第八章DNA重組與轉(zhuǎn)座

1、DNA重組與轉(zhuǎn)座重組與轉(zhuǎn)座概述概述第一節(jié)第一節(jié) 同源重組同源重組第二節(jié)第二節(jié) 位點(diǎn)專(zhuān)一性重組位點(diǎn)專(zhuān)一性重組第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)座作用轉(zhuǎn)座作用第四節(jié)第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子概述：概述： 只要有只要有DNA，就會(huì)發(fā)生重組，就會(huì)發(fā)生重組減數(shù)分裂減數(shù)分裂高等高等Euk.體細(xì)胞核基因、葉綠體和線粒體體細(xì)胞核基因、葉綠體和線粒體溫和噬菌體溫和噬菌體轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 生存生存變異變異突變，重組突變，重組 損傷修復(fù)、適應(yīng)環(huán)境、加速進(jìn)化損傷修復(fù)、適應(yīng)環(huán)境、加速進(jìn)化 廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過(guò)程廣義遺傳重組：任何造成基因型變化的基因交流過(guò)程 DNA重組 DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的

2、重新組合。（1）同源重組（2）位點(diǎn)特異性重組（3）轉(zhuǎn)座重組（4）異常重組 DNA重組可分為四類(lèi)（重組可分為四類(lèi)（DNA序列、蛋白質(zhì)因子）序列、蛋白質(zhì)因子） 重組重組DNA技術(shù)技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 同源重組同源重組1、 同源重組（同源重組（homologous recombination）: 發(fā)生在同源發(fā)生在同源DNA序列之間序列之間一、特征一、特征2、 特征：特征： 涉及同源序列間的聯(lián)會(huì)配對(duì)，且交換的片段較大涉及同源序列間的聯(lián)會(huì)配對(duì)，且交換的片段較大 涉及涉及DNA分子在特定的交換位點(diǎn)發(fā)生分子在特定的交換位點(diǎn)發(fā)生斷裂和錯(cuò)接斷裂和錯(cuò)接的生化過(guò)程的生化過(guò)程 異源雙鏈區(qū)的生成異源雙鏈區(qū)的生成 存在重組

3、熱點(diǎn)存在重組熱點(diǎn) 需要重組酶需要重組酶 單鏈單鏈DNA分子或單鏈分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生的重要信號(hào)末端是交換發(fā)生的重要信號(hào)細(xì)線期細(xì)線期合線期合線期粗線期粗線期雙線期雙線期終變期終變期 e.g.e.g. Euk. Euk.減數(shù)分裂時(shí)減數(shù)分裂時(shí) 的染色單體之間的染色單體之間 的交換的交換 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化， 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 導(dǎo)，接合，噬菌體導(dǎo)，接合，噬菌體 重組重組雙倍體染色體交換雙倍體染色體交換二 同源重組的分子模型1.Holliday于1964年提出Holliday模型（1）兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊（2）兩DNA分子同一部位兩單鏈發(fā)生斷裂引發(fā)重組（3）斷裂的單鏈游離末端彼此交換形成Hol

4、liday中間體（4）通過(guò)分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA分子。（5）中間體在內(nèi)切酶和連接酶作用下，形成拼接重組體和片段重組體。SynapsedchromatidsRecombinationjointHeteroduplex DNA55（1）（2）片段重組體拼接重組體Holliday中間體3553Meselson-Radding模型模型單鏈入侵模型（鏈轉(zhuǎn)移模型）單鏈入侵模型（鏈轉(zhuǎn)移模型）置換置換侵入侵入Loop切除切除同化同化 異構(gòu)化異構(gòu)化 分支遷移分支遷移5切割切割雙鏈斷裂修復(fù)模型雙鏈斷裂修復(fù)模型 2、 分枝遷移和分枝遷移和Holliday中間體中間體結(jié)構(gòu)的拆分結(jié)構(gòu)的拆分 分枝遷移（分枝遷移（br

