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文檔簡介

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第一章 緒論1生物技術(shù) 是以生命科學(xué)為基礎(chǔ),利用生物體(或生物組織、細(xì)胞及其組分)的特性和功能,設(shè)計(jì)構(gòu)建有預(yù)期性狀的新物種或新品系,并與工程相結(jié)合,進(jìn)行加工生產(chǎn),為社會(huì)提供商品和服務(wù)的一個(gè)綜合性的技術(shù)體系。2生物技術(shù)的主要內(nèi)容:P1基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程:運(yùn)用基因工程全套技術(shù)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)。染色體工程:探索基因在染色體上的定位,異源基因?qū)?、染色體結(jié)構(gòu)改變。生化工程:生物反應(yīng)器及產(chǎn)品的分離、提純技術(shù)。3生物技術(shù)制藥 采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為創(chuàng)造條件,借助微生物、植物或動(dòng)物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品過程被稱為 4生物技術(shù)藥物 采用DNA重組技術(shù)或其它生

2、物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物才能被稱為 5生物藥物 生物技術(shù)藥物與天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品一起歸類為 PPT復(fù)習(xí)題第二章 基因工程制藥 1、簡述基因工程制藥的基本程序。P162、說明基因工程技術(shù)用于制藥的三個(gè)重要意義。P15第一段第一行3、采用哪兩種方法來確定目的cDNA克???P18(7目的基因cDNA的分離和鑒定)核酸探針雜交法用層析法或高分辨率電泳技術(shù) (蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)或質(zhì)譜技術(shù))分離出確定為藥物的蛋白質(zhì),氨基酸測序,按照密碼子對應(yīng)原則合成出單鏈寡聚核苷酸,用做探針,與cDNA文庫中的每一個(gè)克隆雜交。這個(gè)方法的關(guān)鍵是分離目的蛋白,免疫反應(yīng)鑒定法(酶聯(lián)免疫吸附檢測

3、 )4、說明用大腸桿菌做宿主生產(chǎn)基因工程藥物必須克服的6個(gè)困難。 原核基因表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)產(chǎn)物,必須破胞分離,受胞內(nèi)其它蛋白的干擾,純化困難; 原核基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)多為不溶性(包含體, inclusion body),必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理以恢復(fù)藥物蛋白的生物學(xué)活性,工藝復(fù)雜; 沒有翻譯后的加工機(jī)制,如糖基化,應(yīng)用上受到限制; 產(chǎn)物的第一個(gè)氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸,因無加工機(jī)制,常造成N-Met冗余,做為藥物,容易引起免疫反應(yīng); 細(xì)菌的內(nèi)毒素不容易清除; 細(xì)菌的蛋白酶常常把外源基因的表達(dá)產(chǎn)物消化;5、用藍(lán)藻做宿主生產(chǎn)基因工程藥物有什么優(yōu)越性?藍(lán)藻:很有前途的藥物基因的宿主細(xì)胞 有內(nèi)源質(zhì)粒,

4、美國Wolk實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建1200種人工質(zhì)粒,可用做基因載體。 載體轉(zhuǎn)化藍(lán)藻不需要誘發(fā)感受態(tài)就可以做到; 外源基因產(chǎn)物不形成包含體,分離與純化工藝可以大大被簡化; 可以直接食用,等于直接口服藥物6、結(jié)合pBG-2說明選擇用于E. coli 細(xì)胞宿主中的載體的6項(xiàng)原則。P23 與pBV220優(yōu)點(diǎn)類似,原則P227、簡述基因工程菌中質(zhì)粒不穩(wěn)定的兩個(gè)指標(biāo)?P32如何計(jì)算質(zhì)粒的穩(wěn)定性?P33質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法(ST=出現(xiàn)的菌落數(shù)/100)8、 簡述提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的兩步培養(yǎng)法P33分階段控制培養(yǎng)普遍使用的兩步培養(yǎng)法,是在接種后只讓菌體細(xì)胞快速分裂,這一步培養(yǎng)過程中,外源基因不表達(dá);然后再誘導(dǎo)載體上的藥物基

