XXXX年湖北省結核病防治研究所實驗室診斷(魯進)

1、 2013年年8月月 魯進上傳，以供學習魯進上傳，以供學習2v結核分枝桿菌是結核病的致病因子與確診依據(jù)，結核分枝桿菌是結核病的致病因子與確診依據(jù)，結核病實驗室診斷就是用直接或間接的方法來證結核病實驗室診斷就是用直接或間接的方法來證明患者體內存在結核分枝桿菌。在臨床患者樣本明患者體內存在結核分枝桿菌。在臨床患者樣本中尋找結核分枝桿菌也就是實驗室檢測的主要內中尋找結核分枝桿菌也就是實驗室檢測的主要內容。理想的診斷技術應該具有快速、特異、敏感、容。理想的診斷技術應該具有快速、特異、敏感、準確簡便和價格低廉的特點，這也是結核界近百準確簡便和價格低廉的特點，這也是結核界近百年來技術研究的方向。年來技術研

2、究的方向。3v 目前結核病實驗室檢查主要有：目前結核病實驗室檢查主要有：v 結核病的細菌學診斷（涂片染色顯微鏡檢查、分枝桿菌分離培養(yǎng)、結核病的細菌學診斷（涂片染色顯微鏡檢查、分枝桿菌分離培養(yǎng)、分枝桿菌藥物敏感性試驗、分枝桿菌菌種鑒定）分枝桿菌藥物敏感性試驗、分枝桿菌菌種鑒定）v 結核病的免疫學診斷（皮膚結核菌素試驗、結核抗體測定、結核結核病的免疫學診斷（皮膚結核菌素試驗、結核抗體測定、結核抗原測定、細胞因子檢測）抗原測定、細胞因子檢測）v 結核病分子生物學檢測（結核病分子生物學檢測（DNA探針技術、探針技術、PCR測序、測序、PCR定性定性檢測結核分枝桿菌、雙重實時熒光檢測結核分枝桿菌、雙重實

3、時熒光PCR技術和技術和TaqMan探針技探針技術及等溫擴增技術），目前分子生物學檢測技術發(fā)展非?？?。術及等溫擴增技術），目前分子生物學檢測技術發(fā)展非?？?。v 結核病病理學診斷。結核病病理學診斷。4v根據(jù)國家和我省的根據(jù)國家和我省的“十二五十二五”結核病防治規(guī)劃，要結核病防治規(guī)劃，要求求100的地（市）級結核病實驗室具備藥物敏感的地（市）級結核病實驗室具備藥物敏感性試驗能力、性試驗能力、100的區(qū)（縣）級實驗室具備分枝的區(qū)（縣）級實驗室具備分枝桿菌培養(yǎng)能力，同時根據(jù)我省桿菌培養(yǎng)能力，同時根據(jù)我省“三位一體三位一體”工作開工作開展的實際情況展的實際情況 ，目前我省各級開展結核病診斷的實，目前我省

4、各級開展結核病診斷的實驗室在涂片、培養(yǎng)、藥敏實驗方面能力還顯不足。驗室在涂片、培養(yǎng)、藥敏實驗方面能力還顯不足。因此主要從細菌學診斷給大家做些介紹，同時簡介因此主要從細菌學診斷給大家做些介紹，同時簡介目前我國正在評估和推廣應用的新診斷技術。目前我國正在評估和推廣應用的新診斷技術。6 每一張玻片都要編號每一張玻片都要編號 涂抹痰標本涂抹痰標本 自然干燥自然干燥 加熱固定加熱固定7使用鉛筆在磨砂面上編號使用鉛筆在磨砂面上編號8使用竹木簽進行涂抹使用竹木簽進行涂抹91011加熱固定涂片加熱固定涂片12太厚太厚 適宜適宜 太薄太薄13好好脫落脫落好好不均勻不均勻14 適宜適宜太厚太厚太薄太薄15v挑取了

5、痰標本的膿性部分挑取了痰標本的膿性部分v做螺旋狀軌跡涂抹均勻做螺旋狀軌跡涂抹均勻v 大小約為大小約為 2cm X 1cm v 不要太厚不要太厚v 透過染色前的痰膜可以隱約看到報紙上的透過染色前的痰膜可以隱約看到報紙上的字字16v 初染初染 (堿性復紅堿性復紅)v 脫色脫色 (鹽酸酒精鹽酸酒精)v 復染復染 (亞甲蘭亞甲蘭) 17堿性復紅脫色復染18v將涂片排放在染色架上將涂片排放在染色架上v滴加堿性復紅染色液，加熱出現(xiàn)蒸汽后，保持滴加堿性復紅染色液，加熱出現(xiàn)蒸汽后，保持5分鐘分鐘v流水輕緩沖洗流水輕緩沖洗v滴加脫色液，保持滴加脫色液，保持1分鐘分鐘 v流水輕緩沖洗流水輕緩沖洗v滴加亞甲蘭復染液

