蛋白免疫印跡雜交

1、蛋白免疫印跡雜交（Western Blot）技術(shù)手冊·蛋白免疫印跡雜交（Western Blot）技術(shù)手冊 蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質(zhì)分析最流行和成熟的技術(shù)之一。本指南討論Western Blot操作方法及常見問題分析，有助于成功完成WB。    A 蛋白樣本提取制備      1 細(xì)胞或組織裂解  

2、60;   2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑      3 蛋白定量      4 電泳上樣樣品的準(zhǔn)備B  電泳   1 PAGE膠的制備  2 蛋白分子量Marker  3 陽性對照  4 內(nèi)參對照  5 上樣與電泳C  轉(zhuǎn)膜與顯色（Western Blot）  1 膠中蛋白的檢測  2 蛋白轉(zhuǎn)膜  3 膜上蛋白的檢測：麗春紅  4 膜的封閉  5 一抗

3、的孵育  6 二抗的孵育7 顯色 D 常見問題分析與解決方案 附錄1  WB實驗試劑配制方法附錄2  SDS-PAGE膠的配制                        WB概述:  檢測原理:  A 蛋白樣本提取制備  蛋白樣品制備是Western Blottin

4、g的第一步，更是決定WB成敗的關(guān)鍵步驟，  總體原則和注意事項：  1：盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品） 2：保持蛋白的處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的PH 鹽濃度 表面活性劑、還原劑等的選擇）3：提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）4：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）5：樣品分裝，長期于-80中保存，避免反復(fù)凍融。 A-1 細(xì)胞或組織裂解      

5、  A-1-1 細(xì)胞裂解        裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提試劑盒的選擇*目的蛋白分布定位推薦裂解液Lysis buffe推薦試劑盒全細(xì)胞NP-40 or RIPA（附錄1）全蛋白抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（可溶蛋白）Tris-HCl（附錄1）胞漿蛋白和核蛋白抽提試劑盒線粒體蛋白提取試劑盒細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附錄1）蛋白分級抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提試劑盒細(xì)胞膜NP-40 or RIPA（附錄1）膜蛋白抽提試劑盒蛋白分級抽提試劑盒細(xì)胞核R

6、IPA（附錄1）核蛋白抽提試劑盒線粒體RIPA（附錄1）線粒體蛋白抽提試劑盒亞細(xì)胞定位蛋白抽提試劑盒細(xì)胞裂解操作方法：1  培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑（種類與量見本節(jié)2）2  吸凈PBS，加入預(yù)冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask).3  用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中，4     

7、60;   4搖動30 min5         4離心12,000 rpm，20 min（根椐細(xì)胞種類不同調(diào)整離心力）6  輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀. A-1-2 組織裂解  1  用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解，   2  將組織塊放在圓底的微量離心管或Eppendorf管中，加入液氮凍結(jié)組織于冰上均質(zhì)研磨，長期可保存于-80°C，3 &#

8、160;每約5 mg加入約300 l 預(yù)冷的裂解液lysis buffer，冰浴勻漿后置于4搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例，（最終的蛋白濃度至少達(dá)到0.1 mg/ml, 理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5 mg/ml).4  4離心12,000 rpm，20 min，輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀, A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑 推薦購商品化蛋白酶和磷酸酶抑制劑復(fù)合試劑盒或COOKTAIL，或按下表配制： 備注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：   所有步聚均

9、需在通風(fēng)櫥中進行：1. 用雙蒸水配制100 mM 正礬酸鈉溶液.2. 用鹽酸HCl 調(diào)至pH 9.0 3. 煮沸至溶液無色,盡量減少水分揮發(fā).4. 冷卻至室溫5. 再調(diào)pH 至 9.06. 再煮沸至無色7. 重復(fù)上述過程,直至溶液煮沸冷卻后達(dá)pH 9.0 8. 用水定容至原體積9. 分裝保存于- 20°C. 溶液變黃則棄之不用. A-3  蛋白定量Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （均有商品化試劑盒可選擇，操作簡單、需分光光度計或酶標(biāo)儀），小牛血清白蛋白 (BSA) 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果裂解液中有NP40或其它表面活性劑，則推薦使用BCA 法。三種方

