依賴線粒體通路的凋亡

1、一、一、Bc1-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控效應(yīng)二二、線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路的研究進(jìn)展郭東北郭東北Bcl-2蛋白家族目前已發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員超過25種,根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可以分為三類:第類具有抑制凋亡的作用,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、A1/Bfl-1、Boo/Diva/Bcl-B、NR-13、ORF16、LMW5-HL、ELB-19和CED-9等,這些蛋白含有4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域BH1、BH2、BH3、BH4.第類具有促進(jìn)凋亡的作用,包括Bax、Bak、Bok/Mtd和Bax-xs.第類只含有BH3結(jié)構(gòu)域,因此被稱為BH3-only蛋白,包括Bid

2、、Bad、Noxa、Puma、Bmf、Biml/Bod、Bik/Nbk和EGL-1等. Bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機制Bcl-2蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的確切作用機制尚未闡明，一般認(rèn)為是多種途徑的共同作用：1、Bcl-2蛋白家族與線粒體在體外實驗中，Bax促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，PTP可作為線粒體的刺激感受器和接受某些受體有關(guān)的信號，它包括位于膜間隙的腺瞟呤核苷酸和外膜的電位依賴性離子通道。PTP的開放可形成正反饋擴大過程，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，線粒體外基質(zhì)內(nèi)流，滲透壓失衡，細(xì)胞器腫脹，線粒體的內(nèi)、外膜依次裂解，釋放出caspase，激活蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2、 B

3、cI-X1抑制PTP開放，阻止細(xì)胞凋亡。Bcl-2和BcI-X1抑制細(xì)胞凋亡的部分原因是阻斷了細(xì)胞色素C從線粒體釋放，cytoc是凋亡蛋白酶激活的關(guān)鍵因素。2、Bcl-2蛋白的相互作用Bcl-2和 Bax既可以以同源 二聚體形式存在，也可以形成異源二聚體。Bcl-2、Bax和 Bcl-x三者形成了一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)：當(dāng)Bax同源二聚體形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；隨著Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，越來越多的Bax二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2，異源二聚體，從而“中和”了Bax-Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，即Bcl-2與 Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生；而當(dāng)Bcl-Xs存在時

4、，優(yōu)先與Bcl-2形成異源二聚體，而使游離的Bax得以形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡。這一模型也許可以解釋為什么Bcl-2表達(dá)并不一定有抑制細(xì)胞凋亡作用。3、Bcl-2蛋白與細(xì)胞內(nèi)Ca2+有研究表明：細(xì)胞內(nèi)Ca2+是細(xì)胞凋亡的始動因素。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法研究發(fā)現(xiàn)：定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Bcl-2可能通過阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)中的流動，使依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細(xì)胞凋亡。 4、 Bcl-2蛋白與氧自由基Bcl-2通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能。Hockenbery等發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因缺陷小鼠可發(fā)現(xiàn)兩種與氧化還原有潛在的聯(lián)系的疾病一多囊腎和色素沉著不足，揭示Bcl

5、-2具有抗氧化作用，它可阻止產(chǎn)生的活性氧族通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成細(xì)胞損害，但以后研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2過表達(dá)可阻止cytoc的釋放，改變了與 cytoc依賴激活caspase途徑相伴的氧化還原信號，減少活性氧族的生成，同時阻止線粒體膜電位的 下降、抑制細(xì)胞凋亡。5、其他實驗研究結(jié)果 verhaegen等在新生鼠心肌細(xì)胞的研究中認(rèn)為Bcl-2基因調(diào)控是通過細(xì)胞內(nèi)GMP含量的增加來實現(xiàn)的。近年來人們又發(fā)現(xiàn) Bd-2可參與白細(xì)胞介素2R介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，使抗原特異性T細(xì)胞免受射線和地塞米松誘導(dǎo)的凋亡。 小結(jié)小結(jié)Bcl-2可通過多種途徑抑制凋亡，但在某些情況下Bcl-2并不能抑制細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，Bcl-2

6、不能防止補體、TC（膽固醇）、腫瘤壞死因子，H2O2等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路細(xì)胞凋亡通路細(xì)胞凋亡通路-死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。1、死亡受體信號通路-死亡受體配體主要通過以下幾個方面啟動信號傳導(dǎo)：受體齊聚、特殊銜接蛋白募集和半胱氨酸蛋白酶（caspase） 級聯(lián)活化，最紅導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2、線粒體信號通路-細(xì)胞內(nèi)外各種刺激信號引起B(yǎng)H3-only 蛋白激活 ,通過 Bcl-2 家族調(diào)控線粒體 ,使線粒體外膜滲透而導(dǎo)致細(xì)胞色素 C 及Smac流入胞質(zhì)與Apaf-1 及caspase-9結(jié)合形成復(fù)合體。Caspase-9 的