6、，保持滴加亞甲蘭復染液，保持1分鐘分鐘v流水輕緩沖洗流水輕緩沖洗19將涂片排放在染色架上，注意間隔將涂片排放在染色架上，注意間隔20滴加堿性復紅滴加堿性復紅21加熱加熱22流水沖洗流水沖洗23脫色脫色-流水輕緩沖洗流水輕緩沖洗24復染復染25流水洗去復染液流水洗去復染液 26在玻片架上自然干燥在玻片架上自然干燥27 ZN染色步驟 涂涂痰痰膜膜自自然然干干燥燥復復紅紅加加熱熱初初染染5 5分分鐘鐘自自然然干干燥燥鏡鏡檢檢流流水水沖沖洗洗美美蘭蘭復復染染3030秒秒5%5%鹽鹽酸酸酒酒精精脫脫色色1-31-3分分鐘鐘流流水水沖沖洗洗流流水水沖沖洗洗28v0.1%金胺金胺“O”染液染色染液染色10分

7、鐘，水洗；分鐘，水洗；3%的鹽酸酒精脫色的鹽酸酒精脫色1-2分鐘，直至無黃色可見，水分鐘，直至無黃色可見，水洗；洗；0.5%高錳酸鉀溶液復染高錳酸鉀溶液復染1-2分鐘，水洗，分鐘，水洗，晾干。晾干。v檢測用檢測用10倍目鏡，倍目鏡，40倍物鏡，不加油。倍物鏡，不加油。30單一的抗酸菌單一的抗酸菌31“V”- 字形字形32成簇的抗酸菌33復染太濃造成的影響復染太濃造成的影響34適宜的復染適宜的復染3536v陰性陰性 未發(fā)現(xiàn)抗酸菌未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/ 300 視野視野v報告實際菌落數(shù)報告實際菌落數(shù) 1-8 條條 /300 視野視野v(1+) 3-9 條條 / 100 視野視野v(2+) 1-9 條條 /

8、 l 0 視野視野v(3+) 1-9 條條 / 每視野每視野v(4+) 達到或超過達到或超過 10 條條 /每視野每視野v報告報告1+至少觀察至少觀察300視野，視野，2+至少觀察至少觀察100視野，視野，3+以上至少以上至少50個視野個視野37v陰性陰性 未發(fā)現(xiàn)抗酸菌未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/ 50視野視野v報告實際菌落數(shù)報告實際菌落數(shù) 1-9條條 /50 視野視野v(1+) 10-49 條條 / 50 視野視野v(2+) 1-9 條條 / 每視野每視野v(3+) 10-99條條 / 每視野每視野v(4+) 達到或超過達到或超過 100條條 /每視野每視野v報告報告2+至少觀察至少觀察50視野，視野，3

9、+以上至少以上至少20個視野個視野3839v對照標記的患者姓名，在生物安全柜內將約對照標記的患者姓名，在生物安全柜內將約2ml痰標本痰標本置于相應的前處理管中；置于相應的前處理管中；v使用吸管，將與痰標本等體積使用吸管，將與痰標本等體積4% NaOH加入前處理加入前處理管中；管中；v旋緊處理管螺旋蓋，接通渦旋振蕩器電源，將處理管在旋緊處理管螺旋蓋，接通渦旋振蕩器電源，將處理管在渦旋振蕩器上渦旋震蕩渦旋振蕩器上渦旋震蕩30秒左右；秒左右；v如果以手持拿處理管，持拿方法是以拇指、無名指分別如果以手持拿處理管，持拿方法是以拇指、無名指分別持拿處理管外壁，食指、中指按處理管螺旋蓋。持拿處理管外壁，食指

10、、中指按處理管螺旋蓋。40v將前處理管置于試管架內，置于生物安全柜內，室將前處理管置于試管架內，置于生物安全柜內，室溫靜置溫靜置15分鐘；分鐘；v擰開羅氏培養(yǎng)管螺旋蓋，檢查培養(yǎng)基斜面底部的凝擰開羅氏培養(yǎng)管螺旋蓋，檢查培養(yǎng)基斜面底部的凝固水，如果凝固水過多，則沿著斜面相對的一面的固水，如果凝固水過多，則沿著斜面相對的一面的培養(yǎng)管內壁，將凝固水棄去。培養(yǎng)管內壁，將凝固水棄去。v以無菌吸管吸取前處理后的痰標本，吸取時吸取的以無菌吸管吸取前處理后的痰標本，吸取時吸取的程度要小于擠壓的程度，使吸管前端一段不含液體，程度要小于擠壓的程度，使吸管前端一段不含液體，避免液體意外滴落。避免液體意外滴落。41v保