5、anch migaration） 雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴(kuò)散雙螺旋形成的交叉連接以拉鏈?zhǔn)叫?yīng)擴(kuò)散Holliday的異構(gòu)化的異構(gòu)化產(chǎn)生重組體的拆分產(chǎn)生重組體的拆分Holliday結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可結(jié)構(gòu)一經(jīng)生成即可不斷地處于異構(gòu)化不斷地處于異構(gòu)化異源雙鏈異源雙鏈 heteroduplex DNA重組結(jié)果取決于拆分時(shí)重組結(jié)果取決于拆分時(shí)配對(duì)鏈上的切口位置配對(duì)鏈上的切口位置（1）（2）（1）（2） Holliday結(jié)構(gòu)的拆分結(jié)構(gòu)的拆分產(chǎn)生含異源雙鏈產(chǎn)生含異源雙鏈的的片段重組體片段重組體產(chǎn)生產(chǎn)生拼接重組體拼接重組體“親本鏈親本鏈-片段重組體片段重組體”“拼接重組體拼接重組體”三、原核同源重組（三

6、、原核同源重組（E.coli） 發(fā)生在雙方發(fā)生在雙方DNA的同源區(qū)域的同源區(qū)域 部分復(fù)制的染色體部分復(fù)制的染色體DNA之間或染色體之間或染色體DNA與外源與外源DNA之間之間 細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo) 1、RecBCD酶和酶和 Chi 位點(diǎn)位點(diǎn) RecBCD酶具有酶具有ATP依賴(lài)的依賴(lài)的解旋酶活性、依賴(lài)于解旋酶活性、依賴(lài)于ATP的核酸的核酸外切酶活性、外切酶活性、序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性序列特異性的單鏈內(nèi)切酶活性. 單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使單鏈內(nèi)切酶活性和解旋酶活性使DNA產(chǎn)生具有游離末端的單鏈產(chǎn)生具有游離末端的單鏈 RecA的作用位點(diǎn)的作用位點(diǎn) Chi位點(diǎn)含有位點(diǎn)含

7、有GCTGGTGG序列序列,是基因是基因recBCD編碼編碼RecBCD酶作用酶作用的靶的靶位點(diǎn)位點(diǎn)3 RecBCD的識(shí)別和切割位點(diǎn)的識(shí)別和切割位點(diǎn)a、 RecBCD結(jié)合在結(jié)合在DNA的平的平 頭末端（產(chǎn)生機(jī)制不清楚）頭末端（產(chǎn)生機(jī)制不清楚）b、 外切、外切、解鏈、移動(dòng)解鏈、移動(dòng) （ATP）c、 兔耳狀兔耳狀 loop 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)產(chǎn)生（再旋酶活性低于解旋酶活性）（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、 RecBCD 在在 loop 單鏈區(qū)的單鏈區(qū)的 chi 位點(diǎn)位點(diǎn)3方方46NT處切處切 斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶）斷單鏈（單鏈內(nèi)切酶） chi位點(diǎn)：位點(diǎn)：GCTGGTGG 目前發(fā)現(xiàn)的重組熱點(diǎn)目前發(fā)現(xiàn)的重組熱

8、點(diǎn) E.coli 含含 1000 個(gè)、個(gè)、Euk.e、 RecBCD 切割產(chǎn)生切割產(chǎn)生3單鏈末端單鏈末端 2、RecA 蛋白蛋白 （1） 活性活性a、 RecA 有單、有單、雙鏈雙鏈 DNA 結(jié)合活性結(jié)合活性 b、 RecA 有有 NTPase 活性（底物差異活性）活性（底物差異活性） 與單鏈與單鏈 DNA 結(jié)合時(shí)活性最大結(jié)合時(shí)活性最大-依賴(lài)于依賴(lài)于 DNAc、 RecA 有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子有啟動(dòng)一個(gè)分子的單鏈侵入到另一雙螺旋分子 的能力，即聯(lián)會(huì)同源的能力，即聯(lián)會(huì)同源 DNA （但其靶（但其靶 DNA 必須有缺口結(jié)合必須有缺口結(jié)合DNA）RecA入侵單鏈入侵單鏈被置換連被

9、置換連RecA引發(fā)鏈侵入模型引發(fā)鏈侵入模型RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA啟動(dòng)的單鏈入侵啟動(dòng)的單鏈入侵RecA引起的鏈交換和引起的鏈交換和Holliday結(jié)構(gòu)的生成結(jié)構(gòu)的生成 （2）RecA 蛋白催化雙鏈和單鏈蛋白催化雙鏈和單鏈 DNA 的反應(yīng)階段的反應(yīng)階段a、 聯(lián)會(huì)前階段（緩慢）聯(lián)會(huì)前階段（緩慢） RecA 與單鏈結(jié)合與單鏈結(jié)合b、 單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)

