人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則培訓(xùn)講學(xué)

1、人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則一、引言由于分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及重組 DNA（ rDNA技術(shù)的迅速發(fā)展，現(xiàn)已 能夠確定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因， 將其插入表達(dá)載體或引入某種宿 主細(xì)胞后，能有效地表達(dá)該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化和檢定，可得到用于預(yù)防 和治療某些人類疾病的制品，諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長激素、干 擾素等。用不同于常規(guī)方法的rDNA技術(shù)生產(chǎn)的制品，是近年來出現(xiàn)的新產(chǎn)品，評 價其安全性和有效性亦不同于常規(guī)方法。這一領(lǐng)域中的知識和技術(shù)還在不斷發(fā) 展，為了有利于這類制品在我國的研究和發(fā)展，并為這類制品的審評提供依據(jù)， 有必要制定一個原則性指導(dǎo)文件，以保證在人群中試

2、驗或應(yīng)用時安全有效。本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”（以下簡稱指導(dǎo)原則） 不可能面面俱到， 可能有許多專門技術(shù)問題會出現(xiàn)， 對于這類問題或某一特定制 品，則應(yīng)視具體問題具體研究決定。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗 積累而逐步完善。二、總則（一）本指導(dǎo)原則適用于rDNA技術(shù)生產(chǎn)并在人體內(nèi)應(yīng)用的蛋白質(zhì)、 肽類制品。（二）凡屬與一般生物制品有關(guān)的質(zhì)量控制，均按現(xiàn)行版中國藥典 有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。 有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國家藥品監(jiān)督管理局 藥品生產(chǎn)質(zhì)量 管理規(guī)范執(zhí)行。三、質(zhì)量控制要求（一）原材料的控制1 表達(dá)載體和宿主細(xì)胞應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達(dá)載 體的

3、構(gòu)建、 結(jié)構(gòu)和遺傳特性。 應(yīng)說明載體組成各部分的來源和功能， 如復(fù)制子和 啟動子來源，或抗生素抗性標(biāo)志物。提供至少包括構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜。 應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料，包括細(xì)胞株（系）名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。應(yīng)詳細(xì)說明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài) （是否整合 到染色體內(nèi)）及拷貝數(shù)。應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。2 克隆基因的序列應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有 關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。3 表達(dá)應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所 采用的方法及表達(dá)水平。4原輔料 原輔料應(yīng)按照國家藥品監(jiān)督管

4、理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動物源性原料的使用 應(yīng)提供來源及質(zhì)控檢測資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加B內(nèi)酰胺類抗生素。（二）生產(chǎn)的控制1 主細(xì)胞庫（ MASTERCELLBA）NKrDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批（SEEDLOT系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫 中，再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫（ WC）B 。含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過克隆而建立主細(xì)胞庫。在此過程中，在同 一實驗室工作區(qū)內(nèi)，不得同時操作兩種不同細(xì)胞（菌種）；一個工作人員亦不得 同時操作兩種不同細(xì)胞或菌種。應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來源、方式、保存及預(yù)計使用壽命。應(yīng)提供在保 存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。 采用新的種子批時， 應(yīng)重新作 全面檢定。真核細(xì)胞

5、用于生產(chǎn)時， 細(xì)胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征， 對鑒別所建立的種子是有用的。 有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性應(yīng)有詳細(xì)報告。 如采 用微生物培養(yǎng)物為種子，則應(yīng)敘述其特異表型特征。一般情況下，在原始種子階段應(yīng)確證克隆基因的 DNA序列。但在某些情 況下，例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對克隆基因作 DNA序列分析。在此情況下，可采用總細(xì)胞 DNA勺雜交印染分析，或作 mRN的 序列分析。對最終產(chǎn)品的特征鑒定應(yīng)特別注意。種子批不應(yīng)含有外源致癌因子，不應(yīng)含有感染性外源因子，如細(xì)菌、支 原體、真菌及病毒。有些細(xì)胞株含有某些內(nèi)源病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，且不易除去。但當(dāng)已 確知

