生物選修三專題一：基因工程

1、生物選修三專題一基因工程1、 基因工程基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做DNA重組技術(shù)。2、 DNA重組技術(shù)的基本工具（1）“限制性核酸內(nèi)切酶分子手術(shù)刀”來源：主要從原核生物中分離純化而來（注：為什么存在于原核生物中：原核生物易受自然界外源DNA的入侵，限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會利用限制酶將外源DNA切割掉，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。）種類：已經(jīng)分離出大約4000種作用：1、識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列 2、使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，分成脫氧核糖和磷酸作用結(jié)果：形成兩種末端：黏性末端或平末端常見的限制酶：EcoR

2、I（在G和A之間切割）被限制酶在它識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。SmaI（在G和C之間切割）當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 為什么限制酶不剪切自己的DNA：細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。（

3、2） “DNA連接酶分子縫合針”作用效果：把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵（即把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來）注：兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來，DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！兩種DNA連接酶（E·coliDNA連接酶和T4-DNA連接酶）的比較：相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。區(qū)別：E·coliDNA連接酶來自大腸桿菌，只能連接黏性末端； T4DNA連接酶來自T4噬菌體，能連接黏性末端和平末端，但連接平末端效率較低與DNA聚合酶作用的異同相同點(diǎn)：作用實(shí)質(zhì)：都能催化形成磷酸二酯

4、鍵 化學(xué)本質(zhì)：都是蛋白質(zhì)不同點(diǎn)：DNA聚合酶：不需要模板，在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，結(jié)果形成完整 的重組DNA分子，應(yīng)用于基因工程。 DNA連接酶：需要模板，只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸 二酯鍵，結(jié)果形成DNA的一條鏈，應(yīng)用于DNA復(fù)制。（3） “分子運(yùn)輸車”運(yùn)載體作用：1）作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中 2）在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制成為運(yùn)載體的必要條件：1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇。4）必須是安全的 ，對受體細(xì)胞無害。5）載體DNA 分子應(yīng)大小適中，以

5、便于提取和操作載體的種類：細(xì)菌的質(zhì)粒病毒：噬菌體衍生物、動植物病毒等。質(zhì)粒：獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。有一至多個(gè)限制酶切個(gè)位點(diǎn)，供外源DNA插入其中。攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后在細(xì)胞中進(jìn)行同步復(fù)制。在質(zhì)粒DNA分子上有獨(dú)特的標(biāo)記基因（如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因）供重組DNA的鑒定和選擇。（注：實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。）例1、基因工程中，須使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶的識別序列和切點(diǎn)是GGATCC，限制酶的識別序列和切點(diǎn)是

6、GATC。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是( )A目的基因和質(zhì)粒均用限制酶切割B目的基因和質(zhì)粒均用限制酶切割C質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D質(zhì)粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割答案：D例2、圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有Msp 、BamH 、Mbo 、Sma 4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。請回答下列問題：（1）圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個(gè)堿基之間依次由連接。（2）若用限制酶Sma 完全切割圖1中DNA片段，產(chǎn)生的末端是末端，其產(chǎn)物長度

7、為。（3）若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對被TA堿基對替換，那么基因D就突變?yōu)榛騞。從雜合子分離出圖1及其對應(yīng)的DNA片段，用限制酶Sma 完全切割，產(chǎn)物中共有種不同DNA片段。（4）若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是。答案：（1）脫氧核糖、磷酸、脫氧核糖（2）平537bp、790bp、661bp（3）4（4）BamH I 抗生素B同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向

8、連接3、基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定3、 基因的結(jié)構(gòu)相關(guān)概念：啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。4、 真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較相同點(diǎn)：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)。不同點(diǎn)：原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真核細(xì)胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。注：外顯子：真核細(xì)

9、胞基因DNA中的編碼序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進(jìn)而翻譯為蛋白質(zhì)。內(nèi)含子：真核細(xì)胞基因DNA中的間插序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA但隨即被剪除而不翻譯。 5、 目的基因：主要是指編碼蛋白質(zhì)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因等。6、目的基因的獲取的方法從基因庫中獲取目的基因應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因用化學(xué)方法直接人工合成目的基因（1） 從基因庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。基因文庫中包含了一種生物

10、所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫?；蛭膸熘邪艘环N生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫。如：cDNA文庫。基因組文庫的建立方法：基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別：（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因定義：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因原理：DNA復(fù)制（DNA分子熱變性（在9095 OC時(shí)，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù)中不需要解旋酶（與復(fù)制不同之在處)儀器：PCR擴(kuò)增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）a. DNA熱變性（9095 OC)：雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形成單鍵DNAb.

11、復(fù)性或退火（5560 OC)：系統(tǒng)溫度降低，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNAc. 延伸（7075 OC)：在Taq酶作用下，合成與模板互補(bǔ)的DNA子鏈，形成雙鏈DNAd.重復(fù)a.b.c步驟每重復(fù)一次，目的基因增加一倍擴(kuò)增為指數(shù)形式擴(kuò)增(n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)），在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增大量目的基因。（3） 用化學(xué)方法直接人工合成目的基因原理：蛋白質(zhì)氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因序列目的基因適用對象：基因比較小，核苷酸序列又已知思考：人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？答：不具有，缺少非編碼區(qū)(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。7、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心作用

12、：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代。同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。組成：目的基因啟動子：是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位終止子：是使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止標(biāo)記基因：是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來（注：不同受體細(xì)胞，目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建有所差異。8、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程常見轉(zhuǎn)化方法：（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（80%的轉(zhuǎn)基因植物通過該法獲得）花粉管通道法基因槍法（2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射法。（3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞法。

13、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：利用農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上的特點(diǎn)。花粉管通道法操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞特點(diǎn)：簡便經(jīng)濟(jì)例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉基因槍法操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力 ，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。適用：單子葉植物（2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射法。細(xì)胞類型：受精卵操作程序（右圖）（3） 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞法微生物作受體細(xì)胞

14、原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞過程：注：通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白不可以大腸桿菌作為工程菌嗎，可以用酵母菌作為工程菌原因：糖蛋白上的糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細(xì)胞中，大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不含這兩種細(xì)胞器，而酵母菌為真核生物（真菌類）9、 目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功（1）檢測方法：分子雜交技術(shù)：DNA分子與DNA分子的之間雜交DNA分子與RNA分子的之間雜交蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲、抗病結(jié)種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)DNA分子雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因。DNA分子與RNA分子的之間雜交檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)如果出現(xiàn)雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)翻譯成蛋白質(zhì)。例3、德國科學(xué)家最近培育出一種可以生產(chǎn)乙肝疫苗的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜,通過生吃或者榨汁食用,就可以達(dá)到接種疫苗的效果。下圖為乙肝疫苗的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜生產(chǎn)部分過程的示意圖。 (1)獲得含目的