以木犀屬的云南木犀(Osmanthus yunnanensis

9、(Franchet) P.S.Green)和柊樹(shù)（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）為對(duì)照種，以來(lái)源于全國(guó)6個(gè)省市45株古桂花和2份野生桂花為研究對(duì)象，采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)上述實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，旨在進(jìn)一步探討桂花品種群及品種的親緣關(guān)系和遺傳演化，為古桂種質(zhì)資源的有效保護(hù)、桂花新品種的培育和遺傳改良提供理論依據(jù)。1. 材料和方法1.1 材料2009年9月-2011年3月，在全國(guó)6個(gè)省市共調(diào)查了45株古桂（表1），采集古桂的無(wú)病蟲(chóng)害的幼嫩葉片裝入自封袋中，并裝入硅膠干燥，-20度冰箱保存?zhèn)溆谩Ｗ鳛閷?duì)照的云南木犀(Osmanthus y

10、unnanensis (Franchet) P.S.Green)以及2份野生桂花采自浙江金華，柊樹(shù)（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）采自南京林業(yè)大學(xué)。實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)專(zhuān)家鑒定，確切可靠。1.2 實(shí)驗(yàn)方法DNA提取，采用張博等的CTAB-硅珠法23，稍作改進(jìn)。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度后，最終用TE稀釋至約20ng.ul-1。引物根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)公布的序列設(shè)計(jì)，參照前人研究11-13，由上海捷瑞（Generay）公司合成。篩選出14條擴(kuò)增條帶較多，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反

11、應(yīng)。ISSR反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)篩選和優(yōu)化確定為25L反應(yīng)體系：DNA模板40ng，10mol/L的引物1.2L，Mix（為混勻好的Taq酶、Mg2+和dNTP，購(gòu)自上海Generay）12.5L，雙蒸水補(bǔ)充至25L。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4預(yù)變性5min；94變性1min，50-57復(fù)性1min，72延伸1.5，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72延伸8min。ISSR-PCR產(chǎn)物在含有溴化乙錠EB（0.5ug/ul）的1.5%瓊脂糖上電泳，100V恒壓電泳近2個(gè)小時(shí)，電泳結(jié)束于紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。表1 49份實(shí)驗(yàn)材料概況Tab.1 Basic information of 49 materials編號(hào)No.名稱Na

12、me樹(shù)齡age采集地origin編號(hào)No.名稱Name樹(shù)齡age采集地origin1四季桂300浙江金華湯溪鎮(zhèn)26波葉銀桂035180湖北咸寧桂花鎮(zhèn)2結(jié)籽銀桂260浙江金華安地鎮(zhèn)27波葉銀桂047100湖北咸寧桂花鎮(zhèn)3結(jié)籽銀桂200浙江金華安地鎮(zhèn)28波葉銀桂023150湖北咸寧桂花鎮(zhèn)4金桂600江蘇鎮(zhèn)江儒里29波葉銀桂030180湖北咸寧桂花鎮(zhèn)5籽銀桂100上海植物園30波葉銀桂021500湖北咸寧桂花鎮(zhèn)6蘇州早黃135蘇州博物館31波葉銀桂045100湖北咸寧桂花鎮(zhèn)7蘇州早黃130蘇州南林賓館33波葉銀桂046180湖北咸寧桂花鎮(zhèn)8蘇州早黃235蘇州老防疫站33丹桂300湖北武穴9波葉金桂3

13、00蘇州南園賓館34丹桂01200四川成都龍藏寺10波葉金桂170蘇州圖書(shū)館35丹桂02200四川成都龍藏寺11波葉金桂150蘇州博物館36金桂01300四川成都郫縣12波葉金桂150蘇州南園賓館37金桂02300四川成都郫縣13金球桂270蘇州老防疫站38金桂03300四川成都郫縣14金球桂120蘇州南林飯店39金桂04300四川成都郫縣15金球桂115蘇州南林飯店40金桂05300四川成都郫縣16銀桂300蘇州南園賓館41金桂06300四川成都郫縣17波葉銀桂043135湖北咸寧桂花鎮(zhèn)42銀桂07300四川成都郫縣18波葉銀桂044100湖北咸寧桂花鎮(zhèn)43銀桂08300四川成都郫縣19麩金

14、200湖北咸寧桂花鎮(zhèn)44古桂2000陜西漢中圣水寺20江南麗人031200湖北咸寧桂花鎮(zhèn)45丹桂1700陜西漢中武侯墓21江南麗人033150湖北咸寧桂花鎮(zhèn)46野生桂（銀桂）1浙江金華22江南麗人042150湖北咸寧桂花鎮(zhèn)47野生桂（銀桂）2浙江金華23江南麗人120湖北咸寧桂花鎮(zhèn)48云南木犀浙江金華24柳葉桂100湖北咸寧桂花鎮(zhèn)49柊樹(shù) 江蘇南京25銀星100湖北咸寧桂花鎮(zhèn) 注：樹(shù)齡來(lái)自調(diào)查時(shí)獲得的相關(guān)信息及各地古樹(shù)名木志記載1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法ISSR為顯性標(biāo)記，視每條多態(tài)性為一個(gè)等位基因。根據(jù)各分子標(biāo)記電泳譜帶的有無(wú)統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)：有帶的記為“1”，無(wú)帶或模糊不清的記為“0”將數(shù)