5、因以最高效率表達(dá),積累藥物蛋白。9、簡述基因工程藥物分離純化工藝設(shè)計(jì)中必須考慮的藥物的5個(gè)特點(diǎn)。P46 (摘自PPT) 在初始物料中的含量低:藥物分離困難。外源基因表達(dá)盡管是在菌體生長對數(shù)期被誘導(dǎo)的,在與菌體生長過程中的代謝產(chǎn)物比較,在發(fā)酵產(chǎn)物的初始物料中含量也是很低的。 初始物料的成分復(fù)雜:不利于藥物蛋白的分離與純化。除了藥物基因產(chǎn)物外,菌體細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、殘留的培養(yǎng)基、無機(jī)鹽,尤其是藥物蛋白的類似物。 藥物蛋白的穩(wěn)定性差:分離與純化條件相對苛刻。容易失活或變性,對各種物理化學(xué)因素十分敏感。 分離與純化的技術(shù)差異大:基因工程藥物種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。不同的藥物分離與純化必須考慮其分子特征。 對

6、不同藥物的質(zhì)量和純度有不同的要求:藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)藥物的應(yīng)用制定的,沒有統(tǒng)一的制備、分離、純化的標(biāo)準(zhǔn)。第三章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥1、解釋動(dòng)物細(xì)胞的兩種培養(yǎng)方式。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)大致可分為兩種:群體培養(yǎng)(mass culture)是把一定數(shù)量的細(xì)胞懸浮液置于培養(yǎng)瓶中,讓細(xì)胞貼壁生長,匯合(confluence)后形成單細(xì)胞層。克隆培養(yǎng)(clonal culture)是將高度稀釋的游離細(xì)胞懸浮液置于培養(yǎng)瓶中,各個(gè)細(xì)胞貼壁后彼此距離較遠(yuǎn),經(jīng)過生長增殖,每一個(gè)細(xì)胞集落均來源于一個(gè)細(xì)胞祖先,稱為一個(gè)“克隆”(“clone”)。2、舉例說明三種細(xì)胞培養(yǎng)特征。P801、貼壁細(xì)胞:生長須有貼附的支持物表面;貼附因

7、子來自培養(yǎng)基或細(xì)胞自身分泌。有兩種細(xì)胞類型:成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型。2、懸浮細(xì)胞:生長不依賴支持物表面,在培養(yǎng)液中懸浮生長,如淋巴細(xì)胞。3、兼性貼壁細(xì)胞:生長對貼壁支持物表面要求不嚴(yán)格。如中國地鼠卵巢細(xì)胞(CHO),小鼠L929細(xì)胞。3、細(xì)胞系與細(xì)胞株的區(qū)別是什么?細(xì)胞系(cell line):從原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)后得到的一群不均一的細(xì)胞,可以連續(xù)培養(yǎng),即這些細(xì)胞具備培養(yǎng)條件下的無限增殖能力。細(xì)胞株(cell strain):通過選擇或克隆化,從原代培養(yǎng)的細(xì)胞群獲得的、具有特殊遺傳/生化性質(zhì)或特異性標(biāo)記的細(xì)胞群。細(xì)胞株強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)的細(xì)胞的單一性特征,即克隆本質(zhì);而細(xì)胞系并不強(qiáng)調(diào)細(xì)胞的純度,可以包

8、含多種細(xì)胞,但主類細(xì)胞占大多數(shù)。4、說明動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的優(yōu)缺點(diǎn)。缺點(diǎn):培養(yǎng)條件苛刻、成本高、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯后修飾糖基化,與天然產(chǎn)品一致。5、如何獲得二倍體細(xì)胞株?PF86 何為二倍體細(xì)胞株 從動(dòng)物胚胎組織中獲得 從各國細(xì)胞庫或有關(guān)機(jī)構(gòu)獲?。≒87第二段)6、舉例說明兩類基因工程細(xì)胞。A. 病毒載體:牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒B. 質(zhì)粒載體:穿梭質(zhì)粒載體7、簡單但全面敘述桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。(需總結(jié)概括)桿狀病毒(Baculoviruses)是昆蟲病毒,128 kb雙鏈DNA基因組。優(yōu)點(diǎn)P88桿狀病毒基因組比較大,一般用同源重組方法引入外源基因。構(gòu)

9、建過程: 插入位點(diǎn):多角體蛋白基因啟動(dòng)子的后面; 操作方式:重組質(zhì)粒與桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞,獲得發(fā)生同源性重組的、含有外源基因的病毒顆粒; 導(dǎo)入細(xì)胞:重組病毒載體感染昆蟲細(xì)胞(如Sf-9細(xì)胞株)(如果用的是BmNPV,可以直接感染家蠶,獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。)8、構(gòu)建基因工程細(xì)胞選擇質(zhì)粒載體所考慮的4個(gè)問題。P88最后一段9、說明動(dòng)物血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用。提供生長因子和激素 提供貼壁因子和伸展因子 提供結(jié)合蛋白 提供必需脂肪酸和微量元素10、細(xì)胞大量培養(yǎng)為什么必須使用無血清培養(yǎng)基? 提高細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性,避免血清差異的影響; 減少血清帶來的污染; 供應(yīng)及時(shí)、穩(wěn)定、充足; 細(xì)胞產(chǎn)品容易純化;

