植物基因克隆實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上2015-2016第二學(xué)期生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)（植物基因克?。?shí)驗(yàn)總結(jié)班級(jí)：13級(jí)生物科學(xué)2班 學(xué)號(hào)： 姓名：鄧偉強(qiáng) 日期：2016年6月10日一、 實(shí)驗(yàn)原理及方法：實(shí)驗(yàn)原理：基因的克隆就是利用體外重組技術(shù)，將特定的基因和其它DNA順序插入到載體分子中。基因克隆的主要目標(biāo)是識(shí)別、分離特異基因并獲得基因的完整的全序列，確定染色體定位，闡明基因的生化功能，明確其對(duì)特定性狀的遺傳控制關(guān)系。通過幾十年的努力由于植物發(fā)育，生理生化，分子遺傳等學(xué)科的迅速發(fā)展，使人們掌握了大量有關(guān)植物優(yōu)良性狀基因的生物學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí)，再運(yùn)用先進(jìn)的酶學(xué)和生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆

2、，育性、高蛋白質(zhì)及與植物發(fā)育有關(guān)的許多基因。實(shí)驗(yàn)方法及過程：1. CTAB法提取水稻基因組DNA配制CTAB溶液：(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）2. 配置瓊脂糖緩沖液：10×TBE Buffer配制方法：每組需要：稱量下列試劑，置于1 L燒杯中Tris：108 gNa2EDTA·2H2O：7.44 g硼酸：55 g向燒杯中加入約800 ml的無菌水，

3、充分?jǐn)嚢枞芙狻＜訜o菌水將溶液定容至1 L后，室溫保存。用時(shí)稀釋。3. 開發(fā)設(shè)計(jì)引物L(fēng)OC_Os02g42310 OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa Japonica GCATATGTCAACATCTCATCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Indica GCATATGTCAACATCTCATC

4、TCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Japonica GCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAATTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOryza sativa Indica GCGCCGGAGACGAAGA-ATTGAAGGGTTGGAAAGTAAC

5、TAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOLIGO LEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTCRIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTT Length： 201 japonica, 193 Indica 4. PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液：每管：2 ul 共需：24uldNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6

6、ul模板DNA ：每管3 ul，共需36ulTaq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul引物 1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。兩種引物各6管。引物1、2代表的體系分別加滅菌水71.4ul 至120 ul， 分裝6個(gè)ep管。5. PCR反應(yīng)程序95 預(yù)加熱5分鐘，95 30秒鐘56 30秒鐘 35循環(huán)72 30秒鐘 72 10分鐘16 5分鐘總時(shí)長：1小時(shí)35分鐘6.瓊脂糖凝膠電泳制膠：稱取1.6g瓊脂糖于配好的160mlCTAB溶液（稀釋10倍后的）中，在微波爐中加熱溶解，冷卻后，加入3ul的核酸染色劑（BE）。倒膠：插入梳子，搖勻之后倒膠（1LT

7、BE緩沖液，淹沒瓊脂），避光靜置大概20min。點(diǎn)膠：垂直拔掉梳子，把凝好的膠取出來放在有與制膠同濃度TBE緩沖液的電泳槽中。在第一個(gè)膠孔中加入maker，作對(duì)比。上樣：取2ulLoadingBffuer（一種沉淀劑，使點(diǎn)膠后樣品沉到膠孔底部不浮上來）混勻10ul的DNA樣品。用移液槍打入膠孔。電泳：電壓電流(100V、100mA)跑40min。7紫外燈下觀察條帶條帶清晰一段說明含DNA多。8. 切膠回收（1）切膠，然后加入膠的三倍體積的Buffer GA（若小于300bp ，按1：5） 本組切下的三份膠均為0.15g，分別加入了450ul的Buffer GA（2）55度水浴10分鐘，期間搖晃

8、23次（3）加入200ul Buffer BL于離心柱，12000rpm離心30秒，棄上清（4）將第2步得到的溶液中加到離心柱中，靜置2分鐘，12000rpm離心30秒，棄上清（5）往離心柱加入500ul的rash Buffer ，靜置2分鐘，12000rpm離心30秒，棄上清。（6）重復(fù)（5）（7）12000rpm 離心1分鐘（空管離心去乙醇）（8）將離心柱轉(zhuǎn)移到一干凈的1.5毫升離心管中，保持離心管開放狀態(tài)510分鐘（揮發(fā)乙醇）（9）加2060ul的Elution(洗脫液)，65度預(yù)熱，靜置2分鐘(10)12000rpm離心2分鐘，保存在-20度冰箱9. LB培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)大腸桿菌）：

9、酵母提取物 5 g/L 胰蛋白胨 10 g/LNaCl 10 g/L瓊脂 15g（固體）Amp：100ug/ml10. T-載體連接： （1）將回收PCR產(chǎn)物與T-載體連接 PMD 18-T Vector 0.5ul Solution I 2.5ulPCR 回收產(chǎn)物 2ul總 5ul（2）離心至底部（3）PCR 儀中16度反應(yīng)90分鐘。（或者4度過夜連接）11. 大腸桿菌感受態(tài)的熱激轉(zhuǎn)化：取出感受態(tài)細(xì)胞于冰上化凍后，加入T載體連接產(chǎn)物，輕輕搖勻后在冰上放置30 min。移至42水浴中熱激90 sec，再迅速放回冰上冷卻5 min。加入600 l不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基于37振蕩培養(yǎng)1 h。活