15、據(jù)輸Excel表格，形成一個(gè)二元數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)這個(gè)二元數(shù)據(jù)計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分?jǐn)?shù)，采用POPGENE32 ( Version1. 31)，分別計(jì)算觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)(Ne)、Neis遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon多樣性信息指數(shù)(I)。采用類(lèi)平均法(UPGMA)，使用NTSYSpc2.02軟件中的SHAN程序?qū)?shí)驗(yàn)材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。2. 結(jié)果與分析2.1 引物篩選和多態(tài)性分析參考前人研究，從36條引物中選出14條擴(kuò)增條帶較多，信號(hào)強(qiáng)，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)（表2）。表2 14條ISSR引物擴(kuò)增條帶數(shù)與多態(tài)性比率Tab.2 Number and ratio o

16、f polymorphic bands amplified by 14 ISSR primers引物Primer引物序列(53)Sequence(53)擴(kuò)增帶數(shù)Amplified bands多態(tài)性條帶數(shù)Polymorphic bands多態(tài)性比率Polymorphic bands rate / %IBC810(GA)8T121191.67UBC811(GA)8C99100UBC813(CT)8T111090.91UBC815(CT)8G10990UBC825(AC)8T121191.67UBC836(AG)8YA1212100UBC841a(GA)8CC88100UBC844(CT)8RC87

17、87.5UBC844b(CT)8GC12975UBC853(TC)8RT7685.71UBC856(AC)8TC121191.67UBC857(AC)8YG10990ISSR12GA(GGA)5G10770ISSR27(TG)8CG151280合計(jì)Total14813188.5114條引物共擴(kuò)增出148條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶131條，平均多態(tài)性頻率達(dá)88.51%。擴(kuò)增出的條帶大小在200-2000bp之間。每個(gè)引物 擴(kuò)增的條帶數(shù)由7-15不等，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出10.57個(gè)條帶和9.36條多態(tài)性帶。多態(tài)性最高的達(dá)100%，最低的為70%，引物ISSR27擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多為15條，引物U

18、BC853擴(kuò)增出的條帶最少為7條。引物UBC857和UBC844b，擴(kuò)增的部分樣品的圖譜見(jiàn)圖1。由于ISSR揭示的是基因組DNA在酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異，從圖1可以看出，同一個(gè)體在不同引物產(chǎn)生了不同的ISSR產(chǎn)物圖譜，同一引物在不同單株間產(chǎn)生的擴(kuò)增譜帶也不相同，這充分表現(xiàn)了供試古桂花在DNA水平上具有廣泛的差異。750bp2000bp500bp250bp1000bp圖1 引物UBC857 和 UBC844b 對(duì)部分古桂擴(kuò)增產(chǎn)生的譜帶Fig.1 ISSR bands of some ancient sweet osmanthus with primer-UBC857 and prime

19、r-UBC844b2.2 古桂遺傳多樣性分析 觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)(Ne)、Neis遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon多樣性信息指數(shù)(I)是衡量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。將各古桂的ISSR擴(kuò)增譜帶用POPGENE32進(jìn)行分析，結(jié)果得出古桂的平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Neis遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性信息指數(shù)分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688。2.3 古桂的聚類(lèi)分析根據(jù)49份實(shí)驗(yàn)材料的Neis遺傳距離，利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析。從聚類(lèi)圖（圖2）可以看出，作為對(duì)照種的野桂花(Osmanthus yunnanensis (Fran

20、chet) P.S.Green)和柊樹(shù)（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）與桂花遺傳距離較遠(yuǎn)，二者最先分開(kāi)，45份古桂和2份野生桂花聚為一個(gè)大類(lèi)。從聚類(lèi)圖可以看出，古桂表現(xiàn)出很強(qiáng)的地理相關(guān)性，相同地方來(lái)源的古桂常常集中聚在一起。如：6-16號(hào)來(lái)源于蘇州的古桂；17-31號(hào)來(lái)源于湖北咸寧的古桂；34-43號(hào)來(lái)源于四川成都的古桂分別聚類(lèi)在一起。四季桂作為一個(gè)獨(dú)特的類(lèi)群，其分類(lèi)地位一直引人關(guān)注。從聚類(lèi)圖可以看出，作為實(shí)驗(yàn)樣本中唯一的一個(gè)四季桂個(gè)體，該樣本與其他古桂遺傳距離較遠(yuǎn)。這同前人的研究結(jié)論一致，也再次證明四季桂與秋桂類(lèi)的差異由來(lái)已久，且穩(wěn)定可靠