6、在原始細(xì)胞庫或載體部分中污染此類特定內(nèi)源因子時， 則應(yīng)能證明在生產(chǎn)純 化過程可使之滅活或清除。2 有限代次生產(chǎn)用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法應(yīng)有詳細(xì)資料。對培養(yǎng)過程及收 獲時，應(yīng)有敏感的檢測措施控制微生物污染。應(yīng)提供培養(yǎng)生長濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并應(yīng)確立廢棄一批培養(yǎng) 物的指標(biāo)。 根據(jù)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料， 確定在生產(chǎn)過程中允許的最 高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。在生產(chǎn)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)?？截?數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、 含插入基因的載體的酶切圖譜。 一般情況下， 用來自一個原始細(xì)胞庫的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測， 必要時應(yīng)

7、做一次目的基因的核苷 酸序列分析。3 連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)基本要求同 2 項。應(yīng)提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表 型和基因型特征。 每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。 對可以進(jìn)行后處理及應(yīng) 廢棄的培養(yǎng)物， 應(yīng)確定指標(biāo)。 從培養(yǎng)開始至收獲， 應(yīng)有敏感的檢查微生物污染的 措施。根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定性資料，應(yīng)規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時 間。如屬長時間連續(xù)培養(yǎng)， 應(yīng)根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料， 在不同 間隔時間作全面檢定。4 純化對于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸 以及有害抗原性物質(zhì)的去除。如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，應(yīng)有檢測可能污

8、染此類外源 性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測出的異種免疫球蛋白。對整個純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究，包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。關(guān)于純度的要求可視制品的用途和用法而確定，例如，僅使用一次或需 反復(fù)多次使用；用于健康人群或用于重癥患者；對純度可有不同程度要求。（三）最終產(chǎn)品的控制 應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗方法。檢測 的必要性和純度要求取決于多種因素： 產(chǎn)品性質(zhì)和用途、 生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn) 工藝的經(jīng)驗。 一般說來下列試驗對控制產(chǎn)品質(zhì)量是可以采用的。 新的分析技術(shù)及 對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時應(yīng)使用這些新的技術(shù)

9、。1 物理化學(xué)鑒定（1）氨基酸組成 使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列 推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。 如需要時應(yīng)考慮分子量的大小。 多數(shù)情況 下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結(jié)構(gòu)資料， 但對大蛋白一般 意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。（2）氨基酸末端序列氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目 的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生改變時， 應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異 數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來自目的產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列 進(jìn)行比較。（3）肽譜 應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)

10、品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽， 應(yīng)用 HPLC 或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍?應(yīng)盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測 序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對批簽發(fā)來說 ,經(jīng)驗證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn) 品結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。（4）巰基和二硫鍵 如果依據(jù)目的產(chǎn)品基因序列存在半胱氨酸殘基時， 應(yīng)盡可能確定巰基和 /或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜 測定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?。?）碳水化合物結(jié)構(gòu)應(yīng)測定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點（6）分子量應(yīng)用分子篩層析法、SDS-PAGE還原和/或非

11、還原條件下）、質(zhì)譜測定法、 和 / 或其他適當(dāng)技術(shù)測定分子量。（ 7 ）等電點通過等電聚焦電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒y定。（8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）多數(shù)情況下，可取目的產(chǎn)品于 UV/可見光波長處測定消光系數(shù)（或克分 子吸光度）。消光系數(shù)的測定為使用 UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量 的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測定。（ 9 ）電泳圖型應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SD&PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法 或其他適當(dāng)?shù)姆椒?,獲得目的產(chǎn)品 /藥物的一致性 ,同一性和純度的電泳圖譜和數(shù) 據(jù)。（10）液相層析圖譜 應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析

