生物藥物分析及檢驗氨基酸、多肽與蛋白質類藥品檢驗

1、生物藥物分析及檢驗氨基酸、多肽與蛋白質類藥品檢驗l基本要求： l掌握氨基酸定性鑒別的方法，熟悉氨基酸特殊雜質及安全性檢查，掌握氨基酸含量測定方法，掌握多肽因子類藥物的定性鑒別方法，熟悉多肽因子類藥物的檢查方法，掌握多肽因子類藥物生物效價的測定方法，掌握蛋白質類藥物的鑒別和檢查方法，掌握蛋白質含量測定和效價測定方法，了解幾種氨基酸、多肽因子和蛋白質藥物的質量分析過程?；緝热莸谝还?jié) 氨基酸類藥品檢驗第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質類藥品檢驗第三節(jié) 幾種氨基酸、多肽和蛋白質藥物的質量分析l氨基酸是治療蛋白質代謝紊亂、蛋白質缺損所引起的一系列疾病的重要生化藥物，也是具有高度營養(yǎng)價值的蛋白質補充劑，有著廣泛

2、的生化作用和臨床療效。l目前氨基酸及其衍生物臨床應用不斷發(fā)展和擴大，創(chuàng)制了一些新的生化藥物。l如甲基酪氨酸治療嗜鉻細胞瘤l氧苯丙氨酸用于類癌瘤綜合征l偶氮絲氨酸治療白血病l乙酰羥脯氨酸用于治療類風濕關節(jié)炎l氨基酸為白色晶狀體，熔點很高，多在熔融時分解，都能溶解在強酸強堿中，形成的鹽多能溶于水。l氨基酸在等電點（pI）時溶解度最小，最穩(wěn)定。l中性pI值在5左右。l酸性pI值在左右。l堿性氨基酸的pI值在左右。一、氨基酸的定性鑒別l旋光度、熔點、溶解度、紙層析、氨基酸自動化分析、氣相色譜等均可作為氨基酸鑒別的依據。1、化學鑒別法l氨基酸的鑒別最常用的方法是根據所有氨基酸均能與茚三酮顯藍紫色。l采用

3、茚三酮顯色法，中國藥典（2010年）二部對所收載的氨基酸類藥物大多采用此方法進行鑒別。 茚三酮反應：茚三酮在酸性溶液中與-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反應，最后生成紫色物質。藍紫色溶液樣品靜置水加熱茚三酮水min15mL20min3.mL1mL55STmgOOOHOH+ H-C-NH2COOHROOOHH+ NH3CO2RCO+OOHOHO+OOOHH+ NH3H2OCOOOOH+N2、光譜鑒別法（1）紫外吸收光譜法 在20種天然氨基酸中，只有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在紫外區(qū)有最大吸收。l酪氨酸的max275nml苯丙氨酸的max257nm l色氨酸的max280nm1：酪氨酸：酪氨酸

4、2：色氨酸：色氨酸3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。l這三種氨基酸可以通過紫外吸收光譜加以鑒別。l精密稱取酪氨酸、色氨酸、苯丙氫酸各適量。l用水制成每1mL含20g（色氨酸）、40g（酪氨酸）、200g（苯丙氨酸）。l在波長230300nm測定各氨基酸的吸收光譜，如右圖。（2）紅外吸收光譜圖 氨基酸在紅外區(qū)都有特性圖譜，可以通過與標準氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別依據。l所得的吸收圖譜各主要吸收峰波長和各吸收峰間的相互強度關系均應與對照的圖譜一致。3、薄層色譜鑒別法l在薄層板上點樣，通過與標準氨基酸對照而鑒別氨基酸。（1）薄層板的制備待用微晶纖維素樣品溶劑揮發(fā)完畢后均勻涂板拌成糊狀水無水乙醇，hCg5

