免疫增強(qiáng)劑提高禽流感疫苗效力的研究.docx

1、唐應(yīng)華，陸吉虎,吳培培，等.免疫增強(qiáng)劑提高禽流感疫苗效力的研究J.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,30(2):3440348.doi:10.3969/j.issn.1000S4440.2014.02.019免疫增強(qiáng)劑提高禽流感疫苗效力的研究唐應(yīng)華，陸吉虎，吳培培，劉振興，田震，查國(guó)飛，陳輝，侯繼波(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014)摘要：為評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)劑(VA5)對(duì)雞的免疫效力，將不同劑量免疫增強(qiáng)劑與H9禽流感抗原混合后制備疫苗，評(píng)價(jià)對(duì)SPF雞的免疫效力。根據(jù)篩選結(jié)果，將最適劑量的免疫增強(qiáng)劑與H9禽流感抗原以共同混合的形式配制

2、疫苗，并將免疫增強(qiáng)劑以伴侶形式與H5或H9禽流感疫苗混勻免疫商品雞，評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)效果。結(jié)果表明，免疫增強(qiáng)劑與H9疫苗共同混勻，或?qū)⒚庖咴鰪?qiáng)劑制備成疫苗伴侶形式與H5或H9商品疫苗共同混合免疫商品雞，均能使H5或H9疫苗免疫后抗體提前1周達(dá)到71g2,免疫后23周抗體效價(jià)顯著高于不含免疫增強(qiáng)劑的常規(guī)疫苗組。該免疫增強(qiáng)劑能提高H5和H9亞型禽流感疫苗對(duì)雞的免疫效力，具有較好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：免疫增強(qiáng)劑；115亞型禽流感疫苗；H9亞型禽流感疫苗；疫苗伴侶中圖分類號(hào)：S852.65+9.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1000鄴4440(2014)02鄲0344甄)5Evaluationofimmunop

3、otentiatorsforimprovingtheefficacyofavianinjfluenzavaccineTANGYinghua,LUJi*hu,WUPeifeei,LIUZhenjxing,TIANZhen,ZHAGuo*fei,CHENHui,HOUJi鄲bo(NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicalsKeyLaboratoryofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologi?cals,MinistryofAgriculture,Jia

4、ngsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China)Abstract:Toevaluatetheefficacyofacompoundimmunopotentiators(VA5)inchicken,theH9avianinfluenzavaccinescontainingdifferentdosesofimmunopotentiatorswerepreparedinwhichtheimmunopotentiatorweremixedwithvi|ralantigenduringthevaccinedevelopmentprocess.T

5、heoptimaldoseofimmunopotentiatorswasdeterminedbyevaluationoftheefficacyofimmunopotentiatorscontaininginfluenzavaccineinspecificpathogenfree(SPF)chicken.Theefficacyoftwoforms,eitherusedasadditioninvaccineantigenoraschaperonwithcommercialvaccine,ofoptimaldoseofimmunopoStentiatorswerethenevaluatedincom

6、mercialchicken.Inadditionform,immunopotentiatorwasmixedwith119avianinfluxenzaviralantigentopreparevaccine.Inchaperonform,itwaspreparedaswaterinoilemulsionandmixedwithH9or115subtypoavianinfluenzavaccine.ResultsofSPFchickentest收稿日期:2013S06®03基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201904);科技部國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863冶課題(2011AA1

7、0A213);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303046);江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項(xiàng)目CX(12)3077作者簡(jiǎn)介：唐應(yīng)華(1981S),男，湖南東安人，博士，副研究員，主要從事禽病毒性疾病致病機(jī)理和防控研究，(Elmail)tyinghuayahoo,com通訊作者：侯繼波，(Tel)865025584392008;(E&nail)houjibojaas.showedthattheeffectivenessoftheminimumdoseofimmuno%potentiatorswassuperiortothatofotherdoses.Theantibodytiter