7、激活將引起其下游胱天蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng) ,導(dǎo)致該細(xì)胞凋亡。3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路-這一信號傳導(dǎo)通路包括非折疊蛋白反應(yīng)和鈣離子起始信號等機制, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可特異性激活 caspase- 12, caspase- 12裂解 caspase- 3 等下游效應(yīng)蛋白酶, 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。1、BH32only 蛋白的激活蛋白的激活BH3-only 蛋白主要受死亡受體非依賴的凋亡刺激而激活 ,如 UV-和 R-輻射、細(xì)菌、生長因子缺乏、等。BH3-only 蛋白是一個只含一種BH 結(jié)構(gòu)即 BH3 結(jié)構(gòu)域的家族 ,包括 Bid ,BAD ,Bim 等。BH3-only 蛋白可通過翻譯后修飾(如磷酸化) 而激活。2

8、、Bcl-2 家族對凋亡的促進(jìn)和調(diào)控家族對凋亡的促進(jìn)和調(diào)控Bax 需要 BH3-only 蛋白如Bim 和 Bid 的直接激活 。Bim 和 Bid 在胞漿中被 Bcl-2 或Bcl-xL 結(jié)合,當(dāng) Bim 和 Bid 被激活以后 ,它們會直接對Bax 和Bak 活化而在線粒體膜上形成滲透孔。而其他的BH3-only 蛋白如Bad 對Bax/Bak 的活化過程起調(diào)節(jié)作用 ,它們會競爭性抑制 Bcl-2 而使 Bim 和 Bid 釋出。Bad 等會使細(xì)胞對凋亡更加敏感?？傊?,BH3-only 蛋白通過拮抗Bcl-2 而激活Bax/Bak ;另一方面 ,BH3-only 蛋白對 Bax/Bak

9、蛋白的激活過程被其他BH32only 蛋白而加強。3、線粒體上、線粒體上 MOMP 形成及細(xì)胞色素形成及細(xì)胞色素 C 的釋放的釋放Bax 含的3個 BH1 、BH2 、BH3 會自動形成一個疏水袋 ,其他蛋白的 BH3 肽可以插入此區(qū)并與之形成寡聚體。Bax 在未激活時 ,它的 C 端也與 Bcl-2一起插在疏水袋 ,從而阻止了 Bax 的 C 端與膜或其他蛋白結(jié)合。激活的Bax 以 C 端為向?qū)Р逶诰€粒體外膜 ,然后線粒體上的Bax 在其他線粒體蛋白的幫助下聚集 ,在線粒體外膜形成多聚Bax 孔道即線粒體外膜通透(MOMP) ,使線粒體內(nèi)容物流出。現(xiàn)在公認(rèn)的有兩種模式來解釋MOMP 形成方式

10、:第一 ，通過Bcl-2家族的促凋亡成員Bax/Bak 造成線粒體外膜中斷(如上所述) ，而不影響線粒體內(nèi)膜或基質(zhì)的功能：第二 ，其他信號如 Ca 2 + 、反應(yīng)性氧，觸發(fā)線粒體內(nèi)膜上的小孔道開放，水分子進(jìn)入線粒體基質(zhì)使之腫脹，導(dǎo)致線粒體外膜破裂，這個反應(yīng)也叫線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(MPT) 。在線粒體凋亡通路中 ,這兩種模式解釋了不同背景下的膜開放方式。MPT 的形成以線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MMP) 為中心 ,MMP 是由電壓依賴性陰離子(VDAC ) 、腺苷酸移位酶(ANT) 及親環(huán)素 D 復(fù)合物在線粒體內(nèi)、外膜交接處構(gòu)成的一種孔道復(fù)合物。VDAC 位于線粒體外膜中 ,為非專一性孔蛋白 ,其運

11、輸作用由專一性的反向轉(zhuǎn)運體來調(diào)節(jié)。促凋亡的 Bcl-2 家族成員如 Bcl-2 可與 ANT 相互作用而阻斷其形成孔通道 ,同樣Bcl-2 也能阻礙Bax 與ANT 間的協(xié)同作用。在線粒體凋亡通路中兩種模式在不同背景中發(fā)揮著作用。親環(huán)素 D 對MPT 通路是必要的。因此，很明顯，似乎有兩方面使細(xì)胞死亡：一種是基于形態(tài)和沒有胱天蛋白酶(caspase) 抑制因子的壞死性細(xì)胞死亡 ，通過依賴于親環(huán)素 D的MPT 而引起壞死性細(xì)胞死亡 。 另一種是獨立于 MPT 的MOMP 誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路。故此可以認(rèn)為 ,不足以引起壞死性細(xì)胞死亡的MPT 卻可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4 、Cyto C 對胱天蛋白酶的

