BD FACSCalibur流式細胞儀培訓(xùn)手冊

1、BD FACSCalibur流式細胞儀FACS101 Handbook本課程介紹表面抗原流式分析有關(guān)之基礎(chǔ)工作原理。如期望進一步了解流式細胞技術(shù)應(yīng)用，請至本公司網(wǎng)站訂閱FACSinformation電子報.tw/bdb/index.html。如需要本課程手冊，歡迎至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫熒光染色方法，請至本公司網(wǎng)站下載 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基本結(jié)構(gòu)1.1儀器本體：1. 電源開關(guān)：在BD FACSCalibur儀器右側(cè)下方，先啟動儀器本體，再打開計算機。2. 光學(xué)系統(tǒng)：BD FACSCal

2、ibur 基本配有一支波長488 nm 的氬離子雷射以BD FACSCalibur 基本型為例Ø FSC Diode 只收488 nm波長散射光Ø SSC PMT 只收488 nm波長散射光Ø FL1 PMT 熒光光譜峰值落在綠色范圍（波長515-545 nm）Ø FL2 PMT 熒光光譜峰值落在橙紅色范圍（波長564-606 nm）Ø FL3 PMT 熒光光譜峰值落在深紅色范圍（波長 >650 nm）3. 儀器面板：儀器前方面板的右下方有三個流速把握鍵、及三個功能把握鍵。流速把握：LO： 樣品流速：12 ml /minMED：樣品流速：

3、35 ml /minHI: 樣品流速：60 ml /min功能把握：· RUN：此時上樣管加壓，使細胞懸液從進樣針進入流淌室。（正常顯示綠色；黃色時表示儀器不正常，請檢查是否失壓。）· STANDBY：無樣品或暖機時之正常位置，此時鞘液停止流淌，雷射功率自動降低。· PRIME：去除流淌室中的氣泡，流淌室施以反向壓力，將液流從流淌室沖入樣品管，持續(xù)肯定時間后，以鞘液回注滿流淌室。PRIME 結(jié)束，儀器恢復(fù)STANDBY狀態(tài)。4. 儲液箱抽屜：在主機左下方之儲液箱抽屜?？上蚯袄_，內(nèi)含鞘流液筒、廢液筒、鞘液過濾器Sheath Filter，及空氣濾網(wǎng) Air fil

4、ter。請留意氣路減壓閥VENT TOGGLE之位置。· 鞘液筒：位于抽屜左側(cè)，容積4升。裝八分滿鞘液筒，儀器可以運行大約 3小時。筒上裝有液面感應(yīng)器，鞘液用完時，儀器軟件上會有顯示。鞘液筒蓋上有金屬環(huán)扣，保證鞘液筒密閉。· 廢液筒：位于抽屜右側(cè)，容積4升。筒上裝有液面感應(yīng)器，廢液盛滿時，儀器軟件上會有顯示。留意廢液可能有潛在的生物傳染性。· 鞘液過濾器：0.22mm過濾器，去除鞘液中的雜質(zhì)，保證進入流淌室的鞘液是潔凈的。· 氣路減壓閥：沿箭頭方向移動閥門開關(guān)，鞘液筒減壓，氣壓恢復(fù)正常。在鞘液筒添加鞘液時，需要減壓。· 空氣過濾網(wǎng)：用于過濾冷卻

5、雷射的空氣。5. 上樣品區(qū)：上樣品區(qū)是樣本管的上樣位置。它包括三個部分，一個是進樣針 Sample Injection Tube，將樣本輸入流淌室，還有就是支撐架 Tube Support Arm、和液滴存留系統(tǒng) Droplet Containment System。· 進樣針：是一根不銹鋼管，將細胞從樣本針中吸入流淌室。進樣管外有一套管，是液滴保留系統(tǒng)的一部分。· 支撐架：用于支撐樣本管、并負責(zé)啟動液滴存留系統(tǒng)。支撐架有三個位置：位于樣本管之下的中位，樣本管左側(cè)或右側(cè)。液滴存留系統(tǒng)：系統(tǒng)由支撐架、真空幫浦和外套管組成。當支撐架位于左側(cè)或右側(cè)位置時，真空幫浦就會啟動，將液體