11、持培養(yǎng)基斜面水平或底端略高，均勻接種至酸性羅氏保持培養(yǎng)基斜面水平或底端略高，均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基使用接種培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基使用接種2滴（約滴（約0.1 -0.15 ml），接種時第一滴液體接種至斜面中部，第），接種時第一滴液體接種至斜面中部，第二滴接種到培養(yǎng)基上部；二滴接種到培養(yǎng)基上部；v將用過的吸管置于廢液缸內；將用過的吸管置于廢液缸內；v旋上培養(yǎng)管螺旋蓋，不要太緊；旋上培養(yǎng)管螺旋蓋，不要太緊；v輕輕轉動并放低培養(yǎng)管底部，使接種的液體均勻的在斜輕輕轉動并放低培養(yǎng)管底部，使接種的液體均勻的在斜面上鋪開。面上鋪開。v培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱內，36

12、1孵育；孵育；42 操作操作 振蕩勻化振蕩勻化靜靜置置15分鐘分鐘43 37 37豎直培養(yǎng)豎直培養(yǎng)8 8周周均勻接種均勻接種0.1ml,2支支/標本標本斜面向上，斜面向上，3737水平放置水平放置24小時小時接種和孵育接種和孵育44渦旋振蕩渦旋振蕩1-21-2分鐘分鐘痰標本中加入痰標本中加入1-21-2倍體積倍體積4%NaOH4%NaOH分別接種分別接種0.1ml0.1ml前處理液至前處理液至2 2只培養(yǎng)基斜面只培養(yǎng)基斜面接種后接種后3 3天、天、7 7天天觀察，此后每周觀察，此后每周觀察一次觀察一次置置3737溫溫箱培養(yǎng)箱培養(yǎng)有菌落生長需經(jīng)有菌落生長需經(jīng)抗酸染色確認，抗酸染色確認，至第至第8

13、 8周無菌落周無菌落生長報告陰性生長報告陰性室溫靜置室溫靜置1515分鐘分鐘4 43 32 25 56 67 71 145v 接種后第接種后第3和和7日觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察一次，直日觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察一次，直至第八周末。每次觀察后要在培養(yǎng)結果記錄本上記錄觀察至第八周末。每次觀察后要在培養(yǎng)結果記錄本上記錄觀察結果。結果。v 無菌落生長無菌落生長 報告培養(yǎng)陰性報告培養(yǎng)陰性v 菌落生長不及斜面面積菌落生長不及斜面面積1/4時時 報告實際菌落數(shù)報告實際菌落數(shù)v 菌落占斜面面積菌落占斜面面積 1/4 報告報告(1+)v 菌落占斜面面積菌落占斜面面積1/2 報告報告(2+)v 菌落占斜面面積

14、菌落占斜面面積3/4 報告報告(3+)v 菌落布滿培養(yǎng)基斜面菌落布滿培養(yǎng)基斜面 報告報告(4+)46v 以藥物敏感性測試為目的（包括耐藥性診斷和耐藥監(jiān)測等），不以藥物敏感性測試為目的（包括耐藥性診斷和耐藥監(jiān)測等），不需要對培養(yǎng)物進行涂片檢查，只需將培養(yǎng)物送至進行藥物敏感性需要對培養(yǎng)物進行涂片檢查，只需將培養(yǎng)物送至進行藥物敏感性測試的實驗室，并附培養(yǎng)物生長情況的報告單。測試的實驗室，并附培養(yǎng)物生長情況的報告單。v 以培養(yǎng)作為診斷或評價療效為目的，需要對培養(yǎng)物進行涂片顯微以培養(yǎng)作為診斷或評價療效為目的，需要對培養(yǎng)物進行涂片顯微鏡檢查、鑒定，根據(jù)涂片和鑒定結果進行報告。鏡檢查、鑒定，根據(jù)涂片和鑒定結

15、果進行報告。v 培養(yǎng)物經(jīng)涂片顯微鏡檢查確定為抗酸菌后，結合菌落形態(tài)、生長培養(yǎng)物經(jīng)涂片顯微鏡檢查確定為抗酸菌后，結合菌落形態(tài)、生長時間，報告：羅氏培養(yǎng)抗酸菌陽性時間，報告：羅氏培養(yǎng)抗酸菌陽性v 經(jīng)菌種初步鑒定，證實為結核分枝桿菌復合群后，報告：羅氏培經(jīng)菌種初步鑒定，證實為結核分枝桿菌復合群后，報告：羅氏培養(yǎng)結核菌陽性養(yǎng)結核菌陽性 47v 1、幼稚菌落比較小，表面光滑、幼稚菌落比較小，表面光滑而有光澤呈黃色；成熟典型菌一而有光澤呈黃色；成熟典型菌一般為中等大小或較大，干燥粗糙，般為中等大小或較大，干燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黃色，易碎，呈奶酪色，白色或橘黃色，不透明凸起菌落。不透明凸起菌落。