8、sreachedto71g2oneweekinadvancethanthatofchickensvaccinatedwithimmunopotentiatorcontaijningH5or119subtypevaccinewhencomparedtothatchickensvaccinatedwiththeconventionalinactivatedH5orH9subtypeinfluenzavaccine,andregardlessoftheim5munipotentiatorusedasadditionformorchaperonform.Furthermore,or3，weekpost

9、vaccination,theantibodytitersingroupofchickensvaccinatedwithimmunopotentijatorcontainingvaccineweresignificantlyhigherthanthatofconventionalvaccinegroup.Theimmunopotentiatorcanimprovetheefficacyon115and119avianinfluenzavaccineinchicken,andshowsprospectinclinicalapplication.Keywords:immunopotentiator

10、s;H5subtypeavianinfluenzavaccine;H9subtypeavianinfluenzavaccine;chaperoneH5亞型和H9亞型禽流感嚴(yán)重威脅中國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。禽流感滅活疫苗對(duì)中國(guó)禽流感的防控發(fā)揮了重要作用。由于流感病毒自身易于變異使得現(xiàn)有的疫苗難以對(duì)新出現(xiàn)的變異株提供有效保護(hù)2要不斷篩選和更新與流行毒株抗原性一致的疫苗毒株,而篩選新疫苗毒株至新毒株疫苗用于臨床，存在一段窗口期。臨床生產(chǎn)亟需通過更換毒株之外的其他方法提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)效力.使用免疫增強(qiáng)劑是提高現(xiàn)有疫苗保護(hù)效力的有效途徑之一。人用疫苗中，已經(jīng)有部分免疫增強(qiáng)劑獲得商品化,包括人流感疫苗佐劑MF5

11、9、瘧疾疫苗佐劑AS02、單純包疹疫苗和人乳頭瘤病毒疫苗佐劑AS04。獸用疫苗中，如豬支原體疫苗佐劑Am鄴phigen等。各種天然免疫受體及其激動(dòng)劑在機(jī)體的免疫應(yīng)寸齒早中發(fā)重要作用6。這些激動(dòng)劑自身亦是良好的免疫增強(qiáng)劑，如CpG.Polyl:C、脂多糖（lip福lysaccharide,IPS）、咪唆莫特、雷西莫特、脂肽（li郭popeptides）、鞭毛蛋白和胞岷酰二肢等7駕9,一些化學(xué)藥物和中草藥多融成分也具有良好的免疫增強(qiáng)作用，如左旋咪哇、黃芷多鞘、香菇多糖、菊粉等101本實(shí)驗(yàn)室從多種具有免疫增強(qiáng)效果的成分中，篩選獲得一些有良好免疫增強(qiáng)作用的復(fù)方免疫增強(qiáng)劑。本研究將其中一種免疫增強(qiáng)劑（V

12、A5）對(duì)禽流感疫苗的免疫增強(qiáng)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。1材料和方法1病毒、疫苗和檢測(cè)抗原H9亞型禽流感病毒AlChickenINanjing/02/2001（簡(jiǎn)稱NJ02）和A/ChickenIShandong/01/2011（簡(jiǎn)稱SD01）均由本室鑒定、保存。對(duì)2株病毒的序列進(jìn)行測(cè)定，與GenBank中公布的中國(guó)近期H9病毒流行株，用MEGA4.1進(jìn)行比對(duì)，繪制遺傳進(jìn)化樹。H5（Re鄴5）亞型禽流感商品疫苗和Re鄴5檢測(cè)抗原均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。1. 2含免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制含VA5免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制詳見專利（申請(qǐng)?zhí)?01210235427.0）。簡(jiǎn)要描述其2種不同形式配制過程如下：淤與抗

13、原共同混合形式（簡(jiǎn)稱“共混幻。在磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入Polyl:C胞壁酰二肽和左旋咪哇，然后加入吐溫卵80,配制成水相溶液;在水相溶液中加入滅活疫苗抗原,混勻后得到滅活抗原溶液；在白油中加入雷西莫特、咪喳莫特，然后加入司盤升80配制成油相溶液；將滅活抗原溶液與油相溶液混合制備疫苗。于疫苗伴侶形式（簡(jiǎn)稱“伴侶冶）。在磷酸鹽緩沖液（PBS）中加入Polyl:C、胞壁酰二肽和左旋咪哇，然后加入吐溫-80,配制成水相溶液；在白油中加入雷西莫特、咪哇莫特，然后加入司盤鄲80配制成油相溶液；將含免疫增強(qiáng)劑的水相溶液與油相混合，制備成油乳劑的疫苗伴侶。將該疫苗伴侶與事先制備的常規(guī)滅活疫苗或商品滅活疫