5、 . 1 ,105mL5 . 2mL205（2）十一種氨基酸混合液（色、蛋、亮、異亮、甘、賴、蘇、纈、苯丙、組、精）與對照液的制備?；旌洗郎y液加水定容至mL1025mg各種對照液分別加水定容至mL15 . 2 mg（3）點樣、展開和顯色 吸取混合液和對照液各3L，分別點于同一薄層板上。l以正丁醇-水-異丁酸-醋酸（505057）之上層作展開劑，進行單向三次展開，展開約15cm，每次必須待溶劑揮發(fā)盡后，再進行下一次展開。l噴以顯色劑（吲哚醌1g，溶于100mL無水乙醇和10mL冰醋酸中）置100干燥510min至顯色完全為止。l本層析系統(tǒng)中，由于分離的程度與各種氨基酸顯出不同的顏色，可以區(qū)別十一

6、種氨基酸。l用茚三酮-硝酸鈉試劑亦能顯出不同顏色的色斑，且靈敏度較高。4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每種氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作為氨基酸藥物的鑒別指標。二、氨基酸特殊雜質及安全性檢查1、特殊雜質檢查l氨基酸原料藥所含有的特殊雜質一般為一些其他種類的氨基酸。l用薄層色譜法進行限量檢查：將樣品配成一定濃度的供試品液，取一定量供試品液稀釋后作為對照液，在同一硅膠G薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸（311）展開晾干后，噴茚三酮的丙酮溶液顯色，規(guī)定供試品所顯雜質斑點的顏色不得深于對照液主斑點，以此限制其他氨基酸的含量。2、安全性檢查l影響氨基酸安全用藥的因素除其中的一

7、般雜質，主要為熱原的含量。l中國藥典所收載的氨基酸基本上都規(guī)定了熱原檢查。l采用家兔法，將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規(guī)定時間內觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。三、氨基酸含量測定1、茚三酮法l茚三酮法是氨基酸定量測定應用最廣泛的方法之一。l當茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應時，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮則成還原型水合茚三酮。然后還原型茚三酮與氨，另一分子茚三酮進一步縮合生成藍紫色物，最大吸收值的波長為570nm。 茚三酮反應為一切茚三酮反應為一切-氨基酸所共有，反應靈敏，根氨基酸所共有，反應靈敏，根據反應所生成的藍紫色深淺，可

8、以測定氨基酸含量。據反應所生成的藍紫色深淺，可以測定氨基酸含量。 本法可允許的測定范圍是本法可允許的測定范圍是50g50g氨基酸。氨基酸。2、酸堿滴定法l谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸l賴氨酸（lysine）片中賴氨酸的測定l取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于賴氨酸）置燒杯中，加水25mL，滴加氫氧化鈉滴定液（），用酸度計調節(jié)至pH值為，加入預先調節(jié)至pH值的甲醛溶液15mL，攪勻，再用氫氧化鈉滴定液（）滴定至pH值為，并持續(xù)30s。l按加入甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液（）體積計算，每毫升氫氧化鈉滴定液（）相當于的C6H14N2O2HCl。3、非水溶液滴定法l中國藥典、美國藥典和英

9、國藥典對所收載氨基酸類藥物，除谷氨酸用氫氧化鈉為標準溶液的酸堿滴定法，其余均根據其結構特性，采用了非水酸堿滴定法。l用冰醋酸作溶劑，高氯酸作標準溶液滴定，電位法或指示劑法確定終點。l適用于常量氨基酸的含量測定。4、定氮法l精氨酸和天冬酰胺的原料及其制劑可以采用定氮法測定含量。l將被測藥物置于凱式燒瓶中，加濃硫酸、硫酸鹽及適量的催化劑，加熱進行有機物的破壞，其中所含的氮完全轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨與強堿反應，放出氨，將其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸堿滴定法滴定，從而計算出氮的含量并換算成被測藥物的含量。l5、HPLCl對于各種復方氨基酸制劑中氨基酸的含量測定，目前較多地采用了高效液相