6、從外管吸入廢液筒內(nèi)。上樣時，須留意將支撐架位于中位，以避開過多樣品被抽吸到廢液筒內(nèi)（當支撐架位于中位，真空幫浦停止工作）。更換樣品時，讓儀器保持RUN的模式，使得進樣針可以反沖；切換到STANDBY模式前，確保液路已沖洗徹底以免碎片沈積到流淌室中。1.2 Macintosh計算機與打印機：預(yù)備您的細胞樣品1. 抱負樣品濃度調(diào)至1-10 X 105 cells/ml？一般試驗只需0.5 ml的樣品。2. 細胞樣品務(wù)必放至BD FALCON 352052 試管中，否則無法上機。3. 上機前務(wù)必去除樣品中之細胞團塊，以防止管路堵塞？可使用附濾網(wǎng)BD FALCON試管 (Cat. No.352235)

7、 或35-55 mm的尼龍篩網(wǎng)。4. 供流式分析的樣品是單細胞懸浮液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。表面抗原熒光染色的方法大致有兩種：直接免疫熒光、間接免疫熒光染色。爭辯生可至本公司網(wǎng)站下載染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html · 直接免疫熒光染色· Lysed - No - Wash Procedure· Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27· Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure· Leukemia and

8、 Lymphoma Procedure 1· Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay· 間接免疫熒光染色· 滴定抗體濃度· 常用試劑5. 如因特殊因素?zé)o法下載上述試驗方法，請e-mail：yenchichen.tw或 austin_bdtwn.tw。二、開機、關(guān)機標準操作2.1 FACS Calibur 開機1. 開啟細胞儀電源。2. 開啟其它周邊配備電源，如打印機及MO機。3. 開啟計算機。4. 確認鞘流液筒有八分滿的FACS Flow，的確旋緊 (鞘液筒容量為4L)。5. 將

9、廢液倒掉，并在廢液筒中加入200 ml 家用漂白水 (廢液筒容量為4L)。6. 將減壓閥方向調(diào)在加壓（Pressurize）位置。7. 排解液流管路與過濾器中的氣泡。8. 取下樣品管，執(zhí)行 PRIME 功能兩次。9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 兩分鐘。10. 可開頭分析樣品。2.2 FACS Calibur 關(guān)機關(guān)機前必要動作：清洗進樣管和外套管，防止進樣管堵塞、或有染料殘留。1. 將樣品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上樣品，讓儀器的真空系統(tǒng)抽取約 1 ml 的液體。2. 將樣品支持架回正，按 HI RUN，然后讓 FACSClean 清洗管路1

10、0分鐘。3. 按 Standby，取下樣品管，執(zhí)行 PRIME功能兩次。4. 取 2 ml dH2O，重復(fù)上述步驟1-3。5. 留意最終只留約 1 ml dH2O 在試管中。6. 按 STANDBY 五分鐘，使風(fēng)扇冷卻雷射后，關(guān)閉細胞儀（必要動作，以愛護雷射光源。）7. 倒掉廢液，并回填 200 ml漂白水。8. 將減壓閥放在VENT 漏氣位置。將鞘流液筒充填至八分滿。9. 退出軟件“File”à“Quit”(如有對話選項，選擇“Dont save”)。確認退出計算機中全部BD應(yīng)用軟件，全部數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)已儲存?zhèn)浞荨?0. 關(guān)閉計算機?！癝pecial”à“Shutdown”。三

11、、上機分析流程建議首次試機避開進行大量試驗，僅需預(yù)備下列樣品。（1）Negative Control（不加任何抗體）。（2）CD3-FITC（FL1 單染）。（3）CD19-PE（FL2 單染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 雙染）。3.1 Calibur 開機1. 先開啟細胞儀本體再打開計算機。 *秘技1：如挨次相反，儀器和計算機之間無法建立正常通訊，無法執(zhí)行“connect to cytometer”。 解決之道，兩者都關(guān)機、然后以正確方式重開。2. 向前拉開儲液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，將減壓閥方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向）。3. 儀器會