16、v 2、不典型菌落為細小、園形、不典型菌落為細小、園形、濕潤、易乳化、呈黃紅色，一般濕潤、易乳化、呈黃紅色，一般7-10天內就成熟，常為非典型天內就成熟，常為非典型抗酸桿菌或非致病菌?？顾釛U菌或非致病菌。4849v 如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基污染，按污染面積報告如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基污染，按污染面積報告v 污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積1/4 報告報告(C1+)v 污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積1/2 報告報告(C2+)v 污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積污染菌有明顯界限，且不超過斜面面積3/4 報告報告(C3+)v 污染菌沒有明顯界限

17、或布滿培養(yǎng)基斜面污染菌沒有明顯界限或布滿培養(yǎng)基斜面 報告報告(C4+) 50v 留取標本后，盡可能立即進行培養(yǎng)。如果不能立即處理，應留取標本后，盡可能立即進行培養(yǎng)。如果不能立即處理，應冷藏；冷藏；v 將氫氧化鈉分裝成若干小瓶（小包裝），每次使用新的氫氧化將氫氧化鈉分裝成若干小瓶（小包裝），每次使用新的氫氧化鈉；鈉；v 如果只有一臺生物安全柜，避免同時進行涂片和培養(yǎng)操作；如果只有一臺生物安全柜，避免同時進行涂片和培養(yǎng)操作；v 在同一批處理的痰標本中，優(yōu)先處理涂片陰性的標本，其次處在同一批處理的痰標本中，優(yōu)先處理涂片陰性的標本，其次處理陽性級別低的標本，最后處理涂片陽性級別高的標本理陽性級別低的標

18、本，最后處理涂片陽性級別高的標本v 打開標本容器蓋子時要緩慢以減少氣溶膠的產(chǎn)生，同時避免劇打開標本容器蓋子時要緩慢以減少氣溶膠的產(chǎn)生，同時避免劇烈震蕩標本，震蕩后靜置幾分鐘，然后再打開蓋子烈震蕩標本，震蕩后靜置幾分鐘，然后再打開蓋子51v處理標本時，盡可能隨時蓋上容器蓋子，避免在生處理標本時，盡可能隨時蓋上容器蓋子，避免在生物安全柜內敞開所有的標本容器物安全柜內敞開所有的標本容器v用過的無菌吸管應置于廢液缸中；用過的無菌吸管應置于廢液缸中；v正確標記培養(yǎng)管避免標本之間混淆；正確標記培養(yǎng)管避免標本之間混淆；v控制前處理去污染的接觸時間，從向標本中加入氫控制前處理去污染的接觸時間，從向標本中加入氫

19、氧化鈉到接種時間不能超過氧化鈉到接種時間不能超過20分鐘，為此，當標本分鐘，為此，當標本數(shù)量較多時，應分批處理，每批標本數(shù)量不超過數(shù)量較多時，應分批處理，每批標本數(shù)量不超過6份為宜；份為宜； 52v應將培養(yǎng)結果及時反饋給臨床醫(yī)生。應將培養(yǎng)結果及時反饋給臨床醫(yī)生。7天以內的結果天以內的結果觀察中如果發(fā)現(xiàn)污染，應告知病人及時收集另一份標觀察中如果發(fā)現(xiàn)污染，應告知病人及時收集另一份標本；如果發(fā)現(xiàn)快速生長分枝桿菌（本；如果發(fā)現(xiàn)快速生長分枝桿菌（7天內長出的菌天內長出的菌落）。立即報告結果并要求再收集另一份痰標本。落）。立即報告結果并要求再收集另一份痰標本。v結核菌可能在結核菌可能在3-4周內生長。發(fā)現(xiàn)

20、菌落并鑒定后立即周內生長。發(fā)現(xiàn)菌落并鑒定后立即報告結果。報告陰性培養(yǎng)結果時應孵育滿報告結果。報告陰性培養(yǎng)結果時應孵育滿8周。周。v登記內容應包括：菌落初生長的日期以及陽性培養(yǎng)物登記內容應包括：菌落初生長的日期以及陽性培養(yǎng)物的菌落特征的菌落特征;污染結果應隨時檢出并報告。污染結果應隨時檢出并報告。53v涂陽培陰率涂陽培陰率=培養(yǎng)陰性的病例總數(shù)培養(yǎng)陰性的病例總數(shù)/涂片檢查陽涂片檢查陽性的病例總數(shù)性的病例總數(shù)*100%v涂陽培陰率應涂陽培陰率應10%v污染率污染率=污染的培養(yǎng)管數(shù)量污染的培養(yǎng)管數(shù)量/培養(yǎng)管總數(shù)培養(yǎng)管總數(shù)*100%v污染率應污染率應5%54可能原因解決方法標本保存不當(時間、溫度） 標

