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文檔簡介

1、    腎上腺髓質(zhì)素在心血管系統(tǒng)的分布及在心血管功能 調(diào)節(jié)中的作用        摘要目的:觀察腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,AdM)在大鼠心血管系統(tǒng)的分布及縮血管活性肽對血管平滑肌細胞中腎上腺髓質(zhì)素表達的影響。方法與結(jié)果:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(ABC法)證實,在大鼠的外周組織,尤其是主動脈和心肌等心血管組織以及培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和心肌細胞,均含有豐富的免疫活性的腎上腺髓質(zhì)素。應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RTPCR)分析方法證實,縮

2、血管活性肽內(nèi)皮素(ET1)和血管緊張素(AGT)可明顯地降低培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中腎上腺髓質(zhì)素mRNA水平,這一作用可選擇性地分別被ET1的特異性受體阻斷劑BQ123和AGT的特異性受體阻斷劑Dup753所抑制,提示ET1AGT可抑制腎上腺髓質(zhì)素的表達。應(yīng)用3HTdR摻入和細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),腎上腺髓質(zhì)素可抑制培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血管平滑肌細胞的DNA合成和細胞增殖。結(jié)論:心血管系統(tǒng)含有豐富的腎上腺髓質(zhì)素,其表達受ET1和AGT的調(diào)控,它可能作為一種增殖抑制因子而抑制SHR血管平滑肌細胞DNA合成和細胞增殖。關(guān)鍵詞腎上腺髓質(zhì);肌,平滑,血管;免疫組織化學(xué) Distribution of

3、adrenomedullin in cardiovascular system and its effect on cardiovascular functionWEI Ying-Jie,ZHU Yan-Qing,CAO Yi-Wen,F(xiàn)U Ai-Hua,CHANG ZhaoKang,TANG JianInstitute of Cardiovascular Research,Beijing Medical University,Beijing(100083)AbstractAIM:The present study was designed to evaluate the distributi

4、on of adrenomedullin(AdM) in the cardiovascular system,and the effect of endothelin and angiotensin on the AdM expression in cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs).METHODS and RESULTS:Using immunohistochemistry method(ABC method),we demonstrated that high concentration of immunoreactive AdM wa

5、s widely distributed in rat peripheral tissures,especially in cardiovascular tissue including artery and heart as well as cultured vascular endothelial cells,VSMCs and cardiomyocyte.By semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR) analysis,we found that the levels of AdM mR

6、NA were decreased by endothelin(ET1) or angiotensin (Ang) in VSMCs,which could be blocked by ET-1 antagonist BQ123 and Ang antagonist Dup753,respectively.It suggested that ET1Ang may inhibit the expression of AdM mRNA.With3HTdR incorporation and cell count,we found that AdM could inhibit DNA synthes

7、is and the proliferation of VSMCs from spontanously hypertensive rats(SHR).CONCLUSION:Plenty of AdM was widely distributed in cardiovascular system,and the expression of AdM mRNA is regulated by ET1 and AGT.Besides,AdM may act as an inhibitor on DNA synthesis and cell proliferation of SHR VSMCs.MeSH

8、Adrenal medulla;Muscle,smooth,vascular; Immunohistochemistry腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,AdM)是1993年發(fā)現(xiàn)的一種由52個氨基酸組成的新型的血管活性肽1。因其最初是從腎上腺髓質(zhì)中分離出來的,而且在腎上腺髓質(zhì)中含量豐富,因此被命名為“腎上腺髓質(zhì)素”。編碼人、大鼠和豬AdM前體的cDNA已經(jīng)克隆出來2,它們所編碼的AdM在不同種屬之間具有高度的同源性。靜脈注射AdM具有舒張血管和持續(xù)強烈的降低血壓作用1,2。側(cè)腦室注射AdM可使血壓升高和心率加快3。AdM在體內(nèi)分布廣泛。應(yīng)用放射免疫和Northern blot分子雜交