14、苗按體積比為1頤9混合，即為含VA5免疫增強(qiáng)劑的伴侶疫苗。含VA5免疫增強(qiáng)劑的H9疫苗，以共混形式配制。參照疫苗規(guī)程，疫苗毒為NJ02株，每羽份疫苗含抗原量為10&°雞胚半數(shù)感染量（Medianembryoinfectiousdose,EID5o）,VA5高、中、低劑量參考專利（申請(qǐng)?zhí)?201210235427.0）,疫苗簡(jiǎn)稱為H9JVA55H、H9KVA5KM和H9®VA5®Lo不含免疫增強(qiáng)劑的常規(guī)H9疫苗，簡(jiǎn)稱H9o含VA5免疫增強(qiáng)劑的H5疫苗，以伴侶形式配制。即將H5商品疫苗根據(jù)含VA5高中低3種劑量,簡(jiǎn)稱為H5鄲VA5M5H、H5KVA5SM和H5

15、鄴VA5恥不含免疫增強(qiáng)劑的H5商品疫苗,簡(jiǎn)稱為H5o3SPF雞SPF雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)在負(fù)壓隔離器內(nèi)，直至使用。1日齡商品海蘭褐雞購(gòu)自海安某種雞場(chǎng)，在普通環(huán)境飼養(yǎng)至使用。1. 4不同劑量免疫增強(qiáng)劑在SPF雞的免疫效果測(cè)定選擇高、中、低不同劑量的VA5免疫增強(qiáng)劑H9共混疫苗免疫10日齡SPF雞，每只雞013ml,每組10只雞，共3組，即H9卵VA5甄I組、H90VA5W組和II9SVA50L組.另設(shè)常規(guī)H9疫苗組和空白對(duì)照組，每組10只雞。免疫后第1周第2周第3周采血，留作抗體檢測(cè):第3周采血結(jié)束后，用011ml含1世10"EID50H9亞型病毒SD01毒經(jīng)滴鼻

16、途徑攻毒。攻毒后第1、3、5和7d采取喉氣管和泄殖腔棉拭，用于病毒分離。將每只雞每次采得的喉氣管和泄殖腔棉拭合并后接種雞胚。每分混合拭子接種3個(gè)雞胚，每胚0!ImL去除24h內(nèi)死亡的雞胚，觀察各組雞胚的死亡情況，在120h后將所有健活雞胚置4益凍死，檢測(cè)各胚的HA效價(jià)。以3個(gè)胚中的1個(gè)或以上出現(xiàn)HA效價(jià)高于41g2記為陽性。1.5商品海蘭褐雞免疫含VA5免疫增強(qiáng)劑的H9疫苗商品海蘭褐雞免疫前采血檢測(cè)血凝抑制抗體(Hemagglutinininhibition,HI)母源抗體,以HI母源抗體效價(jià)低于21g2時(shí)免疫。將VA5免疫增強(qiáng)劑(VA5KL劑量)以伴侶形式與H9疫苗混合后，免疫14日齡商品雞

17、，另設(shè)常規(guī)疫苗對(duì)照和不免疫的空白對(duì)照,每只雞013ml,每組20只雞，免疫后第2周、第3周和第4周采血，留作抗體檢測(cè)。參照SPF雞的免疫，將VA5SL劑量與H9抗原共混合后，制備疫苗。免疫14日齡商品雞，另設(shè)常規(guī)疫苗對(duì)照和不免疫的空白對(duì)照，每只雞0S3ml,每組20只雞。免疫后第2周、第3周和第4周采血,留作抗體檢測(cè)。1.6商品海蘭褐雞免疫含VA5®L伴侶的H5疫苗商品海蘭褐雞免疫前采血檢測(cè)血凝抑制抗體(Hemagglutinininhibition,HI)母源抗體，以HI母源抗體效價(jià)低于21g2時(shí)免疫。以低劑量的VA5免疫增強(qiáng)劑以伴侶形式與H5疫苗混合后，免疫14日齡商品雞，另設(shè)常