21、?；ㄉ鳛楣鸹ㄆ贩N分類(lèi)的重要性狀一直受到肯定。從聚類(lèi)圖可以看出相同品種、品種群或相似花色的個(gè)體常常聚在一起，如：6-8號(hào)；26-28號(hào)等。產(chǎn)于陜西漢中的兩棵“漢桂”(44和45號(hào))與野生桂花(46號(hào))聚在了一起，這不僅說(shuō)明了這兩棵古桂起源的古老性和近野生性，也為我們了解野生桂花的自然分布和花色演化提供了新的線索。圖2 供試材料基于Neis遺傳距離的ISSR聚類(lèi)圖Fig. ISSR dendrogram of cluster analysis based on Neis genetic distance for tested materials3. 結(jié)論與討論古桂的珍貴不僅僅是因其“古老性”和豐

22、富的文化背景，還在于它們是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和人工培育后所形成的獨(dú)特的、相對(duì)穩(wěn)定的基因資源。由于古桂分布星散，數(shù)量稀少，且桂花為雄全異株花，所以其個(gè)體間近親繁殖的可能性很小，因而可以提供比較客觀的種質(zhì)遺傳多樣性信息。本文應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)6個(gè)省市45株古桂的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：古桂花具有豐富的遺傳多樣性，選用的14條引物共擴(kuò)增出148條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶131條，占88.51%；平均觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Neis遺傳多樣性指數(shù)和Shannon多樣性信息指數(shù)分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688；聚類(lèi)分析結(jié)果表明古桂花具有很強(qiáng)的地理相關(guān)性

23、，這說(shuō)明在交通并不發(fā)達(dá)的上百年前桂花跨地區(qū)引種的情況比較少，古桂花的引種栽培以小范圍、鄰近區(qū)域的引種為主。而另一方面桂花的遺傳多樣性又比較豐富，這說(shuō)明桂花在長(zhǎng)期的適應(yīng)和進(jìn)化中形成了比較豐富的遺傳變異，遺傳資源比較豐富。這些珍貴的種質(zhì)資源對(duì)于桂花新品種繁育具有重要價(jià)值，因此加強(qiáng)古桂種質(zhì)資源保護(hù)和利用具有重要意義。由于人類(lèi)活動(dòng)的不斷影響，野生桂花資源越來(lái)越難以尋覓，桂花的自然分布區(qū)域越來(lái)越碎片化。野生桂花作為一種重要的種質(zhì)資源變得極度稀缺。聚類(lèi)分析中古漢桂與野生桂花聚在了一起，這說(shuō)明古桂有很強(qiáng)的近野生性或半野生性，這給我們了解野生桂花分布，研究桂花品種群花色演變，開(kāi)展野生桂花種質(zhì)資源搜集保護(hù)提供了

24、重要線索。遺傳多樣性對(duì)于物種適應(yīng)環(huán)境變化及進(jìn)化發(fā)展都具有重要意義。根據(jù)古桂遺傳多樣性較高的特點(diǎn)，在對(duì)桂花進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中應(yīng)盡可能地對(duì)古桂實(shí)施保護(hù)，以保護(hù)其獨(dú)特的基因資源，積極開(kāi)展古桂無(wú)性繁育和復(fù)壯技術(shù)研究，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的異地保育和持續(xù)利用，使桂花的遺傳多樣性水平更好的保持和提高。 致謝：感謝南京森林警察學(xué)院偵查系謝春平博士、浙江金華華安園林苗木開(kāi)發(fā)有限公司鮑志賢先生、湖北咸寧林科所劉恒貴所長(zhǎng)、劉清平高級(jí)工程師、王啟富干事以及四川成都香王園林有限公司王思明先生在采樣過(guò)程中所給予的熱情幫助，感謝南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院夏濤老師在試驗(yàn)中所給予的熱心指導(dǎo)。參考文獻(xiàn)：1 向其柏,劉玉蓮.中國(guó)桂花

25、品種圖志M.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2008.2 段一凡,王賢榮,梁麗麗,等.我國(guó)古桂研究現(xiàn)狀及桂花品種起源和演化初探.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,28（4）:375-379 3 孫衛(wèi)邦,向其柏.云南古桂的資源現(xiàn)狀及保護(hù)利用J.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 28(增刊): 94-96.4 陳建業(yè),寧玉霞,趙翠華,等.河南桂花品種過(guò)氧化物酶同功酶研究J.園藝學(xué)報(bào),1995,22(2):176-180.5 趙小蘭,姚崇懷,王彩云.桂花品種的同工酶研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,19（6）:595-599.6 朱誠(chéng),劉非燕.RAPD 技術(shù)與桂花品種分類(lèi)和鑒定J.廣西

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