10、色譜法（HPLC）。l因大多數(shù)氨基酸沒有紫外吸收，不能用紫外檢測器測定。為改善被測物的檢測特性，提高檢測靈敏度，需進行化學衍生化。l衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。l柱后衍生法是將樣品經離子交換柱分離后進行衍生；柱前衍生法是將樣品制成適當?shù)难苌镌龠M行HPLC分離。l蛋白質和多肽因子是生物體內廣泛存在的生化物質，具多種生理功能，是一大類非常重要的生化藥物。l多肽因子類藥物指分子量不算太大的，在體內含量極微，但卻發(fā)揮極大生理作用的一類生物活性物質。l其中包括天然動物體內提取的藥物如干擾素、白細胞介素、胸腺肽、轉移因子等和通過現(xiàn)代基因工程技術生產的藥品如重組人干擾素、重組白細胞介素、重組乙肝疫

11、苗等。一、多肽因子類藥物的定性鑒別l基因重組多肽因子類藥物的鑒別主要采用SDS-PAGE法和免疫印跡法。1、SDS-PAGE法l用SDS-PAGE鑒別生物樣品必須是該品有極純的標準對照品，通過電泳結果的對比，確定所測樣品是否與標準品有相同的遷移率，從而鑒別該品。l缺點：必須有標準品；凝膠中多肽需保留生物活性，或能夠復性，或電泳前可將檢測配基與待測多肽共價交聯(lián)。2、蛋白質免疫印跡電泳法（轉移電泳、western blot）l原理：借助聚丙烯酰胺凝膠技術，將生物活性物質高效分離，分離后的樣品可以原位、定量驅動或吸印在另一種固相載體（通常用醋酸纖維素薄膜，簡稱NC膜）上，能保持原有的生物活性，可以進

12、行各種生物檢測、免疫識別、掃描、積分和保存。（1）基本操作 分3個部分：聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉移電泳（即將凝膠中的多肽條帶轉移到硝酸纖維素紙上）；檢測或鑒定薄膜上的多肽條帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳 先將待分離樣品進行凝膠電泳分離。l凝膠可用瓊脂糖凝膠，也可用聚丙烯酰胺凝膠，可以是均一的，也可用梯度凝膠，凝膠緩沖體系中可含有各種變性劑，如SDS、LDS、尿素等，可進行單向或雙向電泳，也可用等電聚焦電泳。轉移電泳 將濕醋酸纖維素（NC）薄膜緊貼凝膠，凝膠與薄膜之間不能有氣泡，否則在氣泡所在部位的條帶將不能轉移，在NC膜和凝膠的另一側放上兩層濕濾紙，也不能有氣泡，再在兩邊貼上海綿，最后用塑料網框架夾緊，

13、插入電泳槽，根據凝膠中樣品所帶電荷的性質，決定有NC膜的一邊是靠近正極還是靠近負極一側。l電泳條件取決于凝膠類型、轉移裝置和蛋白質本身性質等。一般采用低電壓和低電流（2mA/cm2以內）。l緩沖液中一般含有20的甲醇或乙醇，其作用主要是保持凝膠的幾何形狀。檢測或鑒定 NC膜借助非共價鍵吸附蛋白質，經轉移后蛋白質條帶就固定在NC膜上，完全保留凝膠中的蛋白譜，可直接用考馬斯亮藍、氨基黑10B等染色。l如果利用蛋白質生物活性，或用蛋白質生物探針來檢測，就要先用13的牛血清蛋白或血紅蛋白，或非離子去垢劑（吐溫-20）等處理NC紙，以封閉NC紙上未吸附蛋白質區(qū)域，使其不再能吸附蛋白質。l使用非離子去垢劑