12、激活線粒體體膜形成MOMP 后 ,線粒體膜間蛋白如 Cyto C 和Smac 釋放出來。釋出的 Cyto C 和三磷酸腺苷(ATP) 作為復(fù)合因子與胞液中 Apaf-1 蛋白結(jié)合 ,通過 ATP 分解提供能量誘導(dǎo)Apaf-1 自身多聚化 ,形成至少由 8 個亞單位組成的 Apaf-1 多聚物;并暴露 Apaf-1 的 N 端 caspase 募集域(caspase recruitment domain ,CARD) 與 caspase-9 結(jié)構(gòu)域中 CARD 相互作用 ,并募集caspase-9 到多聚物上 ,形成 Cyto c-Apaf1-caspase9 高分子量的復(fù)合物 凋亡體。Casp

13、ase-9 被募集形成凋亡體后 ,它會通過改變構(gòu)象自我激活 , 并引起其下游凋亡效應(yīng)組 caspase 如caspase-3 ,-7的激活 ,而產(chǎn)生一系列酶聯(lián)激活反應(yīng) ,最后對核內(nèi)底物進(jìn)行剪切使受累細(xì)胞凋亡。凋亡抑制蛋白家族( IAPs) 和 Smac 在線粒體凋亡通路中的調(diào)節(jié)IAPs 是一組在許多物種細(xì)胞中存在并行使抑制凋亡功能的蛋白。IAPs 家族有8種成員：XIAP、Is-IAP、c-IAP1 、 c-IAP2 、Livin、NAIP、Survivin 及Bruce 。IAP 家族有一個共同單位:桿狀病毒 IAP 重復(fù)結(jié)構(gòu)域(BIR 結(jié)構(gòu)域) 。BIR 結(jié)構(gòu)域是 IAPs 成員對凋亡抑制

14、功能所必需的。其中BIR3 ,BIR2 及BIR2 與BIR1 之間的連接區(qū)(Linker) 對胱天蛋白酶的抑制起主要作用。IAPs 對“啟動”和“效應(yīng)”caspases 的抑制是通過不同的結(jié)合位點實現(xiàn)的。晶體衍射發(fā)現(xiàn) caspase-9 分子中小亞基的N 端存在 IAP 結(jié)合模體-4 個氨基酸序列（丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸-異亮氨酸）。Caspase-9 中 315 天冬氨酸的裂解而暴露此模體 ,并與 X連鎖凋亡抑制蛋白( XI-AP) 上的BH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合 ,阻止底物進(jìn)入 caspase-9 的活化位點 ,從而抑制 caspase-9 的活性。XIAP 對caspase-3 ,-7 的抑制

15、通過 BIR2 和 BIR1 之間的 Linker 實現(xiàn)的。三維結(jié)構(gòu)顯示 ,Linker 中第 144 ,147 和 148 位氨基酸殘基特異地與 Caspase-3 ,-7 底物結(jié)合溝通過氫鍵和范德華力結(jié)合 ,產(chǎn)生空間位阻作用 ,占據(jù)催化位點 ,與 caspase 酶的底物產(chǎn)生競爭性抑制作用。Smac (second mitochondrial-derived activator of caspase ）的作用是在凋亡啟動后 ,從線粒體膜釋放入胞液以促進(jìn)凋亡反應(yīng)速度和強度 ,使凋亡順利進(jìn)行。Smac 的 N 端有一個類似與 Caspase-9 的 IAP 結(jié)合模體 ,從而通過氫鍵及疏水鍵與 IAPs 的BIR3 和 BIR2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合,而抑制 IAP 的功能。Smac 通過不同的方式對“啟動”caspases 和“效應(yīng)”caspases 產(chǎn)生作用。首先 ,對“啟動”caspase 的激活是通過 Smac 上的 IAP 結(jié)合模體與 caspase-9 競爭結(jié)合到 XIAP-BIR3 結(jié)構(gòu)域的相同部位 ,形成 Smac-XIAP 復(fù)合體 ,使 caspase-9 釋出。其次 ,對“效應(yīng)”caspase 的激活是因為 Smac 與 XIAP-BIR2 有更高親和力 ,Smac 與 XIAP 結(jié)合改