10、，形成雙鏈連接分子單鏈與雙螺旋的互補(bǔ)鏈迅速配對(duì)，形成雙鏈連接分子 Holliday（5侵入）侵入）c、 從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長(zhǎng)的異源雙鏈從雙螺旋結(jié)構(gòu)中緩慢置換一條鏈產(chǎn)生一段長(zhǎng)的異源雙鏈 DNA 反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，RecA 結(jié)合到雙鏈上結(jié)合到雙鏈上 其中其中單鏈同化有固定的方向單鏈同化有固定的方向 入侵單鏈為入侵單鏈為53 雙鏈雙鏈 DNA 的互補(bǔ)鏈?zhǔn)堑幕パa(bǔ)鏈?zhǔn)?5 RecBCD 和和 RecA 的共同作用的共同作用 3、原核同源重組的其它蛋白、原核同源重組的其它蛋白 需要需要 E.coli 中三個(gè)基因中三個(gè)基因 ruvA,ruvB 和和 ruvC 的產(chǎn)物的產(chǎn)物 a、 Ru

11、vA 識(shí)別識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、 RuvB 為分枝遷移提供動(dòng)力（為分枝遷移提供動(dòng)力（ATPase 1020bp/s） c、 RuvC 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶-專(zhuān)一性識(shí)別專(zhuān)一性識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn) 體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體 E.coli 重組的各階段重組的各階段 （損傷修復(fù)）（損傷修復(fù)）損傷損傷DNADNA復(fù)復(fù)制產(chǎn)生缺口制產(chǎn)生缺口RecARecA鏈交換鏈交換第二次鏈交換第二次鏈交換DNApolDNApol通過(guò)通過(guò)DNADNA合成填滿缺口合成填滿缺口RuvA,BRuvA,B分枝遷移分枝遷移RuvCRuvC切割切割H

12、ollidayHolliday連接點(diǎn)連接點(diǎn)第二節(jié)第二節(jié) 位點(diǎn)專(zhuān)一性重組位點(diǎn)專(zhuān)一性重組一、位點(diǎn)專(zhuān)一性重組（一、位點(diǎn)專(zhuān)一性重組（ site-specific recombination）1、概念：發(fā)生在專(zhuān)一序列的、概念：發(fā)生在專(zhuān)一序列的DNA分子間的重組分子間的重組,有特異的有特異的 重組酶和輔助因子對(duì)其識(shí)別和作用。重組酶和輔助因子對(duì)其識(shí)別和作用。噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體基因組中屬此種重組2、位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果依賴(lài)于重組位點(diǎn)的位置和方向位點(diǎn)特異性重組的結(jié)果依賴(lài)于重組位點(diǎn)的位置和方向二、二、phagephage的整合與切除的整合與切除1、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：

13、、實(shí)現(xiàn)機(jī)制：均是通過(guò)均是通過(guò)-細(xì)菌細(xì)菌DNADNA和和DNADNA上特定位點(diǎn)之間的重組上特定位點(diǎn)之間的重組2、特定位點(diǎn)、特定位點(diǎn)-附著位點(diǎn)（附著位點(diǎn)（attachment site att） E.coli attB 含含BOB序列序列 23bp phage attP 含含 POP序列序列 240bp 核心序列核心序列 “ “O區(qū)區(qū)”完全一致完全一致 （同源部分（同源部分15bp15bp） -位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方3、整合過(guò)程、整合過(guò)程 整合后的附著位點(diǎn)為整合后的附著位點(diǎn)為 attL（BOP） attR（POB） 整合位點(diǎn)整合位點(diǎn)-attB、attP 切除位點(diǎn)切除位點(diǎn)-