21、本留取后盡快培養(yǎng)，暫時無法培養(yǎng)應于4C冰箱保存。標本選擇不當選擇標本中膿樣、干酪樣可疑部分過處理（時間、濃度)4NaOH，12倍體積，20分鐘接種量太小每管接種0.1毫升溫箱溫度不當溫箱內置溫度計，每日監(jiān)測溫度。？55可能原因解決方法標本保存不當(時間、溫度）標本留取后盡快培養(yǎng)，暫時無法培養(yǎng)應于4C冰箱保存。前處理不充分4，12倍，充分混旋，20分鐘。材料滅菌不佳接種用吸管需高壓滅菌。操作不當培訓，預培養(yǎng)，嚴格按操作規(guī)程操作。培養(yǎng)基因素統(tǒng)一供應，4C直立保存，1個月內使用56v 目的：治療，監(jiān)測，診斷耐藥目的：治療，監(jiān)測，診斷耐藥v 主要就是診斷耐藥結核病、選擇和調整耐藥結核病治療主要就是診斷

22、耐藥結核病、選擇和調整耐藥結核病治療方案、開展耐藥監(jiān)測以了解某一地區(qū)結核分枝桿菌的耐方案、開展耐藥監(jiān)測以了解某一地區(qū)結核分枝桿菌的耐藥水平。藥水平。57v 比例法比例法 Canetti , 1963v 臨界藥物濃度（單和多藥物濃度）臨界藥物濃度（單和多藥物濃度）v 臨界菌群比耐藥菌群數(shù)臨界菌群比耐藥菌群數(shù)/全菌群數(shù)全菌群數(shù)v 1% 、10% v 絕對濃度法絕對濃度法 Meisnner， 1963v 臨界藥物濃度（單或多藥物濃度）臨界藥物濃度（單或多藥物濃度）v 臨界藥物菌落數(shù)（臨界藥物菌落數(shù)（10、20菌落）菌落）v 比率法比率法 Mitchson， 1963v RR= MIC被檢菌被檢菌/M

23、ICH37Rv：58v含藥培養(yǎng)基的制備含藥培養(yǎng)基的制備v菌液制備和稀釋菌液制備和稀釋v接種接種v培養(yǎng)培養(yǎng)v報告結果報告結果59WHO 推薦的推薦的DST培養(yǎng)基藥物濃度培養(yǎng)基藥物濃度 ( 2007)60v 實驗前物品準備實驗前物品準備v 所有實驗用品必須無菌所有實驗用品必須無菌v 所有用品一次性拿入實驗室，不要在實驗過程中反復進所有用品一次性拿入實驗室，不要在實驗過程中反復進出實驗室出實驗室61v 一、臨床標本初分離的菌株，若具備以下特點，可直接一、臨床標本初分離的菌株，若具備以下特點，可直接用于藥敏試驗：用于藥敏試驗： 1、出現(xiàn)肉眼可見菌落后、出現(xiàn)肉眼可見菌落后12周的新鮮周的新鮮菌落。菌落。

24、2、沒有其他污染菌共存。、沒有其他污染菌共存。3、涂片確認為抗酸菌、涂片確認為抗酸菌v 二、以下情況需要二次傳代后才能進行藥敏試驗：二、以下情況需要二次傳代后才能進行藥敏試驗：1、 固體培養(yǎng)基上生長老化的菌落。固體培養(yǎng)基上生長老化的菌落。2、固體培養(yǎng)基上部分污、固體培養(yǎng)基上部分污染的菌落。染的菌落。62v 實驗人員的安全防護：分枝桿菌藥敏試驗是對高致病性實驗人員的安全防護：分枝桿菌藥敏試驗是對高致病性病原微生物的純分離培養(yǎng)物進行操作，實驗室實驗人員病原微生物的純分離培養(yǎng)物進行操作，實驗室實驗人員進入藥敏試驗區(qū)須穿防護服、鞋套，實驗中須戴手套、進入藥敏試驗區(qū)須穿防護服、鞋套，實驗中須戴手套、帽子

25、、帽子、N95口罩。口罩。63v 準備磨菌瓶或磨菌管：準備磨菌瓶或磨菌管：v 磨菌瓶為帶有可密封螺旋蓋的玻璃小瓶，裝入約磨菌瓶為帶有可密封螺旋蓋的玻璃小瓶，裝入約10個個直徑直徑3mm的玻璃珠，高壓滅菌后待用。的玻璃珠，高壓滅菌后待用。v 磨菌管為底部磨砂的玻璃管，帶有與之匹配的磨砂玻磨菌管為底部磨砂的玻璃管，帶有與之匹配的磨砂玻璃棰（磨菌棒），分別高壓后方可可使用。璃棰（磨菌棒），分別高壓后方可可使用。64v 磨菌瓶法：磨菌瓶法：v 在磨菌瓶中加入在磨菌瓶中加入12滴滴10%吐溫吐溫-80，用火焰消毒的接，用火焰消毒的接種環(huán)刮取種環(huán)刮取2-3周的新鮮菌落，置于磨菌瓶中。注意盡可能刮周的新鮮菌