10、化后的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的篩選平板上，37培養(yǎng)過夜。提取單克隆：在篩選平板上選取單個(gè)稍大的白色菌落。在超凈工作臺(tái)上，吸取500ul液體加Amp 的LB 培養(yǎng)基于EP管中，用最小的槍頭挑取平板上的選取一個(gè)白色菌落，伸入LB 液體中抽吸混勻，搖菌培養(yǎng)5h。 12. 檢測(cè)：利用PCR引物進(jìn)行菌液PCR檢查，再次進(jìn)行電泳，紫外燈觀察條帶（觀察結(jié)果見實(shí)驗(yàn)結(jié)果），陽性克隆送測(cè)序公司測(cè)序。二、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)成功，如圖： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：本組實(shí)驗(yàn)的DNA使用的是上一組提取保存?zhèn)溆玫?。最后得到的?shí)驗(yàn)結(jié)果如圖，在紫外燈下觀察到了清晰的條帶說明實(shí)驗(yàn)達(dá)到了預(yù)期的效果，實(shí)驗(yàn)成功。實(shí)驗(yàn)最后由于上一大

11、組的已經(jīng)測(cè)過序了，所以我們大組并沒有拿去生物公司測(cè)序。三、討論：由于本次實(shí)驗(yàn)是分為兩組，按照加引物1為一組，引物2為一組，每組反應(yīng)體系為6ep管。實(shí)驗(yàn)過程由全部人員一起操作完成，在配置試劑，配反應(yīng)體系等時(shí)，小組成員進(jìn)行了分工合作，由于每步上并不能保證絕對(duì)無誤，所以在實(shí)驗(yàn)過程中有很多需要注意的地方，并進(jìn)行如下討論：1、本大組直接從第三步進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，沒有進(jìn)行第一步提取DNA，本組直接使用的上一組保存?zhèn)溆肈NA的。 2、第四步中，加反應(yīng)體系時(shí)，由于兩個(gè)人進(jìn)行操作，一人負(fù)責(zé)引物1、一人負(fù)責(zé)引物2，在使用移液槍時(shí)由于使用不規(guī)范（比如量度沒有調(diào)節(jié)準(zhǔn)確，槍頭沒有固定好等），可能會(huì)導(dǎo)致誤差，以致在紫外燈下觀察

12、時(shí)得到的不是清晰的條帶，擴(kuò)增得到的DNA不多，就會(huì)影響后續(xù)過程比如T-載體的連接。因?yàn)榉磻?yīng)體系中所加的量很少，以微升來計(jì)， 所以操作時(shí)要特別注意。3、第六步中，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，插入梳子是在靠近負(fù)極（黑頭），上樣時(shí)要注意，在將樣品加入到膠孔中時(shí)，可以先在一次性手套上混勻，用移液槍將樣品打入時(shí)，要看清膠孔，不能讓樣品溢出，也不能插得太深而把膠孔弄破。4、第七步中，將跑完電泳的瓊脂糖凝膠在紫外光燈下觀察，觀察到只有前六個(gè)孔跑出的條帶清晰，后六孔條帶沒有明顯清晰的一條，所以切膠時(shí)只切了前六孔跑出的一條條帶，因?yàn)榍逦鷹l帶擴(kuò)增的DNA多。后六條孔沒有跑出一條清晰的條帶這可能跟反應(yīng)體系時(shí)加料不準(zhǔn)確以

13、及點(diǎn)樣時(shí)操作不當(dāng)有關(guān)?？傊?，實(shí)驗(yàn)過程是環(huán)環(huán)相扣的，上一步的操作失誤會(huì)影響下一步的操作，所以我們應(yīng)該要求自己每一步都要細(xì)致認(rèn)真。5、第九步中，配培養(yǎng)基需要配固液兩種，試劑和材料見第九步，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。6、第十一步中，有的操作比如熱擊90秒，需要精確計(jì)時(shí)，這就要求小組成員之間一人操作，一人計(jì)時(shí)。而有些操作需要在超凈工作臺(tái)上完成（消毒工作要做好），在操作前要先將超凈工作臺(tái)開紫外燈滅菌（至少10分鐘），紫外燈有輻射，不能靠太近。活化后的菌液于超凈工作臺(tái)涂布時(shí)要靠近酒精燈操作，如果操作不當(dāng)染菌了，會(huì)對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)造成影響。得不到白色大腸桿菌菌落，就不能提取單克隆。4、 個(gè)人實(shí)驗(yàn)體會(huì)：(與別人類似的實(shí)驗(yàn)比較，你的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn))實(shí)驗(yàn)操作一定要細(xì)心謹(jǐn)慎，比如在進(jìn)行電泳的時(shí)候，稍不留神可能會(huì)溢出或插的太深。因前期實(shí)