14、attL、attR 整合過(guò)程需要整合過(guò)程需要整合酶整合酶 （integrase Int）（）（編碼編碼） 和和寄主的整合宿主因子寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用共同作用溶源性細(xì)菌溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期溶菌周期（lysis）原噬菌體原噬菌體4、整合分子機(jī)制、整合分子機(jī)制 核心序列核心序列O全長(zhǎng)全長(zhǎng)15bp，富含，富含A-T 發(fā)生在發(fā)生在O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距 7bp 整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：整合酶的結(jié)合位點(diǎn)：attP 240bp、attB 23bp(兩者的作用不同兩者的作用不同) attP位點(diǎn)的負(fù)超螺旋為重組所必須

15、位點(diǎn)的負(fù)超螺旋為重組所必須-加強(qiáng)了加強(qiáng)了Int和和IHF的親和的親和力力 -高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu)高劑量的蛋白維持單鏈重組所必需的結(jié)構(gòu) Int結(jié)合結(jié)合 -核心序列的反向位點(diǎn)（切割位置）核心序列的反向位點(diǎn)（切割位置） -結(jié)合在結(jié)合在att臂上（臂與核心區(qū)靠近）臂上（臂與核心區(qū)靠近）intIHFXis 整合體及其作用整合體及其作用 整合體（整合體（intasome）- Int和和IHF結(jié)合到結(jié)合到attP時(shí)的復(fù)合物時(shí)的復(fù)合物 整合體捕獲整合體捕獲attB 說(shuō)明說(shuō)明- a、attB和和attP的的最初識(shí)別靠最初識(shí)別靠Int 識(shí)別兩序列的能力識(shí)別兩序列的能力 b、兩序列的同源性?xún)尚蛄械耐?/p>

16、源性在鏈交換時(shí)為在鏈交換時(shí)為 重要因素重要因素 Int蛋白能蛋白能切斷切斷DNA，并使它重新，并使它重新連接連接，近而使，近而使holliday結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)拆分拆分 重組時(shí)重組時(shí)attP和和attB部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交部位交叉斷裂，互補(bǔ)單鏈末端進(jìn)行交叉雜交5、整合與切除的控制、整合與切除的控制（1） 整合整合 C-促使阻遏蛋白促使阻遏蛋白C的產(chǎn)生的產(chǎn)生 -與與int gene 的的PI結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生結(jié)合，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Int蛋白蛋白 -且且PI位于位于xis基因內(nèi)，基因內(nèi)，C與與PI結(jié)合導(dǎo)致結(jié)合導(dǎo)致xis gene失活失活（2） 切除切除 寄主寄主SOS反應(yīng)時(shí)反應(yīng)時(shí)-RecA大量產(chǎn)生，

17、促使阻遏蛋白大量產(chǎn)生，促使阻遏蛋白C的水解的水解 -把把OL和和OR從阻遏狀態(tài)釋放出來(lái)從阻遏狀態(tài)釋放出來(lái) -從從PL轉(zhuǎn)錄使轉(zhuǎn)錄使int和和xis表達(dá)表達(dá)細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌鞭毛蛋白H1和H2轉(zhuǎn)換四、四、依賴(lài)于同源重組的位點(diǎn)特異性的序列代換依賴(lài)于同源重組的位點(diǎn)特異性的序列代換 -酵母酵母MAT序列的轉(zhuǎn)換序列的轉(zhuǎn)換1、 酵母結(jié)合型的轉(zhuǎn)變酵母結(jié)合型的轉(zhuǎn)變-DNA序列的代換，而不是互換序列的代換，而不是互換 -依賴(lài)于序列的同源性依賴(lài)于序列的同源性 （被代換的序列命運(yùn)是被降解（被代換的序列命運(yùn)是被降解-突變?cè)囼?yàn)）突變?cè)囼?yàn)）2、 同源序列同源序列 匣子匣子 W X Y Z1 Z2 total

18、 HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 239 88 2369 HMRa 704 642 239 88 15853、 轉(zhuǎn)換過(guò)程轉(zhuǎn)換過(guò)程 內(nèi)切酶內(nèi)切酶(HO)識(shí)別、切割識(shí)別、切割-Y/Z1交界處交界處-起始起始MAT序列的轉(zhuǎn)序列的轉(zhuǎn)換換 (雙鏈斷裂雙鏈斷裂) HM匣子受匣子受Sir阻遏蛋白的保護(hù)阻遏蛋白的保護(hù) Y區(qū)域被降解，直到區(qū)域被降解，直到Y(jié)和和Ya相同的部分或一直到相同的部分或一直到X區(qū)域區(qū)域 四個(gè)斷頭侵入供體匣子的同源部分并與其中互補(bǔ)鏈配對(duì)四個(gè)斷頭侵入供體匣子的同源部分并與其中互補(bǔ)