9、方法證明,血管內(nèi)皮細胞,腎上腺髓質(zhì),心臟,肺,腎,十二指腸和頜下腺等外周組織均含有免疫活性的AdM及其mRNA1,2。應(yīng)用放射免疫,免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)RTPCR方法證明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有免疫活性的AdM及其mRNA的廣泛分布4,5。另外,在血液中也含有豐富的AdM1。因此,AdM可能作為一種心血管局部激素,神經(jīng)激素和循環(huán)激素參與心血管功能的調(diào)節(jié)。本研究進一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法證明,在大鼠的外周組織,尤其是心血管系統(tǒng)含有豐富的AdM;在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用半定量RTPCR方法觀察了縮血管活性肽ET1和AGT對血管平滑肌細胞AdM mRNA表達的影響。另外,應(yīng)用3HTdR摻入和細胞計數(shù)觀察了

10、AdM對SHR血管平滑肌細胞增殖的影響,以探討它在SHR血管平滑肌細胞增殖中的意義。材料與方法一、免疫組織化學(xué)染色:兔抗大鼠AdM多克隆抗體由美國Phoenix公司提供。免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自北京華美生物工程公司。本實驗選用的動物為Wistar大鼠,體重250 g,斷頸處死后立即取主動脈,心,肝,腎和腎上腺,置于4%多聚甲醛固定液中。固定12 h后,浸蠟包埋,切成10 m厚的石蠟切片,經(jīng)透明、脫水后進行染色。免疫染色程序參考Hsu等人所建立ABC免疫組織化學(xué)染色方法6。第一抗體的稀釋度為1600。陰性對照片省去一抗。本實驗選用培養(yǎng)的血管平滑肌細胞,內(nèi)皮細胞和心肌細胞,使細胞爬于蓋玻片上,經(jīng)

11、透明,脫水后進行免疫染色,方法同上。二、細胞培養(yǎng):取68周齡的雄性SHR和WKY大鼠和新生小牛的胸主動脈段,分別培養(yǎng)血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。本實驗選用58代細胞進行實驗。取新生3 d的Wistar大鼠乳鼠的心臟,進行心肌細胞原代培養(yǎng)。本實驗選用13代細胞進行實驗。三、半定量RTPCR分析:從培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞提取總RNA。采用紫外吸收法進行RNA定量,各組RNA樣品的OD260nmOD280nm吸光度比值均在1.82.0之間。將2g的總RNA反轉(zhuǎn)錄成為相應(yīng)的cDNA。參照大鼠的AdM前體cDNA核苷酸序列合成正義和反義寡聚核苷酸引物。大鼠AdM前體的正義和反義引物分別為5T CGC T

12、AC AGA ATG AAG CTG G3(1010)和5AT ACT CGC CCG ACT GTT CAA3(573592),其擴增產(chǎn)物為603 bp。以GAPDH mRNA水平作為內(nèi)對照,其正義和反義引物分別為5TCCCTC AAG ATT GTC CAG CAA3和5AGATCCACAACGGATACATT3),其擴增產(chǎn)物為309bp。半定量PCR參照Martin等人建立的方法7。PCR反應(yīng)液中加入18.5×104Bq32PdCTP。PCR的條件為:94變性1 min,56退火1.5 min,72延伸2.5 min,擴增30個循環(huán)。取15 LPCR產(chǎn)物,在含有溴化乙錠的1.5

13、%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。在紫外燈下將相應(yīng)的PCR產(chǎn)物切下,烤干后放入閃爍液中過夜,然后進行計數(shù)。以AdM cDNA的計數(shù)值與內(nèi)對照GAPDH cDNA的計數(shù)值之比作,比較各組之間AdM mRNA表達水平的差異。四、3H胸腺嘧啶核苷(TdR)摻入實驗:將貼壁生長的細胞用胰蛋白酶消化制成細胞懸液,用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液接種于24孔板中(5×104個孔)。24 h后換無血清RPMI1640培養(yǎng)液以使細胞生長同步化,繼續(xù)卵育24 h后分別加入不同的處理因素,16 h后加入3H胸腺嘧啶核苷(3HTdR,3.7×104Bq*gL1*mL1,摻入8 h后終止反應(yīng),經(jīng)