12、對鞘流液筒打氣加壓，請確認筒蓋的確旋緊。 *秘技2：將減壓閥方向調(diào)在加壓（向前）位置。減壓閥如在VENT（箭頭方向）位置，按RUN功能鍵時將顯示橙黃色（表示儀器不正常，請檢查是否失壓），正常為綠色顯示。3.2開啟CellQuest 軟件、編輯試驗文件4. 在蘋果菜單下點擊CELLQuest 啟動軟件。桌面會消滅一Untitled 試驗文件，可點擊試驗文件的右上角的放大鈕，將試驗文件窗口放大。5. 從工具板中點擊散點圖圖示。在試驗文件的空白區(qū)點擊，拖曳對角線至適當大小，然后放開鼠標。消滅散點圖對話方框。6. 在消滅的散點圖對話方框中點擊Plot Source，選擇Acquisition (收取)

13、 ，確認X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024。在顏色方框中點擊Multicolor Gating（收取樣品時，門內(nèi)細胞將消滅顏色）。點擊OK。此時試驗文件會消滅FSC/SSC散點圖。7. 說明：散點圖（Dotplot），又稱二維散點圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個獨立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標X軸為為熒光1強度的相對值，單位是道數(shù)，縱坐標Y軸則通常表示熒光2或光散射強度的相對值。儀器使用者可因應(yīng)試驗需求來修改全部圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024；其次圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H 1024、FL2-H 1

14、024。修改動作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細胞大小，SSC：細胞折射率，F(xiàn)L1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。8. 從屏幕上方Plots菜單中選擇Dot Plot功能，可復(fù)制一個同樣大小的散點圖，在消滅的對話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H 1024，Y軸：FL2-H 1024。點擊OK，F(xiàn)L1/FL2的散點圖消滅。完成后可將重制圖移至原圖右方。9. 在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點圖上拖動Quadrant的中心將它設(shè)定在（x，y）（101，101）處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。建立儀器和計算機之間通訊10. 從Acq

15、uire菜單中選擇Connect to Cytometer，此時會消滅Acquisition Control 對話方框。假如無法選擇Connect to Cytometer，參考秘技 #1。假如沒見到Acquisition Control 對話，可到屏幕上方Windows菜單中選擇Show Acquisition Control。儀器設(shè)置文件留意：試驗數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，爭辯人員必需在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrument settings），含信號器高壓（Detector/ Amps），閾值（Threshold）

16、，熒光補償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的挨次為Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。消滅 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口確認FSC與SSC為LIN（線性放大），其它FL1-3為LOG（對數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。12. 從Cytometer菜單中選擇Threshold，消滅 Threshold 窗口在Threshold 窗口：確認FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。13.

17、從Cytometer菜單中選擇Compensation，確認全部預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。3.3 上樣品、設(shè)置儀器14. 使儀器處于High RUN，支撐架左移，上陰性對比管樣品，支撐架回位。確認Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不儲存數(shù)據(jù))，點擊Acquire。 調(diào)整FSC/SSC探測器（電壓）15. 觀看FSC/SSC圖的變化。FSC電壓(Voltage)預(yù)設(shè)為E00，可調(diào)整 Amp Gain 從1.009.99 使主要細胞群得以清楚顯示（如細胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1；較小細胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)整SSC電壓

18、使主要細胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)整FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨立離散的細胞族群，該細胞群不與其它族群、細胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點擊Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈選細胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細胞群體。我們常用前方散射與側(cè)方散射的二維位圖，即散射光圖譜（Scatter Plot），來圈選出不同細胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細胞族群。16. 在工具板中選擇多邊形的Region，在FSC/SSC散點圖上劃定淋巴細胞R1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時，區(qū)域內(nèi)細胞應(yīng)會呈現(xiàn)成紅色，可移動或轉(zhuǎn)變外形來圈選

19、有意義的細胞。假如要刪除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點選Gates Region list ，以鼠標點選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。17. 選取期望Gate的FL1/FL2散點圖，從Plots菜單中選擇Format dot plot。在消滅的對話方框內(nèi)，將No Gate 改選 G1=R1。點擊OK。 調(diào)整FL1、FL2的探測器（電壓）18. 點擊Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中調(diào)整FL1、FL2的電壓，使Negative Control細胞群著落在所選直方圖或散點圖之10