19、鏈配對(duì) 以供體以供體DNA為模板復(fù)制為模板復(fù)制Y區(qū)域，區(qū)域，holliday結(jié)構(gòu)形成結(jié)構(gòu)形成 Holliday結(jié)構(gòu)的拆分，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)的拆分，產(chǎn)生新的MAT匣子和這次轉(zhuǎn)換中的供體匣子匣子和這次轉(zhuǎn)換中的供體匣子4、 特征特征-同源重組和位點(diǎn)特異性重組特征都具有同源重組和位點(diǎn)特異性重組特征都具有 需要大范圍的同源序列需要大范圍的同源序列 需要重組酶系（需要重組酶系（rad52基因產(chǎn)物、位點(diǎn)特異性的基因產(chǎn)物、位點(diǎn)特異性的HO內(nèi)切酶）內(nèi)切酶）第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)座作用轉(zhuǎn)座作用一、轉(zhuǎn)座子概述一、轉(zhuǎn)座子概述1、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子(元元)或轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座元件(transposon or transposable el

20、ement): 基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的基因組上不必借助于同源序列就可以移動(dòng)的DNA片段，它們可以直片段，它們可以直 接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）接從基因組的一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)（供體和受體）轉(zhuǎn)座（轉(zhuǎn)座（transposition）：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過(guò)程：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過(guò)程2、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展、發(fā)現(xiàn)和發(fā)展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉層花斑突變玉米果皮、糊粉層花斑突變 玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理 跳躍基因（跳躍基因（jumping gene） 1947 冷泉港實(shí)驗(yàn)室

21、（美）冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美） Barbara McClintock 基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的再次發(fā)現(xiàn)與證實(shí)基因轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的再次發(fā)現(xiàn)與證實(shí) 在一個(gè)操縱子中，在一個(gè)操縱子中， 與操縱基因毗連的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生終止與操縱基因毗連的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生終止突變后，它除了影響該基因本身產(chǎn)物的翻譯外，還影響突變后，它除了影響該基因本身產(chǎn)物的翻譯外，還影響其后結(jié)構(gòu)基因多肽的翻譯，并且具有極性梯度的特征。其后結(jié)構(gòu)基因多肽的翻譯，并且具有極性梯度的特征。 插入型極性突變的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理插入型極性突變的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理Operon & Polarity Mutation 極性突變的基本概念極性突變的基本概念A(yù)酶活性酶活性 O gene Z 基

22、因終止突變位基因終止突變位 點(diǎn)離點(diǎn)離O基因的距離基因的距離 I p o Z Y Ao20世紀(jì)60年代末期,在不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一系列可轉(zhuǎn)移的抗藥性轉(zhuǎn)座子o1983年Barbara McClintock被授予被授予諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。a) 不依賴(lài)不依賴(lài)供體序列供體序列與靶位點(diǎn)間序列的同源性與靶位點(diǎn)間序列的同源性b) 轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制轉(zhuǎn)座不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制HotspotsHotspots (熱點(diǎn)熱點(diǎn))Regional preferenceRegional preference ( 在在3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入?yún)^(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入) d) 某些轉(zhuǎn)座因子

23、（某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類(lèi)轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性）對(duì)同類(lèi)轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性 （免疫性）（免疫性）e) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù) f) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)3、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)、轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專(zhuān)一型）（插入專(zhuān)一型）二、二、Prok.轉(zhuǎn)座子種類(lèi)轉(zhuǎn)座子種類(lèi) 兩種類(lèi)型：兩種類(lèi)型： 簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simple transposon） （插入序列（插入序列 insertion sequence IS ） 復(fù)合轉(zhuǎn)座

24、子（復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon） 共同特征：共同特征： a）兩端有）兩端有2040bp的的IR b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（transposase）的基因）的基因1、插入序列、插入序列 最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分最簡(jiǎn)單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分 命名：命名： IS編號(hào)（鑒定類(lèi)型）編號(hào)（鑒定類(lèi)型） 長(zhǎng)度長(zhǎng)度 7002000bp 特點(diǎn)：特點(diǎn)： a）兩端）兩端IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變）為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變） b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（39bp） IS 可以正反方向插入

