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文檔簡介
1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上2015-2016第二學(xué)期生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)(植物基因克?。?shí)驗(yàn)總結(jié)班級(jí):13級(jí)生物科學(xué)2班 學(xué)號(hào): 姓名:鄧偉強(qiáng) 日期:2016年6月10日一、 實(shí)驗(yàn)原理及方法:實(shí)驗(yàn)原理:基因的克隆就是利用體外重組技術(shù),將特定的基因和其它DNA順序插入到載體分子中。基因克隆的主要目標(biāo)是識(shí)別、分離特異基因并獲得基因的完整的全序列,確定染色體定位,闡明基因的生化功能,明確其對(duì)特定性狀的遺傳控制關(guān)系。通過幾十年的努力由于植物發(fā)育,生理生化,分子遺傳等學(xué)科的迅速發(fā)展,使人們掌握了大量有關(guān)植物優(yōu)良性狀基因的生物學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí),再運(yùn)用先進(jìn)的酶學(xué)和生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆
2、,育性、高蛋白質(zhì)及與植物發(fā)育有關(guān)的許多基因。實(shí)驗(yàn)方法及過程:1. CTAB法提取水稻基因組DNA配制CTAB溶液:(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液:(24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸,最后定容至200ml.)2. 配置瓊脂糖緩沖液:10×TBE Buffer配制方法:每組需要:稱量下列試劑,置于1 L燒杯中Tris:108 gNa2EDTA·2H2O:7.44 g硼酸:55 g向燒杯中加入約800 ml的無菌水,
3、充分?jǐn)嚢枞芙狻<訜o菌水將溶液定容至1 L后,室溫保存。用時(shí)稀釋。3. 開發(fā)設(shè)計(jì)引物L(fēng)OC_Os02g42310 OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa Japonica GCATATGTCAACATCTCATCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Indica GCATATGTCAACATCTCATC
4、TCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Japonica GCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAATTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOryza sativa Indica GCGCCGGAGACGAAGA-ATTGAAGGGTTGGAAAGTAAC
5、TAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOLIGO LEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTCRIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTT Length: 201 japonica, 193 Indica 4. PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液:每管:2 ul 共需:24uldNTP混合物:每管:0.8 ul 共需:9.6
6、ul模板DNA :每管3 ul,共需36ulTaq DNA聚合酶:每管0.3 ul,共需3.6ul引物 1、2 :每管:2 ul(前引物1ul、后引物1ul)共需24ul。兩種引物各6管。引物1、2代表的體系分別加滅菌水71.4ul 至120 ul, 分裝6個(gè)ep管。5. PCR反應(yīng)程序95 預(yù)加熱5分鐘,95 30秒鐘56 30秒鐘 35循環(huán)72 30秒鐘 72 10分鐘16 5分鐘總時(shí)長:1小時(shí)35分鐘6.瓊脂糖凝膠電泳制膠:稱取1.6g瓊脂糖于配好的160mlCTAB溶液(稀釋10倍后的)中,在微波爐中加熱溶解,冷卻后,加入3ul的核酸染色劑(BE)。倒膠:插入梳子,搖勻之后倒膠(1LT
7、BE緩沖液,淹沒瓊脂),避光靜置大概20min。點(diǎn)膠:垂直拔掉梳子,把凝好的膠取出來放在有與制膠同濃度TBE緩沖液的電泳槽中。在第一個(gè)膠孔中加入maker,作對(duì)比。上樣:取2ulLoadingBffuer(一種沉淀劑,使點(diǎn)膠后樣品沉到膠孔底部不浮上來)混勻10ul的DNA樣品。用移液槍打入膠孔。電泳:電壓電流(100V、100mA)跑40min。7紫外燈下觀察條帶條帶清晰一段說明含DNA多。8. 切膠回收(1)切膠,然后加入膠的三倍體積的Buffer GA(若小于300bp ,按1:5) 本組切下的三份膠均為0.15g,分別加入了450ul的Buffer GA(2)55度水浴10分鐘,期間搖晃
8、23次(3)加入200ul Buffer BL于離心柱,12000rpm離心30秒,棄上清(4)將第2步得到的溶液中加到離心柱中,靜置2分鐘,12000rpm離心30秒,棄上清(5)往離心柱加入500ul的rash Buffer ,靜置2分鐘,12000rpm離心30秒,棄上清。(6)重復(fù)(5)(7)12000rpm 離心1分鐘(空管離心去乙醇)(8)將離心柱轉(zhuǎn)移到一干凈的1.5毫升離心管中,保持離心管開放狀態(tài)510分鐘(揮發(fā)乙醇)(9)加2060ul的Elution(洗脫液),65度預(yù)熱,靜置2分鐘(10)12000rpm離心2分鐘,保存在-20度冰箱9. LB培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)大腸桿菌):