20、0-101處。19. 在Threshold 窗口，適當?shù)靥岣逨SC閾值>52，以去除碎片或低階噪音。唯需留意不要切掉主要細胞族群。 20. 點擊Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去陰性對比管，關(guān)閉Detector/Amps、Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細胞群之自體熒光。調(diào)整熒光補償說明：最適化的最終一步是調(diào)整光譜重迭。（如是單色熒光試驗可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時需調(diào)整FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2（若3色樣本，必要時需調(diào)整FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補償）。21. High RU

21、N，換上單染CD3-FITC管。點擊Acquisition Control窗口中的Acquire。調(diào)整FL2-%FL1使FITC陽性細胞在FL1/FL2散點圖的右下象限。補償調(diào)整可通過點擊­¯來選擇或直接拖動滑標上下移動。調(diào)整完畢，點擊Acquisition Control窗口中的Pause。22. 移去單染CD3，換上單染CD19-PE管。點擊Acquisition Control窗口中的Restart。調(diào)整FL1-%FL2使PE+細胞在FL1/FL2散點圖的左上象限。調(diào)整完畢，點擊Acquisition Control窗口中的Pause。23. 最終以CD3-FITC/

22、CD19-PE雙染樣本上機，點擊Acquisition Control窗口中的Restart，確定三群細胞工整垂直。當您已完成2色熒光之光譜重迭時，點擊Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。24. 移去樣本管，換上dH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。3.4收集試驗數(shù)據(jù)打算儲存細胞總數(shù)25. 預(yù)設(shè)之儲存細胞總數(shù)為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition & Storage，并在消滅的窗口功，確認Collection Criteria從10000 of All

23、，再點擊OK。 26. 找個檔案匣預(yù)備儲存數(shù)據(jù)。從Acquire 菜單中選擇Parameter Description，消滅Parameter Description對話方框。點擊Folder，并在隨后消滅之對話方框，選擇Your Folder或新建活頁夾，點擊此對話方框的Select Your Folder。27. 命名即將儲存之文件名：點擊Parameter Description對話方框的File，消滅文件名編輯窗口。在Custom Prefix中：輸入文件名20031231，點擊此對話方框的OK。日期為最常用之文件名系統(tǒng)。28. Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格

24、中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。輸入?yún)?shù)名會存入試驗檔案中，顯示在圖譜上。計數(shù)器Counters29. 從Acquire 菜單中選擇Counters. 窗口會顯示樣品分析速率、與總數(shù)進度。收集試驗數(shù)據(jù)30. 你可以開頭收集試驗數(shù)據(jù)了。HIGH RUN，將第一管樣品放到檢測區(qū)，在Acquisition Control窗口中，將 ý Setup 改成 ¨ Setup，此時CellQuest會自動顯示 Your Folder：20031231.001為資料文件名。點擊“Acquire” 便可啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存

25、。當計算機成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會自動儲存數(shù)據(jù)文件20031231.001，并會以“嘟”聲告知，CellQuest會自動升冪附加檔名成20031231.002。等待下一指示。31. 你可以換上下一管樣品，點擊“Acquire” 啟動樣品之分析測定與數(shù)據(jù)儲存?？蛇B續(xù)分析直到全部檢品都分析完畢。3.5試驗數(shù)據(jù)之儲存與備份：32. 不建議長期使用硬盤儲存數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可考慮以燒光盤（如配有 CD-RW）、口袋硬盤（Flash Drive）來備份大量試驗數(shù)據(jù)，以免占用原有硬盤的內(nèi)存，影響數(shù)據(jù)處理速度?？蓪浞莺笾當?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計算機或個人PC進行離機分析。33. 確認全部檔案皆己備份后，以鼠標圈選欲刪除

26、數(shù)據(jù)，將其拖拉至Trash筒。退出軟件34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲存試驗文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。35. 從屏幕上方 Cytometer 指令欄，選擇Instrument Setting，消滅Instrument Setting窗口。點系print打印此次試驗條件，可貼入試驗筆記留底，再點擊Save以儲存此一試驗的儀器條件，供日后再使用。點系SAVE后會消滅文件保存對話方框，選擇文件名目及文件名（例：Your Folder：/Your Setting1），點擊Save。點擊Done。36. 檢品分析完畢后，用鼠標從屏幕上方 Acq