14、微孔膜(:0.45 m)收集細胞并用10%AcCl3破碎細胞膜,膜烘干后置于閃爍瓶中,每瓶中加入8 mL閃爍液(PPO/POPOP/二甲苯),靜置過夜后在液體閃爍計數(shù)器上進行放射強度檢測。結(jié)果一、腎上腺髓質(zhì)素在外周組織和心血管細胞的分布:Fig 1Immunohistochemical staining for adrenomedullin (AdM) in the peripheral tissues.Arrows point at positive immunostaining.Original magnification×4001外周組織中腎上腺髓質(zhì)素的免疫組織化學(xué)染色應(yīng)用免疫

15、組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn),在大鼠的主動脈,心臟,肝臟,腎臟和腎上腺髓質(zhì)中均含有AdM的免疫陽性顆粒(1)。在主動脈的內(nèi)皮層和平滑肌層均有AdM免疫陽性顆粒分布;在心臟,AdM免疫陽性顆粒主要分布于心肌細胞;在肝臟,AdM免疫陽性顆粒分布于肝竇周圍;在腎臟,AdM免疫陽性顆粒分布于近曲小管和遠曲小管上皮細胞;在腎上腺,AdM免疫陽性顆粒分布于髓質(zhì)部。因腎上腺髓質(zhì)中的AdM含量豐富,因此我們選用腎上腺髓質(zhì),通過省去第一抗體的方法作為陰性對照片。結(jié)果顯示,作為陰性對照片的腎上腺髓質(zhì)中不含AdM免疫陽性顆粒。另外,我們還觀察了腎上腺髓質(zhì)素在離體培養(yǎng)的心血管細胞的分布,結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞,平滑肌細胞

16、和心肌細胞均有AdM免疫陽性顆粒,而其相應(yīng)的陰性對照片(省去一抗)不含有AdM免疫陽性顆粒(2)。Fig 2Immunohistochemical staining for adrenomedullin (AdM) in the cultured cardiovascular cells.Arrows point at positive immunostaining.Original magnification×4002培養(yǎng)的心血管細胞中腎上腺髓質(zhì)素的免疫組織化學(xué)染色二、縮血管活性肽對血管平滑肌細胞中AdM mRNA表達的影響:應(yīng)用半定量RTPCR分析發(fā)現(xiàn),在血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中加

17、入107mol/L的內(nèi)皮素(ET1)可抑制AdM mRNA的表達,應(yīng)用ET1的特異性受體阻斷劑BQ123(106 mol/L)可以抑制這一效應(yīng)。結(jié)果如3所示。在血管平滑肌細胞培養(yǎng)液中加入107mol/L的血管緊張素(AGT)也可抑制AdM mRNA的表達,應(yīng)用AGT的特異性受體阻斷劑Dup753(106mol/L)也可抑制這一效應(yīng)。結(jié)果如4所示。三、AdM對SHR血管平滑肌細胞增殖的抑制作用:在SHR大鼠血管平滑肌細胞無血清培養(yǎng)液中加入106mol/L的AdM,48 h后分別進行細胞計數(shù)和3HTdR摻入量的測定。經(jīng)3次重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn),加入AdM后48 h,SHR大鼠血管平滑肌細胞數(shù)目(6.2&#