10、法或產(chǎn)品比較列表如下：方法原理靈敏性干擾因素應(yīng)用Lowry法Folin酚試劑法蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，還原酚磷鉬酸產(chǎn)生藍(lán)色化合物，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系較高約5g/ml對可達(dá)1-1500g/ml  適用于脂類含量較高的樣品測定，也能耐受相當(dāng)濃度的去垢劑如SDS。受硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇干擾耗費時間長4060分鐘；操作要嚴(yán)格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化; 標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性差Bradford法考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色，在波長595nm吸收峰，在一定的范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系高約15g/

11、ml,微孔法測定范圍為1-25g/ml 試管法測定范圍為100-1500g/ml 易受強堿性緩沖液，TritonX-100，SDS等去污劑的影響快速515分鐘，顏色穩(wěn)定；深淺隨不同蛋白質(zhì)變化; 標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性BCA法BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成 Cu1+ ，BCA（Bicinchoninic 酸）螯合Cu1+     作為顯色劑，產(chǎn)生蘭紫色并在562 nm有吸收峰單價Cu1+與蛋白呈劑量相關(guān)性，很高0.5-20g/ml 試管法可測范圍 202,000 g/ml  微孔法為 0.510g/ml不易受一般濃度去污

12、劑的干擾可受螯合劑；略高濃度的還原劑的影響較快40分鐘內(nèi)，較好的方法；抗干擾能力強BCA測定方法如下:A  酶標(biāo)板操作1.        標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑孔號01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（L）01248121620去離子水（L）2019181612840對應(yīng)蛋白含量（g）00.51.02.04.06.08.010.02.        根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA

13、工作液，充分混勻；3.        各孔加入200L BCA工作液；4.        把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37放置30分鐘，然后在562nm下比色測定。以蛋白含量（g）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；5.        稀釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20L，加入BCA工作液200L，充分混勻，37放置30分鐘后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比，在562n

14、m波長下比色，記錄吸光值；6.        根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（g），除以樣品稀釋液總體積（20L），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度（單位：g/L）。B  分光光度計測定1.          標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：各管按照下表加入試劑孔號01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（L）051020406080100去離子水（L）1009590806040200對應(yīng)蛋白含量（g）02.55.010.020

15、.030.040.050.02.          根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻；3.          各管加入1000L BCA工作液；4.          各管充分混勻，37放置30分鐘，然后在562nm下比色測定。以蛋白含量（g）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱

16、坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；5.          稀釋待測樣品至合適濃度，樣品稀釋液總體積為100L，加入BCA工作液1000L，充分混勻，37放置30分鐘后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比，在562nm波長下比色，記錄吸光值；6.          根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（g），除以樣品稀釋液總體積（100L），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度（單位：g/L）。A-4 電泳上樣樣品的準(zhǔn)備

17、0;A-4-1 變性、還原蛋白樣本   一般的抗體只能識別抗原蛋白中的部份序列結(jié)構(gòu)（表位），因此，為使抗體能夠達(dá)到結(jié)合該表位而需要將蛋白樣本進行變性，使之打開折疊的空間結(jié)構(gòu)，   蛋白變性一般使用含陽離子變性去污劑如SDS的上樣buffer （loading buffer），并于95-100°C 煮沸 5分鐘，對于多次跨膜蛋白，可以于70°C 加熱 5-10分鐘，標(biāo)準(zhǔn)的上樣buffer稱為2X Laemmli buffer，上樣時與樣本?。海』旌虾笞冃陨蠘蛹纯桑?X Laemmli buffer4% SDS10% 2-mercapto

18、ehtanol20% glycerol0.004% bromophenol blue0.125 M Tris HClCheck the pH and bring it to pH 6.8.SDS的陰離子環(huán)繞蛋白肽鍵使之帶負(fù)電荷，蛋白分子量不同，結(jié)合的SDS數(shù)量不同，所帶負(fù)電荷也不同，電泳遷移速度不同，因此SDS-PAGE電泳可將不同分子量的蛋白分離開。 A-4-2天然和非還原樣本  某些抗體識別的表位是非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的蛋白三維結(jié)構(gòu)，此種情況則需要進行非變性的WB，抗體的說明書一般會標(biāo)注，這種非變性電泳不加SDS，樣本也不需煮沸。某些抗體僅識別蛋白的非還原態(tài)，如某些cyst