27、uire 指令欄中，選取Disconnect to Cytometer 以斷絕計算機與儀器間之聯(lián)機。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File”à“Quit”(遇有選項永久選擇“Dont save”)，進行關(guān)機程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代樣品，將樣品架置于左位以外管吸除約1 ml，再將樣品架置于中位 HI RUN 格外鐘。改用 2 ml DI water。重復(fù)上述程序，樣品架上留約 1 ml DI water 。按STANDBY五分鐘。關(guān)主機、關(guān)計算機四、數(shù)據(jù)分析FCS list mode數(shù)據(jù)文件：說明：FCS list mode數(shù)據(jù)文件是流式細胞儀的標準格式檔

28、案（FCS2.0）。該文件含有從流式細胞儀收取的平均10,000個細胞數(shù)的資料，含有46個參數(shù)。一般軟件無法打開list mode數(shù)據(jù)文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析軟件，才可開啟、繪圖、并進行分析統(tǒng)計。4.1 開啟一CellQuest試驗文件1. 從屏幕上方File 菜單中選擇New。桌面會消滅一Untitled 試驗文件，可點擊試驗文件的右上角的放大鈕，將試驗文件窗口放大。4.2散點圖之統(tǒng)計分析（雙色）2. 從工具板中點擊散點圖圖示。在試驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖動對角線至適當大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot對話

29、框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis，可點擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 Sample Files，它們的路徑位于Mac HD：BD Applications：CellQuest Folder：Sample Files。連續(xù)雙擊鼠標來打開次名目，找到檔案后，點擊 Open來開啟 NORM001 檔案。X 與 Y 參數(shù)項會消滅默認值FSC-H 256 與 SSC-H 256，在Color方框中點擊Multicolor Gating，確認無誤之后，點擊 OK 便完成了一個 NORM001 的 FSC /SSC散點圖。4. 工

30、具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor 移至FSC/SSC散點圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細胞。(假如要刪除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點選Gates Region list，以鼠標點選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)5. 從Plots菜單中選擇Dot Plot可復(fù)制一個同樣大小的散點圖，屏幕上會消滅一 Dot Plot 對話方框。點擊X Parameter 鈕來顯示 NORM001 檔案中全部的參數(shù)項 (FSC, SSC, FL1, FL2) 將 X 參數(shù)

31、項改成FL1-H 256 Gamma-1，Y 參數(shù)項改成FL2-H 256 Gamma-2。從Gate輸入欄中將 NoGate 改成G1= R1。6. 點擊 OK 便完成了一個以 G1 圈選的 FL1/ FL2 散點圖，可將復(fù)制圖移至原圖右方。NORM001 檔案為本組試驗之陰性對比組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 Quadrant Marker 工具，然后在 FL1/ FL2 散點圖中心處點擊并拖曳至定點，一般而言是緊挨著陰性細胞聚落。8. FL1/ FL2 二維散點圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個象限，欲計算各象線中細胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從屏幕上方Stats菜單中選擇Qua

32、drant Stats?？梢缘玫皆搱D之四象限統(tǒng)計結(jié)果。UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限打印報告、輸出統(tǒng)計數(shù)值9. 從屏幕上方File菜單中選擇Print One，可以打印工作中試驗文件。10. 點選四象限統(tǒng)計表，從屏幕上方File菜單中選擇Export Statistics可輸出統(tǒng)計數(shù)值至Excel檔案。在消滅方框中命名檔案，并打算欲存放檔案匣，點擊Save。4.3 開啟其它List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標以拖曳方式選取全部圖表 (文件中全部圖譜的四角會消滅黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Nex

33、t Data File，軟件會自動以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，您只要確認圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位置是否恰當，即可打印報告、或輸出統(tǒng)計數(shù)值。12. 對于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標以拖曳方式選取全部圖表 (文件中全部圖譜的四角會消滅黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Change Data Files，并在隨后消滅之對話方框，選擇所在新名目與欲分析檔案。點擊OPEN。可調(diào)整圈選區(qū)域，Quadrant Marker陰陽界限，軟件會重新計算、統(tǒng)計報告。13. 常規(guī)使用之試驗文件 (內(nèi)含散點圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計報告) ，我們建議您將它另存新檔