18、規(guī)疫苗對(duì)照和不免疫的空白對(duì)照，每只雞013ml,每組20只雞。免疫后第2周、第3周和第4周采血，留作抗體檢測(cè)。1. 7抗體檢測(cè)采用微量血凝抑制法(HI)檢測(cè)抗體。2結(jié)果1病毒遺傳進(jìn)化比較對(duì)疫苗毒株NJ02和攻毒毒株SD01的HA基因測(cè)序后，將二者的開放閱讀框(Openreadingframe,ORF)序列與GenBank下載的序列用MEGA4.0進(jìn)行比對(duì)(NeighborWjoining,1000bootstrapreplicates)。NJ02與中國(guó)早期(19942001年)分離株在同一進(jìn)化分支，而SD01與近期(20072011年)分離株在同一分支(圖1)。上述結(jié)果提示，疫苗用毒株與攻毒毒

19、株在基因水平上具有一定差異，適于作為攻毒毒株。翌.金幽峰瀕i毆切嗽廖麒蕓陽II電|一Ar瀚血"瀾辨O舞O1爐對(duì)夠方1圖1H9病毒遺傳進(jìn)化分析比較Fig.1PhylogeneticanalysisofH9virusesBo2含VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗對(duì)SPF雞的免疫效力SPF雞免疫后第1周、第2周和第3周采血，分離血清，檢測(cè)HI抗體效價(jià)。含免疫增強(qiáng)劑的3個(gè)組在免疫后第2周，抗體效價(jià)即高于71g2,而常規(guī)疫苗在免疫后第3周抗體效價(jià)超過71g2o含免疫增強(qiáng)劑的疫苗組在免疫后第3周和第4周的血清效價(jià)與常規(guī)疫苗免疫組相比，均差異極顯著（P<0鄙01）（圖2）o在免疫后攻毒，檢測(cè)喉氣

20、管和泄殖腔的棉拭樣品。含免疫增強(qiáng)劑的疫苗組在免疫后均未檢測(cè)到病毒。而常規(guī)疫苗組在免疫后第5d尚有1/10病毒分離陽性，空白對(duì)照組在第7d尚能分離到病毒（4/口免痘后1島色蟀2嘉竟蟀3嘉免痍后瞞H9SVA5BH:含高劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗組;H9gVA5SM：含中等劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗組;H9BVA5SL:含低劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗組；119:常規(guī)H9疫苗組；對(duì)照組：未免疫的空白對(duì)照組。虛線表示達(dá)到合格時(shí)的抗體效價(jià)（71g2）o圖2含VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗對(duì)SPF雞的免疫效力Fig.2Efficacyof119antigenmixingwithVA5

21、immunpotentiajtorvaccineinSPFchicken表1SPF雞免疫后H9病毒攻毒及排毒檢測(cè)結(jié)果Table1H9subtypeviruschallengeandviralisolationofSPFchickenspostvaccination疫苗攻毒后病毒分離率（陽性數(shù)/總數(shù)）1d3d5d7dH9鄱VA5聊0/100/100/100/10H9JEVA5SM0/100/100/100/10H9SVA5SL0/100/100/100/10H93/101/101/100/10對(duì)照8/108/105/104/10H9SVA50H:含高劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗;II9gV