19、eine基的氧化態(tài)，因此loading buffer和電泳液中不加入ß-mercaptoethanol and DTT蛋白狀態(tài)凝膠狀態(tài)loading buffer電泳緩沖液還原變性還原和變性有 ß-mercaptoethanol 或DTT 和SDS有SDS還原天然還原和非變性有ß-mercaptoethanol 或DTT ，無SDS無SDS氧化-變性非還原和變性無ß-mercaptoethanol 或DTT ，有SDS有SDS氧化-還原非還原和天然無ß-mercaptoethanol 或DTT ，無SDS無SDS注：除說明書特別標(biāo)注之外，一般情

20、況下，均使用變性和還原電泳       B  電泳B-1 PAGE膠的制備聚丙酰胺凝膠PAGE電泳根椐蛋白分子量進行分離蛋白，PAGE膠是由兩種化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis).，聚合需加入過硫酸銨及DMAP 或 TEMED，凝膠為中性、水溶性、三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的孔徑取決于總丙烯酰胺的百分含量（%T)）和交聯(lián)度（%C），T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%,其中: a=雙體(bis)的重量 ;b=單體(arc)的重量 ;m=溶液的體積(ml)

21、 。丙烯酰胺總量增加，則孔徑減小，5%C構(gòu)成最小的孔徑，任何的 %C增加或降低，孔徑都增加，凝膠的百分濃度組成需兩個參數(shù)，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis).的總量百分濃度（w/v）。不同分子量的蛋白選擇不同的凝膠濃度（參考下表，原則上高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。蛋白分子量 (kDa)凝膠濃度 (%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008不同濃度的凝膠的配制方法見附錄2  首先配制各組分貯備液，然后分別配制濃縮膠和分離膠。 B-2 蛋白分子量Marker預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白，用于標(biāo)示電泳中

22、蛋白的大小和示蹤 商業(yè)化產(chǎn)品：非預(yù)染Marker  (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)預(yù)染Marke r   (MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa) B- 3 陽性對照目的蛋白或明確表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和效率。建議使用該對照。可查閱文獻(xiàn)或抗體說明書選擇購買或自提該對照樣本。B-4 內(nèi)參對照管家基因編碼的、很多組織和細(xì)胞中都穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，用于檢測整個W

23、B實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)對照。必須設(shè)立。    內(nèi)參Beta-actin 抗體  at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per lane   Lane 1 : HeLa nuclear  Lane 2 : HeLa whole cell lysate  Lane 3 : A431 cell lysate   Lane 4 : Jurkat cell lysate   Lane 5

24、: HEK293 cell lysate. B-5 上樣與電泳 每孔上樣量為20-40 g蛋白，使用專用槍頭或注射針頭，勿溢出加樣孔，標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液：1X Tris-glycine：25 mM Tris base190 mM glycine0.1% SDS調(diào) pH;8.3.電泳時間按電流儀說明書推薦方法使用,(1小時或過夜，取決于電壓大小），當(dāng)染料到達(dá)膠的底部，關(guān)電源停止電泳，膠不能存放，應(yīng)立刻進行下一步的轉(zhuǎn)膜。 C  轉(zhuǎn)膜與顯色（Western Blot）C-1 膠中蛋白的檢測   電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬

25、斯藍(lán)染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進行轉(zhuǎn)膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍(lán)法染色。銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入0.3 M CuCl2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶，膠置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中開始轉(zhuǎn)膜?？捡R斯藍(lán)法：用40%雙蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定膠中蛋白，考馬斯藍(lán)R-250染液（凱基產(chǎn)品）室溫染色4小時至過夜，保持搖勻，轉(zhuǎn)入67.5%雙蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l搖勻至脫去多余的染料，蛋白被染成深藍(lán)色。

26、60;C-2 蛋白轉(zhuǎn)膜蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，在電場下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制造商的說明書進行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿/紙/膠/膜/紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向確認(rèn)正確負(fù)極方為帶負(fù)電的膠里的蛋白，向正極方（膜）電遷移。標(biāo)準(zhǔn)的電轉(zhuǎn)緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS使之終濃度為0。1%。半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：/紙/膠/膜/紙，用電轉(zhuǎn)緩

27、沖液浸濕后，直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。膠于負(fù)極而膜置于正極。半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液可不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和PVDF膜（正電荷尼龍膜），根據(jù)不同需要選擇（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分鐘，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3-5分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時會導(dǎo)致條帶變形。  注：大蛋白和小蛋白的轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會影響轉(zhuǎn)膜效果，如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率：大蛋白（大于100 KD） &