25、到可以正反方向插入到DNA（宿主、質(zhì)?；蚰承┦删w），（宿主、質(zhì)粒或某些噬菌體）， 常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)常對(duì)插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)a)a) Tn / TnA family Tn / TnA family l 具有具有IR、轉(zhuǎn)座酶基因、轉(zhuǎn)座酶基因、 調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb

26、 Tn3 IR TnpA Res TnpR AmpR IR 38bp 38bp 轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶 regulator - 內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶 2、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、復(fù)合轉(zhuǎn)座子 兩種類(lèi)型兩種類(lèi)型 b）兩端重復(fù)序列為兩端重復(fù)序列為IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子的復(fù)合轉(zhuǎn)座子 e.g. IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子IS ISIS IS L IS R臂臂 中心區(qū)中心區(qū) 臂臂transposition 當(dāng)兩個(gè)當(dāng)兩個(gè)IS組件相組件相同時(shí)，其中任一個(gè)都同時(shí)，其中任一個(gè)都可行使轉(zhuǎn)座功能可行使轉(zhuǎn)座功能 不同時(shí)，主要依不同時(shí)，主要依靠一個(gè)靠一個(gè) 兩側(cè)的兩側(cè)的IS既可以是既可以是IR，又

27、可以是，又可以是DR狀態(tài)狀態(tài)（IR多）多）3 轉(zhuǎn)座噬菌體轉(zhuǎn)座噬菌體 Mu phageMu phage （巨型轉(zhuǎn)座子（巨型轉(zhuǎn)座子 ） C repressor for A, Brepressor for A, BB 33 kd 與轉(zhuǎn)座有關(guān)與轉(zhuǎn)座有關(guān)A 70 kd 轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶U, S 毒性蛋白毒性蛋白attL, attR 與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需 Gin G區(qū)倒位酶區(qū)倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位區(qū)倒位區(qū) 38kbPgin 以以E.coli為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）為寄主的溫和型噬菌體（溶源、裂解）

28、Mu的插入途徑的插入途徑a） 侵入的侵入的Mu在溶源化過(guò)程中任意插入寄主在溶源化過(guò)程中任意插入寄主DNA （兩側(cè)各（兩側(cè)各5bp的靶位點(diǎn)序列重復(fù)）的靶位點(diǎn)序列重復(fù)）b） 進(jìn)入進(jìn)入裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代裂解生長(zhǎng)后，復(fù)制產(chǎn)生后代Mu DNA幾乎全部插入寄主幾乎全部插入寄主 DNA中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主中，并可繼續(xù)轉(zhuǎn)座（形成寄主DNA和和Mu的共合體），噬的共合體），噬 菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝菌體成熟時(shí)，切段共合體包裝三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式三、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)作機(jī)制及模式 三種類(lèi)型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型三種類(lèi)型：復(fù)制型、非復(fù)制型和保守型1、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式、復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式 實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件

29、被復(fù)制并被移動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過(guò)程實(shí)質(zhì)：轉(zhuǎn)座子元件被復(fù)制并被移動(dòng)到受體位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)座過(guò)程 擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)）擴(kuò)增了轉(zhuǎn)座子的拷貝（供、受點(diǎn)） 需兩種酶：需兩種酶： 轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端）轉(zhuǎn)作酶（作用于原拷貝兩末端） 解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝）解離酶（作用于復(fù)制后的拷貝） 模式：模式： 兩大步兩大步 a) 共合體形成共合體形成 切口連接復(fù)制切口連接復(fù)制 b) 拆分拆分 靶位點(diǎn)的靶位點(diǎn)的DR形成形成2、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座模式 供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂供體上最終產(chǎn)生雙鏈斷裂 供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有供體位點(diǎn)如不能被修復(fù)則有致致 死效應(yīng)死效應(yīng)3、保守型轉(zhuǎn)座模式、保守型轉(zhuǎn)