26、落，置于磨菌瓶中。注意盡可能刮取多處的菌落。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上混旋取多處的菌落。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上混旋0.5-1分鐘。分鐘。加入少許滅菌的加入少許滅菌的PBS或生理鹽水。或生理鹽水。v 將懸濁液轉移至比濁管中，加生理鹽水或將懸濁液轉移至比濁管中，加生理鹽水或PBS其濁度與標其濁度與標準麥氏比濁管（準麥氏比濁管（MacFarland No.1）一致，即得到）一致，即得到1mg/ml的菌液。的菌液。65v 磨菌管法磨菌管法v 向磨菌管中加入向磨菌管中加入1滴滴10%吐溫吐溫-80，用火焰消毒的接種，用火焰消毒的接種環(huán)刮取環(huán)刮取2-3周的新鮮菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入周的新鮮菌落，放

27、入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻動，使呈乳酪樣，磨菌棒捻動，使呈乳酪樣，v 加入少許滅菌加入少許滅菌PBS緩沖液或生理鹽水，靜止片刻，緩沖液或生理鹽水，靜止片刻，v 吸適量（吸適量（1-2ml）至比濁管中，加入生理鹽水直至其濁）至比濁管中，加入生理鹽水直至其濁度與標準麥氏比濁管（度與標準麥氏比濁管（MacFarland No.1）一致，即）一致，即為為1mg/ml的菌液。的菌液。66取菌 磨菌67v每株菌事先準備好每株菌事先準備好2個稀釋管，然后用個稀釋管，然后用22 SWG標準接種環(huán)或微量吸管吸取比濁好的菌液，無菌標準接種環(huán)或微量吸管吸取比濁好的菌液，無菌操作逐步稀釋至操作逐步稀釋至10-2m

28、g/ml和和10-4mg/ml。v 22 SWG標準接種環(huán)：金屬絲直徑標準接種環(huán)：金屬絲直徑0.7mm，接種環(huán)內徑接種環(huán)內徑3mm，1滿環(huán)移液滿環(huán)移液0.01ml。68v用用22 SWG標準接種環(huán)分別沾取標準接種環(huán)分別沾取1環(huán)環(huán) （即（即0.01ml ）10-2mg/ml和和 10-4mg/ml的菌液，的菌液，用劃線法均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面，應用劃線法均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面，應注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面。最終接種菌量為接種菌量為10-4mg和和10-6mg。v接種后的培養(yǎng)基置于接種后的培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)，至四周后報告結培養(yǎng)，至

29、四周后報告結果。果。6970v 按以下方式記錄菌落生長情況：按以下方式記錄菌落生長情況：v 少于少于50個菌落：個菌落： 實際菌落數(shù)實際菌落數(shù)v 50-100個菌落：個菌落： 1+v 100-200個菌落：個菌落： 2+v 大部分融合（大部分融合（200-500個菌落）：個菌落）： 3+v 融合（大于融合（大于500個菌落）：個菌落）： 4+v 4周后觀察結果，如果生長不良，可適當延長但不能超過周后觀察結果，如果生長不良，可適當延長但不能超過6周報告結果周報告結果. （耐藥菌長的慢，藥效喪失）（耐藥菌長的慢，藥效喪失）71v 計算耐藥百分比：計算耐藥百分比：v 含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)含藥培養(yǎng)

30、基上生長的菌落數(shù)v 耐藥百分比耐藥百分比= - 100%v 對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)v 若耐藥百分比大于或等于若耐藥百分比大于或等于1%，則認為受試菌對該抗結，則認為受試菌對該抗結核藥耐藥。核藥耐藥。v 72菌菌濃濃度度藥藥物物74757677v 若高稀釋度菌液（若高稀釋度菌液（10-4mg/ml）在對照培養(yǎng)基上生長）在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于的菌落數(shù)少于20個菌落，則應從對照管傳代培養(yǎng)，重復個菌落，則應從對照管傳代培養(yǎng)，重復試驗。試驗。v 每批試驗以結核分枝桿菌參考菌株（每批試驗以結核分枝桿菌參考菌株（H37Rv敏感株）敏感株） 檢測含藥培養(yǎng)基的質量。檢測含藥培養(yǎng)

31、基的質量。78v 培養(yǎng)基制備藥物效價、保存與使用期限培養(yǎng)基制備藥物效價、保存與使用期限v 選擇新鮮、生長旺盛的菌落進行藥敏試驗，生長不良或選擇新鮮、生長旺盛的菌落進行藥敏試驗，生長不良或陳舊菌株應傳代后再進行試驗陳舊菌株應傳代后再進行試驗v 比濁、菌液稀釋應力求精確，以保證接種菌量的準確。比濁、菌液稀釋應力求精確，以保證接種菌量的準確。v 下列操作應嚴格按技術規(guī)范進行，防止產(chǎn)生氣溶膠：挑下列操作應嚴格按技術規(guī)范進行，防止產(chǎn)生氣溶膠：挑取菌落、磨菌、菌液稀釋和接種、燒灼接種環(huán)。取菌落、磨菌、菌液稀釋和接種、燒灼接種環(huán)。v 實驗后按要求處理廢棄物和實驗物品。實驗后按要求處理廢棄物和實驗物品。79對