10、避免血清某些成分對細(xì)胞的毒性; 減少血清蛋白對生物測定的干擾。第四章 抗體制藥1、畫圖說明抗體分子(IgG)的結(jié)構(gòu),指出Fab、Fv、Fc 和 Fd。P1512、說明單克隆抗體在醫(yī)療和研究中的三個(gè)用途。詳見P143單克隆抗體作為抗體制劑,在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。如1.利用單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原,輔助臨床診斷。2.用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像,做免疫定位診斷。3.單克隆抗體制劑也用于臨床治療,如針對T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體,因其對器官移植排斥反應(yīng)有顯著的抑制效果,用作免疫抑制劑已在美國標(biāo)準(zhǔn)上市。3、獲得單克隆抗體為什么必須使用雜交瘤技術(shù)?度娘雜交

11、瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)的主要特征是它的抗體分泌功能,但不能在體外連續(xù)培養(yǎng),小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖,即具有所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下,只有B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力,形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。4、什么是HAT選擇?P146最后一段5、說明檢測雜交瘤的細(xì)胞學(xué)方法的原理。P148動(dòng)物的染色體制片技術(shù)相對簡單,在普通光學(xué)顯微鏡下就可以確定染色體核型(chromosome

12、 karyotype) 。小鼠的染色體全部都是端部著絲點(diǎn)染色體,2n=40;骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目大于40,2n40,并且有骨髓瘤特有的標(biāo)記染色體。所以,雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)該是兩種細(xì)胞染色體數(shù)之和。由于有HAT選擇在前,用核型分析確定雜交瘤細(xì)胞只有一個(gè)條件:2n80。6、說明對鼠原性單克隆抗體改造的兩個(gè)原則。降低免疫原性、降低分子量。7、說明CD4-Ig抗HIV的原理。HIV感染就是其gp120專一性結(jié)合淋巴T細(xì)胞巨噬細(xì)胞表面的細(xì)胞受體CD4 (CD4是T細(xì)胞重要的活化因子),使T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞失去對HIV和其它病原體的免疫攻擊能力。CD4-IgG是把分化抗原CD4結(jié)合到IgG的FC區(qū),稱

13、免疫黏連素。HIV表面的gp120只有一個(gè)與CD4結(jié)合的位點(diǎn),只要免疫黏連素CD4-IgG分子與gp120結(jié)合, HIV就失去了感染能力。10、說明細(xì)胞因子IL-1和IL-2的免疫學(xué)功能。愛咋咋地11、為什么噬菌體表面展示和PCR技術(shù)是抗體庫構(gòu)建的兩項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)。噬菌體表面展示技術(shù) (phage display)被廣泛應(yīng)用于抗體庫構(gòu)建,成為目前使用的噬菌體抗體庫技術(shù) (phage antibody library)。噬菌體表面展示,即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中,與噬菌體外膜蛋白融合表達(dá),展示在噬菌體顆粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒

14、內(nèi),因此,通過表型篩選就可以獲得它的編碼基因。噬菌體抗體庫技術(shù),克服了人體不能隨意免疫的缺點(diǎn),用人的外周血制備抗體文庫,從而獲得人源性基因工程抗體,并且將抗體基因克隆和表達(dá)融為一體,同在一種載體上進(jìn)行,將抗體基因表達(dá)在載體的表面,用固相化抗原對表達(dá)產(chǎn)物的載體進(jìn)行淘篩,在數(shù)日內(nèi)即可篩出陽性克隆,從而能構(gòu)建出大庫容(108)文庫囊括天然全套抗體基因,使抗體工程的設(shè)想成為現(xiàn)實(shí)。第五章 植物細(xì)胞制藥1、解釋:初級代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、外植體P1782、說明培養(yǎng)基中的碳、氮、無機(jī)鹽和生長因素。P1863、說明植物細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳源來源及其作用。P1954、說明常用的植物生長素與細(xì)胞分裂素。P1895、培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的配比的效應(yīng)。生長素/細(xì)胞分裂素 :高 ,有利于根和愈傷組織的形成. 適中,有利于根芽的分化.低,有利于芽的形成6、舉例說明誘導(dǎo)子在培養(yǎng)中的作用。P2047、舉例說明什么是前體飼養(yǎng)?P206第七章 發(fā)酵工程制藥

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