shRNA原理及設(shè)計(jì)

1、 shRNA原理及設(shè)計(jì)RNAi概述：RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡(jiǎn)單的說是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基

2、因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達(dá)量的降低，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。RNAi技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能學(xué)，藥物靶點(diǎn)篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等。RNAi基本原理示意圖：RNAi類別：1、siRNA合成：原理：在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個(gè)堿基的位置切割mRNA?；瘜W(xué)合成的siRNA具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)染效率高、對(duì)細(xì)胞的或者組織的毒副作用小、可大規(guī)模制備

3、等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基因靶位點(diǎn)不確定情況下，進(jìn)行siRNA有效片段的篩選。2、microRNA干擾載體構(gòu)建：原理：載體采用Pol II啟動(dòng)子表達(dá)人工設(shè)計(jì)的微小RNA (miRNA), 后者從長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本被加工，進(jìn)而導(dǎo)致特異性的mRNA的降解。3、shRNA干擾載體構(gòu)建：短發(fā)卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表達(dá)載體并表達(dá)短的干擾RNA (siRNA, 19-21個(gè)核苷酸的RNA 雙鏈)的DNA分子。我們可根據(jù)靶標(biāo)設(shè)計(jì)短發(fā)卡RNA (shRNA)序列并將其克隆到特定載體上。4、慢病毒RNAi：原理：慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，作為基因治

4、療載體發(fā)展起來，最近已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA/miRNA載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，lentivirusshRNA/miRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。5、腺病毒RNAi：原理：腺病毒（adenovirus，AV）是一種沒有包膜的線狀雙鏈DNA，它能感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，在核內(nèi)以神經(jīng)元細(xì)胞的形式復(fù)制，存在多種AV血清型。到目前為止

5、，構(gòu)建的絕大多數(shù)載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方法取代E1或E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在表達(dá)高水平E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此適合應(yīng)用于治療的高效控制系統(tǒng)。腺病毒載體能夠高效傳遞和表達(dá)基因的能力（尤其是在體外），由于具有宿主范圍廣，對(duì)人致病性低；在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因；能有效進(jìn)行增殖，滴度高；與人類基因同源；不整合到染色體中，無插入致突變性。對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代或非分裂細(xì)胞，采用病毒遞送miRNA/shRNA的方式是非常有效的選擇。幾個(gè)概念的區(qū)分：shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短發(fā)夾RNA，是設(shè)計(jì)為能夠形成發(fā)夾結(jié)

6、構(gòu)的非編碼小RNA分子，可通過RNA干擾來抑制基因的表達(dá)。Thomas Rosenquist和Greg Hannon小組聯(lián)合研究了在哺乳動(dòng)物種系細(xì)胞中shRNAs的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定沉默的機(jī)制。microRNA（miRNA，微小RNA）是由內(nèi)源性發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生而來的一種長(zhǎng)為19 nt25 nt的單鏈RNA。在每種高等動(dòng)物中，存在200種以上的miRNA，是最大的基因家族之一，約占基因組的1%。siRNA：(short/small interfering RNAs)：即小干擾RNA，是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這

7、個(gè)過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干擾技術(shù)中用到的小分子RNA，其不同之處在miRNA 是單鏈RNA，其余均為雙鏈RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通過載體導(dǎo)入細(xì)胞后，然后利用細(xì)胞內(nèi)的酶切機(jī)制得到siRNA而最終發(fā)揮RNA干擾作用。miRNA與shRNA圖示：shRNA（短發(fā)夾RNA）的設(shè)計(jì)：1.克隆到shRNA表達(dá)載體中的shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol啟動(dòng)子控制。隨后在連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止子。2.兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點(diǎn)。 3.Stratagene發(fā)現(xiàn)29個(gè)寡核苷酸較之原先推薦的23個(gè)寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。 4.在啟動(dòng)子下游的酶切位點(diǎn)下方緊連一個(gè)C，使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。 5.ShRNA目的序列的第一個(gè)堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè)G。 6.ShRNA插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運(yùn)用過。其中包含一個(gè)獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)的莖環(huán)利于檢測(cè)帶有shRNA插入片段的克隆。在比較了眾多