醫(yī)學微生物學實驗指導

1、WORD格式醫(yī)學微生物學實驗指導專業(yè)資料整理WORD格式*交通大學醫(yī)學院微生物學教研室專業(yè)資料整理WORD格式1專業(yè)資料整理WORD格式第一次實驗課內(nèi)容實驗內(nèi)容 1.實驗目的與要求實驗內(nèi)容 2.實驗室規(guī)那么實驗內(nèi)容 3.細菌形態(tài)學觀察技術(shù)實驗內(nèi)容 4.染色標本的制備革藍染色實驗目的與要求醫(yī)學微生物學實驗課是該專業(yè)課程的重要組成局部， 指導學生上好實驗課是教學過程中的重要環(huán)節(jié)，學習實驗課的目的是：1. 使學生加深理解并穩(wěn)固理論知識，學習和掌握有關(guān)的實驗操作技術(shù)，為以后的醫(yī)學專業(yè)課學習打好根底：2. 在實驗中，培養(yǎng)學生觀察、思考和分析問題的能力，主動參與實驗的動手能力及獨立工作的能力。 訓練學生嚴

2、格的科學作風、 嚴肅白的科學態(tài)度和嚴密的工作方法。3. 培養(yǎng)學生在集體工作環(huán)境中互幫互讓，團結(jié)協(xié)作，共同完成好實驗的精神品德。為了到達上述目的，提高實驗課的教學效果，特提出以下要求：1. 實驗課前做好預習， 明確本次實驗課的內(nèi)容及其原理、 方法及本卷須知；2. 實驗中要仔細認真，注意分工與協(xié)作，操作實驗要按操作步驟進展。學會正確操作手法、準確記錄實驗結(jié)果。 示教實驗要注意觀察， 并記錄好相關(guān)內(nèi)容；3. 詳細討論實驗結(jié)果，提倡同學之間互幫互學，并嚴密聯(lián)系理論課內(nèi)容。要注意不管實驗結(jié)果與理論符合與否， 都有討論的價值， 并分析其原因， 有可能的話還應(yīng)重復實驗；4. 嚴格遵守實驗室規(guī)那么，在微生物學

3、實驗課上，要樹立“有菌觀點，嚴格掌握和不斷完善無菌操作技術(shù)。專業(yè)資料整理WORD格式2專業(yè)資料整理WORD格式實驗室規(guī)那么一、進入實驗室須穿工作服、 戴工作帽。除必要的書籍文具外， 其它個人物品一律不得帶入實驗室。二、在實驗室內(nèi)， 制止飲食、吸煙及與學習無關(guān)的其它活動， 不得大聲喧嘩或嘻戲。三、未經(jīng)教師許可， 不得擅自搬動實驗器材及示教物品， 不準隨意擺弄和旋轉(zhuǎn)實驗儀器上的開關(guān)及旋扭等。四、按照實驗要求， 在教師的指導下， 主動安排要進展的實驗， 認真進展實驗操作，嚴格遵守無菌操作規(guī)程，爭取順利地完成實驗。五、實驗中使用完畢的器材和試劑， 必須放回規(guī)定的位置。 廢棄物必須按規(guī)定進展處理或歸放于

4、指定的容器內(nèi)，不能隨便亂丟亂放。六、實驗中萬一有菌液打翻、 有菌材料污染桌面或衣物、 割破手指等意外情況，應(yīng)及時報告教師進展處理，切勿自作主X不按規(guī)定處理。七、保護實驗室內(nèi)一切設(shè)備、 掛圖、儀器。注意節(jié)約使用消耗材料及藥品試劑，注意用電平安及節(jié)約水電。八、實驗完畢， 要清理桌面， 將實驗器材放回原處。 值日同學要搞好實驗室的清潔衛(wèi)生， 保持室內(nèi)整齊， 離開實驗室前要關(guān)好門窗、 水、電，并將手洗干凈。九、未經(jīng)許可，不得將實驗室內(nèi)任何物品帶出實驗室。專業(yè)資料整理WORD格式3專業(yè)資料整理WORD格式實驗一細菌形態(tài)學觀察技術(shù)將細菌培養(yǎng)物或含菌標本材料制備的染色標本片，置顯微鏡油鏡頭下，可以觀察到細菌

5、的形狀、 大小、構(gòu)造、排列及染色特性等， 了解這些特征有助于鑒別各種細菌。一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護【使用原理】用油鏡觀察標本、 是在使用高倍鏡的根底上， 采用同玻璃折光率相似的油狀物如香柏油、液體石臘等，滴加在標本與油鏡頭中間， 以防止光線散射，提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察物象更加清楚明了?！静僮鞣椒ā?. 調(diào)試：翻開電源，先采用低倍鏡，使視野到達清晰光亮。2. 加油：雙手向上轉(zhuǎn)動粗螺旋，使鏡筒上升，將標本片固定于載物臺上，使染色面對準集光器央，加鏡油于標本面，調(diào)換油鏡頭對準標本面。3. 調(diào)焦點：用左手向下輕轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒下降，同時眼睛從右側(cè)觀察下降程度， 待鏡頭入油后接觸上玻片

6、， 用眼觀目鏡， 反轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒慢慢上升，待看到模糊物象時， 改用細螺旋上下調(diào)節(jié)， 使物像到達完全清晰為宜 一般轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)前后半圈。4. 觀察：觀察時只使用細調(diào)。需改換視野時，右手操縱推進器，左手轉(zhuǎn)動細螺旋，做到配合自如。并養(yǎng)成左眼觀察，右眼繪圖的習慣?！居顽R頭的保護】油鏡頭使用完結(jié)后， 必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈 二甲苯用量宜少，以免鏡片間粘膠溶解。下降集光器，半接物鏡轉(zhuǎn)成“八字，再下降鏡筒，輕觸鏡臺外表，雙手平持顯微放入鏡箱， 防止直射日光，置于枯燥處，以防受潮?！颈揪眄氈?. 使用直筒顯微鏡觀察標本時，必須兩眼同時睜開，訓練使用左眼觀察，右眼繪圖。如用油鏡頭觀察，勿將鏡