18、177;0.3)×104well明顯低于對照組(10.7±0.7)×104well,SHR大鼠血管平滑肌細胞的DNA合成(1343±195)counts*min1也受到明顯的抑制(1037±98)counts.min1。t檢驗表明,AdM抑制平滑肌數(shù)目的增加和DNA合成的作用與對照組相比均具有顯著差異(P0.05)。討論有關(guān)AdM在外周組織的分布,都是應(yīng)用放射免疫和Northern blot雜交的方法證明的。我們首次應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn),不僅在大鼠的腎上腺髓質(zhì)中存在AdM的免疫陽性顆粒,在血管,心臟,肝臟和腎小管也都有AdM免疫陽性顆粒存

19、在,特別是在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞,平滑肌細胞和心肌細胞,也有AdM免疫陽性顆粒分布。因此,我們和國外實驗室的結(jié)果均提示,AdM不僅是腎上腺髓質(zhì)和和血管內(nèi)皮細胞合成分泌的一種循環(huán)激素,它也是由血管內(nèi)皮細胞,平滑肌細胞和心肌細胞分泌的一種局部激素,它可能以自分泌,旁分泌和胞內(nèi)分泌的方式發(fā)揮其調(diào)節(jié)心血管功能的作用。Fig 3Effect of ET1 on the levels of AdM mRNA in VSMCs by RT-PCR.*P0.01 vs control, P0.01,vs ET1(±S,n5)3內(nèi)皮素對血管平滑肌細胞中腎上腺髓質(zhì)素mRNA水平的影響 有關(guān)AdM的基因表達

20、調(diào)控目前報告還不多。有文獻表明,在培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞,地塞米松,氫化考的松和T3都可促進AdM mRNA表達8。IL1,IL1,TNF和TNF以及細菌脂多糖(LPS)也可明顯促進血管平滑肌細胞AdM mRNA的表達9。本工作在培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中加入ET1和AGT,發(fā)現(xiàn)可使AdM mRNA水平降低,這一作用可分別被ET1的特異性受體阻斷劑BQ123和AGT的特異性受體阻斷劑Dup753所抑制。這說明AdM mRNA水平受縮血管活性肽ET1和AGT的調(diào)控。Fig 4Effect of AGT on the levels of AdM mRNA in VSMCs by RT-PC

21、R.*P0.01 vs control,P0.01,vs ET1 (±S,n5)4血管緊張素對血管平滑肌細胞中腎上腺髓質(zhì)素mRNA水平的影響 我們以前的研究發(fā)現(xiàn),AdM對正常大鼠血管平滑肌細胞增殖無明顯影響,但可抑制ET所致的血管平滑肌細胞的增殖,其作用是通過降低血管平滑肌細胞內(nèi)絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)的活性實現(xiàn)的10。本研究發(fā)現(xiàn),AdM可抑制自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血管平滑肌細胞的增殖,因此我們認為,AdM可能在抑制血管平滑肌細胞的過度增殖時發(fā)揮作用,它可能是一種血管平滑肌細胞過度增殖的抑制因子。*黑龍江省武警總隊醫(yī)院*Phoenix Pharmaceuticals Inc

22、.,2462 Wyandotte Street,Mountain View,California 94043,U.S.A.作者單位:北京醫(yī)科大學(xué)心血管基礎(chǔ)研究所(北京 100083)參考文獻1Kitamura K,Kangawa K,Kawamoto M,et al.Adrenomedullin:A novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma.Biochem Biophys Res Commun,1993,192:553.2Sakata J,Shiimokubo T,Kitamura K,et al.Molecu

23、lar cloning and the biology activities of rat AdM,a hypotensive peptide.Biochem Biophys Res Commun,1993,195:921.3Wei YJ,Tian Q,Tang J,et al.Hemodynamic effcts of centrally administered adrenomedullin1352 in anesthetized rats.Biol Signals,1995,4:338.4Wei YJ,Li QH,Song LW,et al.The central distribution of adrenomedullin and its effects on blood pressure and heart rate in rats.Chi Med Sci J,1996,11:1.5Satoh F,Takahashi K,Murakami O,et al.AdM in human brain,adrenal glands and tumour tissues of pheochromocytoma,ganglioneuroblastoma and neuroblast

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