22、A5SM:含中等劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗;H9gVA5®L:含低劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗;H9:常規(guī)H9疫苗；對(duì)照：未免疫的空白。2. 3含免疫增強(qiáng)劑的H9疫苗對(duì)商品雞的免疫效力VA5免疫增強(qiáng)劑與H9抗原混合（H9WA5im）后制備疫苗，免疫商品雞，或VA5免疫增強(qiáng)劑以疫苗伴侶形式（H9SSVA5鄲c）與疫苗混合后免疫商品雞,均在免疫后第2周抗體超過71g2o常規(guī)疫苗需在免疫后第3周才超過71g2o含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫組的第3周和第4周抗體效價(jià)與常規(guī)疫苗相比，均差異極顯著（P<0鄙01）（圖3）?？诎寇蠁?凌；栽疚后3周：鮑痍后痍H9SVA5gL（in）:含

23、低劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9混合疫苗組；H9SJVA5鄲L（c）:含低劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H9伴侶疫苗組；H9:常規(guī)H9疫苗組;對(duì)照組：未免疫的空白對(duì)照組。虛線表示達(dá)到合格時(shí)的抗體效價(jià)（71g2）。圖3含VA5免疫增強(qiáng)劑H9疫苗對(duì)商品雞雞免疫效力Fig.3Efficacyof119vaccinecontainingVA5immunopotentiaStorincommercialchicken1. 4含VA5免疫增強(qiáng)劑的H5疫苗對(duì)商品雞的免疫效力VA5免疫增強(qiáng)劑以疫苗伴侶形式（H9鄴VA5鄴c）與H5疫苗混合后免疫商品雞，在免疫后第2周抗體超過71g20常規(guī)疫苗在免疫后第3周才超過71g2o

24、含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫組的第3周和第4周抗體效價(jià)與常規(guī)疫苗相比，均差異極顯著（P<0®01）（圖4）。3討論含VA5免疫增強(qiáng)劑的H9疫苗,無論是與抗原混合后制成疫苗使用，或單獨(dú)將該增強(qiáng)劑制成疫苗伴侶形式與疫苗共免疫，其免疫效果均優(yōu)于常規(guī)疫苗,表現(xiàn)在抗體合格提前1周達(dá)標(biāo)（71g2）,后續(xù)第3、4周抗體效價(jià)均顯著高于常規(guī)疫苗（P<0|01）。將VA5免疫增強(qiáng)劑以伴侶形式與H5疫苗共免疫，其免疫效力類似于在H9疫苗中的應(yīng)用效果。該免疫增強(qiáng)劑含有天然免疫受體中TollKlikere®口免痕后2周；兔疫總3嘉竟疫后演H5SVA59L:含低劑量VA5免疫增強(qiáng)劑的H5伴侶疫苗組

25、;H5:常規(guī)H5疫苗組；對(duì)照組：未免疫的空白對(duì)照組。虛線表示達(dá)到合格時(shí)的抗體效價(jià)(71g2)0圖4含VA5免疫增強(qiáng)劑H5伴侶疫苗對(duì)商品雞的免疫效力Fig.4Efficacyof115vaccinecontainingVA5immunpotentiaStorchaperoneincommercialchickenceptor(TLR)激動(dòng)劑的成分。根據(jù)對(duì)TLR的研究結(jié)果，不同TLR在不同免疫類型的細(xì)胞上的豐度以及在細(xì)胞表面的位置均有差異"且不同信號(hào)通路最終所激活的免疫刺激因子略有差異11,但均能有效提高機(jī)體的細(xì)胞免疫12。因此木研究中我們選擇多種受體激動(dòng)劑的混合，以獲得不同單組分協(xié)同效

26、應(yīng)的笈合免疫增強(qiáng)劑。我們正在開展的后續(xù)研究包括:VA5免疫增強(qiáng)劑的安全性、保存期、免疫效力持續(xù)期和對(duì)不同聯(lián)苗的使用等，以及該免疫增強(qiáng)劑在提高滅活疫苗免疫效力的免疫機(jī)理等。參考文獻(xiàn)：ActinobacilluspleuropncumoniaeJ.CanJVetRes,2004,68(1) :66?70.6 AKIRAS,TAKEDAK,KAISHOT.Tolljlikereceptors:criticalproteinslinkinginnateandacquiredinnnuniiyJ.NatImniunol,2001,2(8):675蛤80.7 KAWAIT,AKIRAS.Theroleso

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