32、照培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基藥物儲存液藥物儲存液混合、搖勻混合、搖勻基礎液改良L-J100ml1ml磨菌磨菌分裝分裝凝固凝固分裝分裝凝固凝固1mg/ml菌懸液菌懸液1010-4 -4 mg/ml 1010-2 -2 mg/ml 100倍稀釋倍稀釋100倍稀釋倍稀釋接種接種0.01ml接種接種0.01ml2-3周周新鮮菌落新鮮菌落凍存凍存80v 根據(jù)分支桿菌在一些特定培養(yǎng)基上是否生長的特性，將其根據(jù)分支桿菌在一些特定培養(yǎng)基上是否生長的特性，將其初步鑒定為人型結核分支桿菌、牛型結核分支桿菌和非典初步鑒定為人型結核分支桿菌、牛型結核分支桿菌和非典型分支桿菌。型分支桿菌。v 主要的培養(yǎng)基為主

33、要的培養(yǎng)基為PNB（對硝基苯甲酸）、（對硝基苯甲酸）、TCH（噻吩（噻吩-2-羥酸肼）培養(yǎng)基羥酸肼）培養(yǎng)基v 接種方法：用接種方法：用22 SWG標準接種環(huán)沾取標準接種環(huán)沾取1環(huán)環(huán) 10-1mg/ml的菌液（即的菌液（即0.01ml ），用劃線法均勻接種至），用劃線法均勻接種至PNB、TCH培養(yǎng)基表面，每管最終接種菌量為培養(yǎng)基表面，每管最終接種菌量為10-3mg/管。管。v 接種后的培養(yǎng)基置于接種后的培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)，至四周后報告結果。培養(yǎng)，至四周后報告結果。8182衛(wèi)生部衛(wèi)生部-蓋茨基金會項目蓋茨基金會項目83衛(wèi)生部衛(wèi)生部-梅里埃基金會項目梅里?；饡椖?4實驗方法醫(yī)院數(shù)量MIGT 96

34、0液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的比較5衛(wèi)生部衛(wèi)生部-碧迪公司項目碧迪公司項目8586v發(fā)光二極管發(fā)光二極管（ （LEDLED） ）熒光熒光顯微鏡顯微鏡 光源壽命光源壽命長長（ （30,000h30,000h） ） 不不需要預熱需要預熱 不需要不需要暗室暗室 可用現(xiàn)有的顯微鏡可用現(xiàn)有的顯微鏡 可使用可使用電池電源電池電源v 與與通常通常熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的判定判定一致率一致率98.0%98.0%（ （n=1,326/n=1,326/內內部部資料資料） ）Fraen FluoLED module87v Z-N染色鏡檢結果染色鏡檢結果v LED鏡檢結果鏡檢結果88v初診患者初診患者v LED涂陽患者檢出率

35、為涂陽患者檢出率為14.96%（552/3691），萋），萋尼氏染色明場顯微鏡涂陽患者檢出率尼氏染色明場顯微鏡涂陽患者檢出率12.46% (460/3691)，前者較后者提高，前者較后者提高2.5個百分點個百分點（P=0.000）v隨訪患者隨訪患者v LED和明場顯微鏡的檢出率分別為和明場顯微鏡的檢出率分別為7.09%(178/2509)和和2.83%（71/2509)，提高，提高4.26個百分點（個百分點（P=0.000）89v讀片時間讀片時間v LED 讀片時間讀片時間120.0338.88秒，明場顯微鏡秒，明場顯微鏡206.3175.86秒（秒（p=0.00）v使用接受度調查使用接受度調

36、查v 對于進一步推廣建議，大多數(shù)對于進一步推廣建議，大多數(shù)(8/9)認為應進一步推廣，認為應進一步推廣，但其中有但其中有2人認為應在日工作量大的實驗室優(yōu)先使用人認為應在日工作量大的實驗室優(yōu)先使用90v可檢測是否感染結核桿菌可檢測是否感染結核桿菌v可同時檢測患者是否對利福平和異煙肼耐藥可同時檢測患者是否對利福平和異煙肼耐藥v約五小時內即可得到檢測結果約五小時內即可得到檢測結果91 檢測步驟v DNA提?。禾崛。?1.5hv PCR擴增：擴增：2.53hv 探針雜交：探針雜交：22.5hv 結果判讀：結果判讀：0.5h92v利福平利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結核分枝桿菌特異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結核分