30、座模式 另一種非復(fù)制型另一種非復(fù)制型 與與整合機(jī)制相似整合機(jī)制相似 其轉(zhuǎn)座酶與其轉(zhuǎn)座酶與整合酶家整合酶家 族有關(guān)族有關(guān)4、TnA轉(zhuǎn)座模式轉(zhuǎn)座模式 復(fù)制型轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶(tnpA)、 解離酶解離酶(tnpR) 解離酶需要特異的內(nèi)解離酶需要特異的內(nèi) 部位點(diǎn)部位點(diǎn) 雙重功能：解離功能雙重功能：解離功能 tnpA及自身的阻遏物及自身的阻遏物 拆分位點(diǎn)拆分位點(diǎn) res 共合體拆分位點(diǎn)共合體拆分位點(diǎn) 轉(zhuǎn)座結(jié)果產(chǎn)生轉(zhuǎn)座結(jié)果產(chǎn)生5bp 的正向重復(fù)序列的正向重復(fù)序列 四、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控四、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座頻率的調(diào)控 每個(gè)轉(zhuǎn)座子控制自身轉(zhuǎn)座的核心每個(gè)轉(zhuǎn)座子控制自身轉(zhuǎn)座的核心-控制轉(zhuǎn)座酶的水平控制轉(zhuǎn)座

31、酶的水平 1、Tn10轉(zhuǎn)座機(jī)制轉(zhuǎn)座機(jī)制 Tn10為復(fù)合型轉(zhuǎn)座子為復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 IS10R元件提供轉(zhuǎn)座酶活性元件提供轉(zhuǎn)座酶活性-合成轉(zhuǎn)座酶的序列合成轉(zhuǎn)座酶的序列 自發(fā)轉(zhuǎn)座頻率自發(fā)轉(zhuǎn)座頻率-107 Tn10轉(zhuǎn)座酶水平是控制轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵轉(zhuǎn)座酶水平是控制轉(zhuǎn)座的關(guān)鍵 有兩種控制轉(zhuǎn)座的方式有兩種控制轉(zhuǎn)座的方式 a） 通過(guò)反義通過(guò)反義RNA的翻譯水平控制的翻譯水平控制 IS10R外側(cè)邊緣兩個(gè)啟動(dòng)子外側(cè)邊緣兩個(gè)啟動(dòng)子 PIN控制控制IS10R的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄 弱啟動(dòng)子弱啟動(dòng)子 POUT強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子 右向轉(zhuǎn)錄宿主右向轉(zhuǎn)錄宿主DNA INRNA和和OUTRNA 有有36bp的重疊的重疊 穩(wěn)定性：穩(wěn)定性： OUTRN

32、AINRNA 大量大量OUTRNA作為作為 INRNA的反義的反義RNA b） 甲基化作用控制轉(zhuǎn)座酶合成及其與甲基化作用控制轉(zhuǎn)座酶合成及其與DNA的結(jié)合的結(jié)合 Tn10轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子含有轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子含有GATC序列（其它轉(zhuǎn)座子）序列（其它轉(zhuǎn)座子） E.coli中中Dam甲基化酶甲基化酶 作用使啟動(dòng)子相對(duì)鈍化作用使啟動(dòng)子相對(duì)鈍化 只能利用剛剛復(fù)制完成只能利用剛剛復(fù)制完成 時(shí)出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)座酶時(shí)出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)座酶 此外，此外，IS10R的末端的末端 IR也含有也含有GATC， 甲基化的甲基化的GATC不能不能 結(jié)合轉(zhuǎn)座酶結(jié)合轉(zhuǎn)座酶 Tn10在在DNA剛剛剛剛 復(fù)制后發(fā)生轉(zhuǎn)座復(fù)制后發(fā)生轉(zhuǎn)座五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)五、轉(zhuǎn)座子的某些遺傳學(xué)效應(yīng)1.轉(zhuǎn)座頻率10-810-3，引起插入突變；2.插入位置染色體重排而出現(xiàn)新基因；3.影響插入位置鄰近基因的表達(dá),使宿主表現(xiàn)型改變；4.引起染色體插入位點(diǎn)兩側(cè)染色體畸變。 真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類(lèi)：真核生物的轉(zhuǎn)座成分根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制目前分為兩類(lèi)： a) 轉(zhuǎn)座機(jī)制與細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子類(lèi)似轉(zhuǎn)座機(jī)