28、#160; 1對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8%或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心，  2  大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便SDS從蛋白上脫失，因此應(yīng)降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。  3  降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的比例以促進凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉(zhuǎn)出。  4 如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移

29、緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜前PVDF需用甲醇活化。  5 選擇濕式，4轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。 小蛋白（小于100 KD   1 SDS妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS。   2  保持20%的甲醇濃度對于大于500KD的蛋白，請參考下述文獻(xiàn)：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfatepolyacryla

30、mide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185192 (1997).  更多的轉(zhuǎn)膜注意事項：Ø         避免用直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑Ø         排列三明治時，盡量用移液器或15ml試管趕除膠與膜之間的氣泡，或?qū)⑷髦畏旁谘b有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產(chǎn)生，請戴手套！&

31、#216;         確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否剛導(dǎo)致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜無效Ø         雞抗體易于與PVDF膜和其它尼龍膜結(jié)合，導(dǎo)致高背景，請?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。 C-3 膜上蛋白的檢測：麗春紅為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色，2%的麗春紅貯備液(20ML)：: 2%麗春紅(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水楊酸(6克)麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：

32、10稀釋，即加9 倍的ddH2O   染色方法：將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再進行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。10x TBS的配制24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl加約 800 ml 超純水用純HCl調(diào)pH 至7.6 定容至 1 L.TBST的配制配制 1 L TBST：: 量取100 ml  10x TBS + 900超純水 + 1ml Tween20Tween20非常粘稠，用槍頭不

33、易吸取，請確定加入準(zhǔn)確的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。 C-4 膜的封閉為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進行膜的封閉，傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。某些抗體用BSA封閉時因不明原因可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強的信號，請仔細(xì)閱讀說明書注明的注意事項和膜的特殊的封閉方法。配制5%脫脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或 BSA，混勻后過濾，如不過濾會

34、導(dǎo)致使膜污染上細(xì)微黑顆粒。封閉時，4°C搖動，封閉1 hour ，再用TBST洗5秒，進入下一步抗體的孵育。 C-5 一抗的孵育孵育Buffer：按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗，如果說明書沒有建議的稀釋倍數(shù)，則參照一般推薦的稀釋倍數(shù)(1:100-1:3000)，一抗?jié)舛冗^高會導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶。某些實驗室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體，結(jié)果因抗體而異，有時兩者結(jié)果相同，有時結(jié)果不同。注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 0.25%) 脫脂奶粉或 BSA的封閉液來,稀釋，可產(chǎn)生相對更強的信號條帶。孵育

35、時間：一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過18小時）不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)和較長的孵育時間來保證特異性結(jié)合。孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應(yīng)在4oC進行否則會產(chǎn)生污染而破壞蛋白（降別是磷酸基團）。孵育一抗時需保持適當(dāng)?shù)膿u動使之均勻覆沒膜，防止結(jié)合不均勻。 C-6 二抗的孵育    一抗孵育結(jié)束后，用TBST搖動洗膜數(shù)次，每次5min或更長，去除殘留的一抗。孵育Buffer和稀釋倍數(shù)：用TBST按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗，如果說明書沒有標(biāo)出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋(1:1

36、000- 1:20,000)預(yù)試，二抗的濃度過高也會導(dǎo)致非特異性條帶。亦可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同時導(dǎo)致特異性條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結(jié)合。孵育時間和溫度：室溫、1-2 hours, 搖動二抗連接物：推薦使用二抗連接HRP，不建議連接AP堿性磷酸酶，因其不夠靈敏。 C-7顯色顯色分為酶促底物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光法或熒光法酶促底物發(fā)光法代表為DAB顯色法，與其它同類方法的比較如下圖所示：而現(xiàn)在最常用的是化學(xué)發(fā)光法：HRP化學(xué)發(fā)光底物 Luminol（ECL法 chemiluminescence）及其改良法，對于 HRP偶聯(lián)的二抗，一般傳統(tǒng)上