14、比較經濟，但有可能把NC紙上的某些蛋白質洗掉，同時還要將NC紙反復洗滌以去除變性劑，二、多肽因子類藥物的檢查1、分子量檢查l常用還原型SDS-PAGE法檢查分子量，用量約1g。l也可采用凝膠過濾法，例如Sephadecx系列（G-75，-100）；waters 160，125，250；Backman TSK 2000SW，3000SW，4000SW。l凝膠過濾是測定完整蛋白質分子的分子量，而SDS-PAGE是測定蛋白質亞基的分子量，同時用這二種方法測定同一蛋白質的分子量，可以方便地判斷樣品蛋白質是否是寡聚蛋白質。2、等電點測定l等電點是蛋白質的物理化學常數(shù)，它表示蛋白質的帶電性質。l一般采用凝

15、膠等電聚焦電泳技術測定等電點。3、紫外吸收l不同的蛋白質分子都有其特定的紫外吸收，對于某種蛋白質或多肽來說，它的最大吸收波長是固定的。l紫外吸收光譜是檢查蛋白質的一個重要指標。4、純度l基因工程產品蛋白質純度是一項重要指標，但它也是一項相對的指標，需根據實際要求而定。l蛋白質純度一般是指是否含有其他雜蛋白，而不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子在內。l目前較常用的是HPLC法（包括凝膠過濾、各種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜等）、非還原SDS-PAGE凝膠電泳法、毛細管電泳法（CE）、等電聚焦電泳，l此外也應用一些化學方法，觀察末端是否均一。l至少應用兩種以上的方法，而且是兩種不同分離機理的

16、方法來判定蛋白質的純度才比較可靠。l常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻分辨為二個組分，反之亦然。l又如一種樣品用凝膠過濾法和SDS-PAGE電泳證明是純的，但這仍不充分，因為這兩者機理相同。三、蛋白質類藥物的鑒別和檢查1、蛋白質類藥物的鑒別l蛋白質類藥物可根據其各自的物理、化學性質、生理作用等采用不同的方法進行鑒別。（1）茚三酮反應 組成蛋白質的氨基酸都能與茚三酮反應生成紫色化合物，因此蛋白質也有此反應，這是蛋白質鑒別的最常用方法。（2）福林酚反應或雙縮脲反應 這兩種常用來測定蛋白質的含量，但有時也用于蛋白質的鑒別。（3）紫外吸收 由于組成蛋白質的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙

17、氨酸在紫外區(qū)的光吸收特性，因此可利用此種特性鑒別蛋白質。五、蛋白質含量測定和效價測定1、蛋白質含量測定l蛋白質的定量可用化學方法如凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、紫外光吸收法來測定；也可用染色法，如氨基黑、考馬斯亮藍測定；此外還可用熒光激發(fā)、氯胺T、放射性核素計數(shù)等靈敏度較高方法。l上述方法中凱氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最為常用，它們操作簡單、設備便宜。（1）凱氏定氮法 凱氏定氮法常用來測定有機物的含氮量。原理：A、含氮有機物的消化 當含氮有機物與硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳、水。l氮轉變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。l分解反應進行得很慢，可加入硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進反應，其中硫酸銅

18、為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高沸點。l過氧化氫也能加速反應。B、銨離子的生成 消化完了以后，在凱氏定氮瓶中加入強堿（氫氧化鈉溶液）消化液，使硫酸銨分解，放出氨。l用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。C、測定 用強酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止。l所用強酸的摩爾數(shù)即相當于被測樣品中氨的摩爾數(shù)。（2）紫外吸收法 280nm光吸收法 由于蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質在275280nm波長處有一個紫外吸收高峰，在一定范圍內，蛋白質溶液在280nm波長處的光吸收度值（A280）與其濃度成正比，因此可作定量測定。l該法測定范圍為。l該法簡單、靈敏、快速、不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定，因此在蛋白質和酶的生化制備中廣泛應用。280nm和260nm光吸收差法 若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在用來測定蛋白質濃度時，會有較大的干擾。l由于核酸在260nm波長處的光吸收比280nm波長處更強，因此可利用280nm和260nm的吸收差來計算蛋白質濃度。l常用下列經驗公式估算：l蛋白質濃度（mg/mL）A280A260（假設1mg/mL