37、枝桿菌特定基因某些位點的突變相關。定基因某些位點的突變相關?？菇Y核藥基因基因功能利福平rpoB編碼DNA依賴RNA聚合酶，參與mRNA轉錄過程異煙肼katG編碼過氧化氫-過氧化物酶，參與INH體內的轉化inhA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴的enoyl-ACP還原酶，參與脂酸的合成93利福平線性探針傳統(tǒng)藥敏合計一致率靈敏度特異性PPV陽性預測值NPV陰性預測值耐藥敏感合計耐藥1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感4511271172合計1801168134894異煙肼線性探針傳統(tǒng)藥敏總計一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計耐藥1493017993

38、.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合計2101138134895MDR線性探針傳統(tǒng)合計一致率靈敏度特異性PPVNPVMDR非-MDR合計MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合計1191229134896激光共焦掃描儀軟件判讀結核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書樣品制備儀雜交儀n 通 量：兩個一線抗結核藥n 速 度： 6 小時（比傳統(tǒng)藥敏試驗法快 50-100 倍）n 靈敏度：103 CFU/反應n 特異性：對照設計嚴謹；自動判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰

39、樣本中結核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3）96獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認證97基因芯片基因芯片v 基因芯片是指采用光導原位基因芯片是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將合成或微量點樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標記的物的表面，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高的強度進行快速、并行、

40、高效地檢測分析，從而判斷樣效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。品中靶分子的數(shù)量。98雜交反應雜交清洗清洗干燥掃描檢測數(shù)據(jù)分析檢測分析PCR擴增DNA 提取樣品制備99100產(chǎn)品指標基因芯片線性探針注冊證書SFDA、CESFDA、CE產(chǎn)地中國德國用途從涂片陽性痰標本或培養(yǎng)物中檢測對利福平和異煙肼的耐藥性從涂片陽性痰標本或培養(yǎng)物中檢測分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性檢測原理耐藥相關基因的突變耐藥相關基因的突變（參考國際文獻）檢測方法反向雜交（斑點）反向雜交（slot 縫隙）需要儀器核酸提取儀、基因擴增儀、芯片雜交儀、芯片洗干儀和掃描儀超聲水浴、基因擴增儀、雜交儀試劑儲藏4 和-204 和-2

41、0檢測指標 M.tb + 16 NTM種/群 M.tb + 13 NTM種/群 可擴展性 強 弱 內部質控 5種 3種靈敏度 102-103菌/ml JCM, in revision 102-103菌/ml JCM, 2002 符合率 三家醫(yī)院，1724例，測序符合率100% 分離株(157株)JCM 2008,(197株)JCM 2006,(219株)CMI 2006。符合率分別為100%,98.9%和88% 探針重復5次 1次 檢測重復性 10次重復，結果均正確 無相關資料 其他樣本 痰標本、分離株痰標本、分離株操作流程 自動化高（雜交-清洗-掃描），省力，通量高，重復性好 自動化低（雜交

42、）， 費力，通量低，重復性稍差 結果判讀 儀器掃描，軟件自動判讀 雜交顯示條帶需黏貼比對，肉眼或自動判讀，。 成本 相當（根據(jù)兩家的市場價格和在疾病預防控制體系中應用的承諾價格 ）101v可同時檢測患者是否感染結核可同時檢測患者是否感染結核v對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性v兩小時內即可得到檢測結果，所用儀器設備極其兩小時內即可得到檢測結果，所用儀器設備極其簡單簡單102PCR LAMP需要使用需要使用PCR擴增儀擴增儀 針對針對基因基因設計設計的特異性的兩條引物的特異性的兩條引物 擴增效率擴增效率:107不需要使用不需要使用PCR擴增儀擴增儀

43、多多對對引物保引物保證證了了擴擴增的特異性增的特異性 擴擴增效率增效率:1010103抽提基因組DNA 擴增管去除雜質將純凈DNA轉入擴增管 痰血液咽試子標本類型樣品處理在幾分鐘內就可以完成104v可同時檢測患者是否結核以及是否對利福平耐藥可同時檢測患者是否結核以及是否對利福平耐藥v對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性對涂陰培陽病人具有非常高的敏感性和特異性v兩小時內即可得到檢測結果，所用儀器設備簡單兩小時內即可得到檢測結果，所用儀器設備簡單105基于核酸擴增的一步法利福平耐藥檢測Xpert TM MTB/Rif技術平臺技術平臺 利福平的耐藥性分析 喹諾酮類藥物耐藥性 HIV 病毒載量分析自動化的標本處理和檢測，可以在自動化的標本處理和檢測，可以在2小小時內出結果時內出結果h106原理：原理：v分枝桿菌抗原致敏的分枝桿菌抗原致敏的T細胞體外再次接觸分枝桿菌抗原時細胞體外再次接觸分枝桿菌抗原時會產(chǎn)生會產(chǎn)生IFN- ；v大量產(chǎn)生的大量產(chǎn)