34、File Save As，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。4.3直方圖之統(tǒng)計分析（單色）1. 從屏幕上方File 菜單中選擇New。桌面會消滅一Untitled 試驗文件，可點擊試驗文件的右上角的放大鈕，將試驗文件窗口放大。2. 從工具板中點擊散點圖圖示。在試驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖曳對角線至適當大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot對話框。3. 在Dot Plot方框中，Plot Source應(yīng)預(yù)設(shè)為Analysis，可點擊 Select File 鈕，并用隨后之方框來開啟預(yù)存之 Sample Files，它們的路徑位于Mac HD：BD Applications：Ce

35、llQuest Folder：Sample Files。連續(xù)雙擊鼠標來打開次名目，找到檔案后，點擊 Open來開啟 NORM001 檔案。X 與 Y 參數(shù)項會消滅默認值FSC-H 256 與 SSC-H 256，在Color方框中點擊Multicolor Gating，確認無誤之后，點擊 OK 便完成了一個 NORM001 的 FSC /SSC散點圖。4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將Cursor 移至FSC/SSC散點圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。你已完成 R1區(qū)域的界定，我們將以此區(qū)域來圈選淋巴細胞。(假如要刪除R1區(qū)域，您可以在工具欄中點選Gates Re

36、gion list，以鼠標點選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。)5. 從Plots菜單中選擇Histogram，屏幕上會消滅一 Histogram 對話方框。點擊 Select File 鈕，再點擊 Open來開啟 NORM001 檔案。說明：直方圖（Histogram）表明一個參數(shù)與細胞數(shù)量之間的關(guān)系，在圖中，橫坐標X軸為熒光或光散射強度的相對值，單位是道數(shù)（channel number），縱坐標Y軸則通常表示細胞消滅的頻率，即相對細胞數(shù)。6. 點擊 Parameter 鈕來顯示 NORM001 檔案中全部的參數(shù)項，將參數(shù)項改成FL2-H

37、 256 Gamma-2。從Gate輸入欄中將 No Gate 改成G1= R1，點擊 OK 便完成了一個以G1圈選的 FL2直方圖，圖形的 X 軸為橙黃色熒光強度，Y 軸為細胞頻率，NORM001 檔案為本組試驗之陰性對比組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。7. 從屏幕左列工具板中，選取 Histogram Marker 工具，然后在圖的左緣處點擊并拖曳至定點，一般而言是陰性信號的右緣。放開鼠標后即完成Marker 1(M1)。重復(fù)前述步驟以增畫另一Marker，一般而言 M2 始自 M1 的右緣，最終圖的右界。8. FL2 直方圖現(xiàn)在被區(qū)隔出兩個區(qū)域，欲計算各區(qū)域中細胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，可從

38、Stats 指令欄中選擇 Histogram Stats。打印報告、輸出統(tǒng)計數(shù)值9. 從屏幕上方File菜單中選擇Print One，可以打印工作中試驗文件。10. 點選四象限統(tǒng)計表，從屏幕上方File菜單中選擇Export Statistics可輸出統(tǒng)計數(shù)值至Excel檔案。在消滅方框中命名檔案，并打算欲存放檔案匣，點擊Save。4.3 開啟其它List Mode Data11. 如欲接著分析存在同一檔案匣之系列檔案，可用鼠標以拖曳方式選取全部圖表 (文件中全部圖譜的四角會消滅黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Next Data File，軟件會自動以新檔案來替換現(xiàn)有檔案，

39、您只要確認圈選范圍、與 Quadrant Marker 的位置是否恰當，即可打印報告、或輸出統(tǒng)計數(shù)值。12. 對于存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標以拖曳方式選取全部圖表 (文件中全部圖譜的四角會消滅黑色方塊，表示被選擇上) ，接著從Plots菜單選擇Change Data Files，并在隨后消滅之對話方框，選擇所在新名目與欲分析檔案。點擊OPEN?？烧{(diào)整圈選區(qū)域，Markers界限，軟件會重新計算、統(tǒng)計報告。13. 常規(guī)使用之試驗文件 (內(nèi)含散點圖、圈選區(qū)格、四象限分界、以及統(tǒng)計報告) ，我們建議您將它另存新檔 File Save As，以備后需，分析其它檔案便輕而易舉。五、錯誤信號、疑難