12、、親和層析或其他適當(dāng)方法，獲得目的產(chǎn)品 /藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。（11）光譜分析 適當(dāng)時，應(yīng)用紫外或可見光吸收光譜法測定，使用圓二色譜、核磁共振（NMR、或其他適當(dāng)?shù)姆椒z測制品的高級結(jié)構(gòu)。2 雜質(zhì)檢測（ 1 ）工藝相關(guān)雜質(zhì) 工藝相關(guān)雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基 和下游工藝。 來源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白 /多肽；核酸（宿主 細(xì)胞/載體/總DNA ；多糖及病毒。對于宿主細(xì)胞蛋白，一般應(yīng)用能檢測出較寬 范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測方法。 應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物， 即不 含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞， 制備上述試驗使用的多克隆抗

13、體。 可通過對產(chǎn)品 的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記實驗（實驗室規(guī)模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導(dǎo)入的病毒，應(yīng) 驗證生產(chǎn)工藝中去除 / 滅活病毒的能力。 來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及 其他培養(yǎng)基組分。 來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、 胍、氧化劑和還原劑）、無機鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載 體/ 配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。（ 2）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) 以下為最常見的目的產(chǎn)品的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測方法： 化學(xué)修飾類型：應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯配 S

14、-S連接和氧化形式的 分離和鑒別。 對這些變異體的分離和鑒別， 可應(yīng)用層析法和 /或電泳法（如 HPLC、 毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。 降解物和聚合體： 聚合體包括二聚體和多聚體： 可用分子篩層析法 （如SE-HPLC進(jìn)行定量；降解物：應(yīng)建立降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對穩(wěn)定性試驗產(chǎn)生 的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測。3 生物學(xué)測定（ 1）鑒別試驗應(yīng)用免疫印跡法，或者在可能情況下，應(yīng)用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn) 品通過生物學(xué)比較試驗，確定其與天然產(chǎn)品是一致的。（ 2 ）效價測定采用國際或國家參考品，或經(jīng)過國家檢定機構(gòu)認(rèn)可的參考品，以體內(nèi)或 體外法測定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。（3）特異比活性測定

15、 在測定生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，對有些制品還應(yīng)用適當(dāng)方法測定主藥蛋白含量，測定其特異比活性，以活性單位重量表示。（4）熱原質(zhì)試驗應(yīng)采用家兔法或鱟試驗法（LAL）作熱原質(zhì)檢測，控制標(biāo)準(zhǔn)可參照天然制 品的要求。（ 5）無菌試驗 參照現(xiàn)行版中國藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，應(yīng)證實最終制品無細(xì)菌污染。（ 6）抗原性物質(zhì)檢查必要時，如制品屬大劑量反復(fù)使用者，應(yīng)測定最終制品中可能存在的抗 原性物質(zhì)， 如宿主細(xì)胞、 亞細(xì)胞組分及培養(yǎng)基成份等。 患者反復(fù)接受大劑量的這 類制品時，應(yīng)密切監(jiān)測由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反應(yīng)。（7）異常毒性試驗 可參照現(xiàn)行版中國藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。4 其他根據(jù)產(chǎn)品劑型， 應(yīng)有外觀（如固體、液體、

16、色澤、澄明度等方面的描述） 、 水分、PH值、裝量等方面的規(guī)定，可參照現(xiàn)行版中國藥典相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。四、臨床前安全性評價 臨床前安全性試驗的目的主要是確定新制品是否會在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)。但是，用于一般化學(xué)藥物的傳統(tǒng)安全性或毒性試驗對rDNA產(chǎn)品不一定適用，用傳統(tǒng)毒性試驗來評價rDNA產(chǎn)品往往有困難，并受多種因素的影響。 例如，某些蛋白質(zhì)，如干擾素，具有高度種屬特異性，這種人的蛋白質(zhì)對人的藥 理學(xué)活性遠(yuǎn)高于對動物的活性， 而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列， 常常與來自其它種 系的蛋白質(zhì)不同， 例如糖基就不一樣。 因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽 類往往會在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 其生物學(xué)效應(yīng)有所改變， 并可 能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)， 而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯 然無關(guān)。另外，由于產(chǎn)品效價、生