37、使用ECL 和ECL+，推薦使用后者，更靈敏。其中不同商家的產(chǎn)品特點總結(jié)如下表： SuperSignal® West Pico化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal® West Femto超靈敏型底物SuperSignal® West Femto增強型底物主要優(yōu)點與ECL 系統(tǒng)相比減半的價格、雙倍的信號適用于HRP檢測的最靈敏的化學(xué)發(fā)光底物延長的信號持續(xù)時間使這種底物用于今天的成像設(shè)備最為理想檢測下限10-12g10-15g 10-14g信號持續(xù)時間6-8小時8小時24小時首選檢測方法X膠片成像設(shè)備或X膠片成像設(shè)備或X膠片建議一抗稀釋度1:1000-1:50

38、001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建議二抗稀釋度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000產(chǎn)品保存期室溫1年41年或室溫6個月室溫1年建議印跡膜硝化纖維硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDFX-ray 膠片：傳統(tǒng)上使用手工曝光的方法，可控制X-ray 膠片在曝光和在定影劑的時間調(diào)節(jié)。而全自動X-ray 膠片曝光器也廣泛使用并操作簡便。注意不能過度曝光，特別不適于檢測相對蛋白量，過度曝光導(dǎo)致全暗的背景沒有反差和/或產(chǎn)生大量的非特異性條帶。數(shù)字圖像顯影：新一代的膠片顯色方法是使用數(shù)碼相機在暗室中拍攝

39、膜上的化學(xué)發(fā)光，將其轉(zhuǎn)成數(shù)字信號，再通過儀器自帶的軟件進行分析。 有些新一代商品化的數(shù)字成像儀器已不再檢測HRP連接的抗體（如：ECL chemiluminescence），如STORM分析儀只檢測熒光標(biāo)記的抗體。D 常見問題分析與解決方案問題可能原因驗證或解決辦法背景高封閉不充分延長封閉時間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）一抗?jié)舛冗^高增加一抗稀釋倍數(shù),抗體孵育溫度過高4孵育二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛纫豢够蚨古c封閉劑有交叉反應(yīng)在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng).洗膜不充分增加洗滌次數(shù)膜不合適NC膜比PVDF膜背景低膜

40、干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象沒有陽性條帶或很弱一抗、二抗等不匹配訂購試劑時認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^設(shè)置內(nèi)參可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度，延長孵育時間封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠一抗不識別目的物種的靶蛋白檢查說明書，或做ClustalW比對，設(shè)陽性對照樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過低（抗原無效）設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20

41、-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目的蛋白。轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過度使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過度洗膜過度封閉使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間一抗失效使用有效期內(nèi)抗體,分裝保存,避免反復(fù)凍融取用, 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用二抗受疊氮鈉抑制所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)酶和底物失效直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物.曝光時間過短延長曝光時間多非特異性條帶或條帶位置不對細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)模式的分化使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或

42、平行實驗體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙?；⒘姿峄?、甲基化、烷基化、糖基化等查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小蛋白樣本降解使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑新蛋白或同族蛋白的分享同種表位的不同剪接方式查其它文獻(xiàn)報導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說明書報導(dǎo)的細(xì)胞株或組織一抗?jié)舛冗^高降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合降低抗體濃度，增加二抗對照  選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗抗體未純化使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶蛋白存在二聚體或多聚體SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min，以增強蛋白質(zhì)解聚變性背景有白色/黑色斑點轉(zhuǎn)膜時有

43、氣泡或抗體分布不均盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動抗體與封閉劑結(jié)合過濾封閉劑暗片現(xiàn)白條帶一抗或二抗加入過多稀釋抗體的濃度目的條帶過低/過高SDS-PAGE膠濃度選擇不合適調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠 “微笑”條帶遷移過快電泳溫度過高降低電泳速度，低溫電泳（冷室）轉(zhuǎn)膜不充分膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜靶蛋白分子量小于10,000選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過高過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，

44、從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間  Optimization of secondary antibody dilution for immunodetection of ERK 1 with Immobilon Western Chemilumin-escent HRP Substrate. Two-fold dilutions of rat liver lysate samples were applied to each ge

45、l. Electroblotted proteins were probed with rabbit anti-ERK 1 antibody (1:1,000 dilution) and HRPconjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000, 1:20,000 and 1:100,000dilutions, left to right).                 附錄1  W

46、B實驗試劑配方1  Nonidet-P40 (NP40) buffer                                150 mM sodium chloride1.0% NP-40 (或Triton X-100 )50 mM Tris, pH 8.0 2  RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer)150 mM sodium chloride1.0% NP-40 or Triton X-1000.5% sodium deoxycholate0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)50 mM T