40、排解5.1 儀器狀態(tài)（Status）： 在CELLQuest菜單位于Cytometer菜單中。用來在收取的任何時候查看流式細胞儀的運行狀態(tài)，以利解決儀器運行中消滅的問題。狀態(tài)：顯示儀器運行模式Not Ready：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Ready：樣本管放置在進樣區(qū)，且支撐臂位于中位，樣本管加壓，儀器在RUN狀態(tài)。Standby：儀器在Standby 狀態(tài)、或儀器在Run 狀態(tài)而無樣本管在進樣區(qū)上、或支撐架位于側(cè)位、或樣本管未完全加壓。Standby時儀器的雷射電源降低。5.2 常見故障排解程序5.2.1 樣品試管上不去Ø 誤用不適合的試管。（請用BD Falcon 35

41、2052）Ø 試管支持架需調(diào)整。旋轉(zhuǎn)調(diào)整試管支持架（順時鐘向下、逆時鐘向上）。Ø Bal Seal 磨損。（汰換 Bal seal）5.2.2 儀器處于N0T READY狀況檢查以下狀況：Ø 鞘液筒中的鞘液是否用完。Ø 廢液筒中的廢液是否已裝滿。Ø 開機需要5分鐘時間預(yù)熱。Ø 鞘液筒的液面檢測器連接是否松動、或未連接。5.2.3 儀器處于STANDBY狀況（儀器失壓）假如儀器未加壓，上樣管放好后，雖然把握面板處于RUN模式，但儀器仍未能達到READY狀況，此時儀器仍處于STANDBY狀況。這可能是由于鞘液筒蓋漏氣、壓力閥未加壓，樣本管

42、不能被加壓等緣由造成的壓力問題。此時，樣本不能良好地進入流淌室，無法檢測。此時，檢查以下狀況：Ø 壓力閥未加壓。Ø 鞘液筒是否漏氣（蓋緊鞘液筒蓋）。Ø 樣本管是否有破損。Ø 上樣針上的Bal seal是否己磨損。Ø 鞘液筒上的藍色接頭是否連接好。5.2.4 儀器訊號噪聲過高鞘液過濾器中有氣泡，儀器記錄了氣泡產(chǎn)生的信號，造成了噪聲數(shù)據(jù)的干擾。氣泡還可以轉(zhuǎn)變樣本流，造成檢測結(jié)果不抱負；此時，儀器需要做PRIME，排解液路中的氣泡干擾。假如鞘液筒吸干了，應(yīng)當重新裝滿鞘液，然后先取下樣品管進行5-10次PRIME，再換上3ml dH2O上樣管HI RU

43、N 30分鐘，待鞘液流中的氣泡排解之后，再進行樣本測定。5.2.5 計算機屏幕上見不到細胞顯示檢查以下狀況：Ø 假如儀器始終處于STANDBY狀態(tài)，則檢查System Status。Ø 假如STATUS窗日顯示READY，則檢查樣本管中細胞濃度是否夠，上樣前是否混勻了。Ø 檢查試驗的Instrument Settings是否正確。Ø 檢查閾值是否設(shè)置過高，導(dǎo)致無法檢測目標細胞群。Ø 檢查CELLQuest軟件Cytometer名目下的Status窗口，是否己被更新。假如未更新，說明儀器與計算機之間的通訊發(fā)生了故障，此時，應(yīng)關(guān)閉計算機和FACSC

44、alibur，重新打開儀器，連續(xù)試驗。Ø PRIME儀器液流，去除流淌室中可能存在的氣泡。若流淌室中存在氣泡，可能使樣本流的位置偏離激光束，導(dǎo)致無細胞信號。5.2.6 加樣針有鞘液反流檢查以下狀況：Ø 檢查上樣針外管是否安好，可以將外管旋下，向上推動，重新擰緊。Ø 更換上樣針上部的O型膠環(huán)。Ø 檢查液流保存系統(tǒng)的真空幫浦是否工作。假如樣本管支撐架位于旁位時，聽不到真空幫浦的工作聲音，可能是真空幫浦停了，關(guān)閉FACSCalibur，再啟動；移開支撐架時，假如馬達仍舊不動，請致電BD客戶服務(wù)部門尋求掛念。試驗文件1：2 Color ACQ試驗文件2：2 Color ANA表一、常用熒光染劑測量參數(shù)熒光染劑吸光波長(nm)熒光波長(nm)標示抗體用染劑Fluorescein, FITC490520Phycoeryth