9、酵母提取物 5 g/L 胰蛋白胨 10 g/LNaCl 10 g/L瓊脂 15g(固體)Amp:100ug/ml10. T-載體連接: (1)將回收PCR產(chǎn)物與T-載體連接 PMD 18-T Vector 0.5ul Solution I 2.5ulPCR 回收產(chǎn)物 2ul總 5ul(2)離心至底部(3)PCR 儀中16度反應(yīng)90分鐘。(或者4度過夜連接)11. 大腸桿菌感受態(tài)的熱激轉(zhuǎn)化:取出感受態(tài)細(xì)胞于冰上化凍后,加入T載體連接產(chǎn)物,輕輕搖勻后在冰上放置30 min。移至42水浴中熱激90 sec,再迅速放回冰上冷卻5 min。加入600 l不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基于37振蕩培養(yǎng)1 h。活
10、化后的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的篩選平板上,37培養(yǎng)過夜。提取單克隆:在篩選平板上選取單個(gè)稍大的白色菌落。在超凈工作臺(tái)上,吸取500ul液體加Amp 的LB 培養(yǎng)基于EP管中,用最小的槍頭挑取平板上的選取一個(gè)白色菌落,伸入LB 液體中抽吸混勻,搖菌培養(yǎng)5h。 12. 檢測(cè):利用PCR引物進(jìn)行菌液PCR檢查,再次進(jìn)行電泳,紫外燈觀察條帶(觀察結(jié)果見實(shí)驗(yàn)結(jié)果),陽性克隆送測(cè)序公司測(cè)序。二、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析: 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)成功,如圖: 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:本組實(shí)驗(yàn)的DNA使用的是上一組提取保存?zhèn)溆玫?。最后得到的?shí)驗(yàn)結(jié)果如圖,在紫外燈下觀察到了清晰的條帶說明實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果,實(shí)驗(yàn)成功。實(shí)驗(yàn)最后由于上一大
11、組的已經(jīng)測(cè)過序了,所以我們大組并沒有拿去生物公司測(cè)序。三、討論:由于本次實(shí)驗(yàn)是分為兩組,按照加引物1為一組,引物2為一組,每組反應(yīng)體系為6ep管。實(shí)驗(yàn)過程由全部人員一起操作完成,在配置試劑,配反應(yīng)體系等時(shí),小組成員進(jìn)行了分工合作,由于每步上并不能保證絕對(duì)無誤,所以在實(shí)驗(yàn)過程中有很多需要注意的地方,并進(jìn)行如下討論:1、本大組直接從第三步進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),沒有進(jìn)行第一步提取DNA,本組直接使用的上一組保存?zhèn)溆肈NA的。 2、第四步中,加反應(yīng)體系時(shí),由于兩個(gè)人進(jìn)行操作,一人負(fù)責(zé)引物1、一人負(fù)責(zé)引物2,在使用移液槍時(shí)由于使用不規(guī)范(比如量度沒有調(diào)節(jié)準(zhǔn)確,槍頭沒有固定好等),可能會(huì)導(dǎo)致誤差,以致在紫外燈下觀察
12、時(shí)得到的不是清晰的條帶,擴(kuò)增得到的DNA不多,就會(huì)影響后續(xù)過程比如T-載體的連接。因?yàn)榉磻?yīng)體系中所加的量很少,以微升來計(jì), 所以操作時(shí)要特別注意。3、第六步中,在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí),插入梳子是在靠近負(fù)極(黑頭),上樣時(shí)要注意,在將樣品加入到膠孔中時(shí),可以先在一次性手套上混勻,用移液槍將樣品打入時(shí),要看清膠孔,不能讓樣品溢出,也不能插得太深而把膠孔弄破。4、第七步中,將跑完電泳的瓊脂糖凝膠在紫外光燈下觀察,觀察到只有前六個(gè)孔跑出的條帶清晰,后六孔條帶沒有明顯清晰的一條,所以切膠時(shí)只切了前六孔跑出的一條條帶,因?yàn)榍逦鷹l帶擴(kuò)增的DNA多。后六條孔沒有跑出一條清晰的條帶這可能跟反應(yīng)體系時(shí)加料不準(zhǔn)確以
13、及點(diǎn)樣時(shí)操作不當(dāng)有關(guān)??傊?,實(shí)驗(yàn)過程是環(huán)環(huán)相扣的,上一步的操作失誤會(huì)影響下一步的操作,所以我們應(yīng)該要求自己每一步都要細(xì)致認(rèn)真。5、第九步中,配培養(yǎng)基需要配固液兩種,試劑和材料見第九步,液體培養(yǎng)基不加瓊脂。6、第十一步中,有的操作比如熱擊90秒,需要精確計(jì)時(shí),這就要求小組成員之間一人操作,一人計(jì)時(shí)。而有些操作需要在超凈工作臺(tái)上完成(消毒工作要做好),在操作前要先將超凈工作臺(tái)開紫外燈滅菌(至少10分鐘),紫外燈有輻射,不能靠太近。活化后的菌液于超凈工作臺(tái)涂布時(shí)要靠近酒精燈操作,如果操作不當(dāng)染菌了,會(huì)對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)造成影響。得不到白色大腸桿菌菌落,就不能提取單克隆。4、 個(gè)人實(shí)驗(yàn)體會(huì):(與別人類似的實(shí)驗(yàn)比較,你的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn))實(shí)驗(yàn)操作一定要細(xì)心謹(jǐn)慎,比如在進(jìn)行電泳的時(shí)候,稍不留神可能會(huì)溢出或插的太深。因前期實(shí)
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