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文檔簡介
1、(一)試驗前應(yīng)明確的問題 1. 選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般狀況下,96孔培育板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,因此,在進行MTT試驗前,要進行預(yù)試驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培育時間,以保證培育終止致細胞過滿。這樣,才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低,太少觀看不到差異。 2. 藥物濃度的設(shè)定??隙ㄒ嗫次墨I,參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。依據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的
2、有效濃度和時間。 3. 時間點的設(shè)定。在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,最終得到不同時間點的抑制率變化狀況,畫出變化的曲線,曲線什么時候變得平坦了(到了平臺期)那個時間點應(yīng)當就是最好的時間點(由于這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯)。 4. 培育時間。200ul的培育液對于10的45次方的增殖期細胞來說,很難維持68h,假如養(yǎng)分不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,影響結(jié)果,我們是在48h換液的。 5. MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力,不能測定細胞確定數(shù)。做MTT時,盡量無菌操作,由于細菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的上升。&
3、#160;6. 理論未必都是對的。要依據(jù)自己的實際狀況調(diào)整。 7. 試驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔,對比孔,加藥孔。調(diào)零孔加培育基、MTT、二甲基亞砜。對比孔和加藥孔都要加細胞、培育液、MTT、二甲基亞砜,不同的是對比孔加溶解藥物的介質(zhì),而加藥組加入不同濃度的藥物。 8. 避開血清干擾。用含15胎牛血清培育液培育細胞時,高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸取值。由于試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小于10胎牛血清的培育液進行。在呈色后,盡量吸凈培育孔內(nèi)殘余培育液。 (二)試驗步驟 貼壁細胞: 1. 收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪
4、板使待測細胞調(diào)密度至1000-10000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。 2. 5%CO2,37孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個,否則難以反應(yīng)真實狀況.3. 5%CO2,37孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀看。 4. 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),連續(xù)培育4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng),可先離心后棄去培育液,當心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培育液。
5、0;5. 終止培育,當心吸去孔內(nèi)培育液。 6. 每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 7. 同時設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜),對比孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜) 懸浮細胞: 1)收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度1×106/ml,按次序?qū)⒀a足的1640(無血清)培育基40ul ;加Actinomycin D(有毒性)10ul用培育液稀釋 l?g/ml,需預(yù)試查找最佳稀釋度,1:10-1
6、:20);需檢測物10ul;細胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設(shè)對比(加100?(儲存液100 1640)。 2)置37,5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀看。 3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),連續(xù)培育4 h。(懸浮細胞推舉使用WST-1,培育4 h后可跳過步驟4),直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值) 4)離心(1000轉(zhuǎn)x10min),當心吸掉上
7、清,每孔加入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。 5)同時設(shè)置調(diào)零孔(培育基、MTT、二甲基亞砜),對比孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜),每組設(shè)定3復(fù)孔。 (三)MTT的配制 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配,過濾后4避光保存兩周內(nèi)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,避開反復(fù)凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,用的時候現(xiàn)配,直接往培育板中加,沒必要一
8、下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就確定不能再用了。 MTT有致癌性,用的時候當心,有條件最好帶那種透亮的簿膜手套.配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系,到底時間較短,或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。 配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配,60水浴助溶。 PBS配方:Nacl 8g,Kcl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,調(diào)ph 7.4,定容1L。 (四)關(guān)于細胞的接種(鋪板) 細胞過了30代以后就不要
9、用了,由于狀態(tài)不好了;培育板要用好的(最好進口板),不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)試驗。 接種時最好依據(jù)預(yù)試驗摸索出的密度接種, 由于細胞密度在10000/ml左右時,所測得的OD值的區(qū)間即細胞抑制率(或者增值率)的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好,結(jié)果最可信。假如鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯,太密細胞可能都會凋亡,由于細胞長的太快養(yǎng)分會不夠,最終導(dǎo)致死亡。且而細胞過密或者過少,增殖都會過快或者過慢,其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細胞密度多接受10000/ml,100ul/孔。 細胞密度要依據(jù)不同細胞的特點來定.假如你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度,假如你做
10、的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度,這樣與對比的區(qū)分更明顯,數(shù)據(jù)更好。懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到105,貼壁細胞可為103-104.(五)加入MTT 個人認為MTT最關(guān)鍵的是你的細胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例,具體細胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系的確不好確定,我認為MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家報道不同,一般是過量的,所以10ul即夠了。假如不使用96孔板,培育基超過100ul,MTT依據(jù)10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培育基混勻,不過這個應(yīng)當關(guān)系不大。 如加入MTT后都有個別孔馬上變?yōu)樗{黑色,則污染
11、的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀看,看看是否有孔染菌,染菌的孔經(jīng)常是接近的。由于血清中白蛋白對大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng),所以可以單獨將藥物和MTT加在一起,看會不會起反應(yīng)。假如不起反應(yīng),就不用去除含藥物的培液,直接加MTT即可。首先說說我的一點閱歷: 1. 吹打時懸液總量不能太多,達到吸管吸液量的3到4倍,可能比較簡潔混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液:懸液太少簡潔吹起很多氣泡,懸液太多又不簡潔吹成單細胞懸液。 2. 吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量過多的話,一下吸起很多液體,管中所剩就很少,
12、這樣吹打簡潔起泡,吸液量過少,吹打的力度就不夠,吹打就會不均勻。假如是吸液量1ml多的吸管,總液量在5ml左右為益 3. 吸的時候要在懸液底部,然后提起來一點,但是吹下去的時候不要離開液面,否則簡潔吹打出氣泡。 4. 吹打次數(shù)100左右,就可以吹打均勻了(有人認為加細胞前吹打3050次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復(fù)吹打3次,每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘,然后再以肯定的速度吸取懸液。) 5. 向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快,否則你會發(fā)覺細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中心,而周邊很少,這種不均勻的分散會產(chǎn)生
13、接觸抑制,影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在來回回復(fù)3下移動,目的是使得細胞能分散的均勻些。(鋪板技術(shù)是MTT試驗的關(guān)鍵,也是基礎(chǔ),肯定要練好。曾經(jīng)有同學用漩渦振蕩器混勻細胞,最終細胞全死了,建議不要接受這種方法混勻細胞。 其它的聲音: 1. 首先細胞的接種密度肯定不能過大,一般每孔1000個左右就夠了,我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了,這樣即使藥物有作用,MTT方法也是表現(xiàn)不出的,最佳點板濃度在4000-5000/孔,太少的話SD值會很大。 2. MTT本身就是比較粗的試驗,增殖率10%左右的波動都不算驚異。特殊是新手,20的波動也是常見的,所以很可能是技術(shù)緣由引起的,特殊是種板技術(shù)肯定要過關(guān)。 3. 我做的是腫瘤細胞的MTT試驗,這種細胞長的很快一開頭我是用100000/ML的濃度來接種的,結(jié)果細胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度,用過4000080000/ML的濃度都做過MTT試驗,結(jié)果發(fā)覺做的結(jié)果比較好點的是6000070000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細胞少,藥物作用的梯度還是有,
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