7、身歪斜，防止鏡油流出片面。2. 觀察染色標本時，光線宜強，可上升集光器，開大光圈。觀察不染專業(yè)資料整理WORD格式4專業(yè)資料整理WORD格式色標本時，光源宜弱，可下降集光器，縮小光圈。3. 使用完畢，一定擦去鏡油。二、細菌不染色標本不染色的細菌和標本鏡檢， 雖可觀察細菌在自然生活狀態(tài)下的大小、 形態(tài)、活動等，但主要用于觀察細菌的動力。一懸滴法【材料】1. 細菌：枯草桿菌 812小時肉湯培養(yǎng)物。2. 凹玻片，蓋玻片，凡士林等?！痉椒ā?. 取凹玻片一X，于凹窩周圍涂少許凡士林見圖 1。圖1 懸滴法2. 用接種環(huán)沾取枯草桿菌 812小時培養(yǎng)物，置于蓋玻片中央。3. 反轉(zhuǎn)凹玻片，使凹窩對準蓋玻片中央

8、，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉(zhuǎn)玻片，使蓋破片面向上。4. 標本片置于顯微鏡載物臺上，先用弱光線，低倍鏡找物象，再改換高倍鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。5. 觀察：細菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現(xiàn)真運動，如在明亮的海洋中，深入淺出游來動去。二壓滴法用途同懸滴法。【材料】1. 細菌：枯草桿菌 812小時肉湯培養(yǎng)物。專業(yè)資料整理WORD格式5專業(yè)資料整理WORD格式2. 載物玻片：蓋玻片等?！痉椒ā?. 取無油污物玻片 1X。2. 用接種環(huán)沾取枯草桿菌 812小時肉湯培養(yǎng)物置于載物玻片中央。3. 加蓋玻片于菌液外表，觀察方法同懸滴法。三、細菌染色標本片的制備操作由于細菌個體微小， 根本上無色透明，

9、故將其用適當染料染色觀察， 方能顯示它的形態(tài)、大小、構(gòu)造及染色特性等，在細菌和鑒別上有重要意義?！静牧稀?. 葡萄球菌 大腸桿菌 1824小時普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 革蘭染色液。3. 生理鹽水，載物玻片，接種環(huán)等。【方法】一細菌涂片的制作1. 涂片：取清潔無油污載物玻片一X，接種環(huán)沾取生理鹽水 12環(huán)置于玻片中央，再將接種環(huán)火焰滅菌待冷后， 沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許， 混于生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。2. 枯燥：室溫自然枯燥，也可將涂面向上，遠離火焰上方微加溫枯燥切勿加熱過度，以防將標本燒枯。3. 固定：標本枯燥后，通過酒精燈火焰三次約 23秒鐘，以殺死細菌并使之固定于玻片上。4.

10、染色：可根據(jù)不同的染色要求，用相應(yīng)染色液進展染色。二革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。1. 初染：于涂抹面上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，覆蓋整個涂面，室溫作用一分鐘。用自來水輕輕沖洗，甩干水分。2. 媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來水沖洗，甩干水分。3. 脫色：將載物玻片浸于 95%酒精缸中，上下提取，邊提邊看，見涂面無色素下流為止約 30秒鐘。自來水沖洗，甩干水分。4. 復染：加稀釋復紅染液染 30秒鐘，自來水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。5. 加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調(diào)強光視野觀察，呈紫色的為革專業(yè)資料整理WORD格式6專業(yè)資料整理WORD格式蘭陽性菌，呈紅色的

11、為革蘭陰性菌。三美蘭染色法【方法】將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染 12分鐘，水洗、待干、鏡檢?！窘Y(jié)果】此法為單染色法， 菌體和細胞均染成藍色。 常用于腦膜炎球菌及白喉桿菌等細菌染色。四、細菌根本形態(tài)和特殊構(gòu)造觀察一根本形態(tài)示教1. 球形：葡萄球菌革蘭染色標本片菌體正園形，染成蘭紫色，呈現(xiàn)葡萄串狀排列。 G+球菌。2. 桿形：大腸桿菌革蘭染色標本片菌體短桿狀，染成紅色，呈分散排列。 G-桿菌。3. 螺形：霍亂弧菌革蘭染色標本片菌體弧形， 染成紅色，呈分散排列。G-弧菌。二特殊構(gòu)造示教1. 鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個或成堆存在，周圍可見到波浪狀彎曲、較長、呈蘭灰色

12、的鞭毛。2莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片視野背景為紅色，其中可見到染色呈深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列， 菌體周圍有未染上顏色的空白區(qū)， 即莢膜。3. 芽胞：破傷風梭菌芽胞染色片菌體為細長桿狀，頂端有染成紅色、并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀，其他散亂分布的紅色球體，為菌體脫落的成熟芽胞。"附錄"革蘭 Gram染液的配制1. 結(jié)晶紫染液將 1份結(jié)晶紫酒精飽和液與 4份1%草酸銨水溶液混合即成 14克結(jié)晶紫加95%酒精 100毫升即為酒精飽和溶液。2. 魯戈 Lugol 碘液碘 1克碘化鉀 2克蒸餾水 300毫升專業(yè)資料整理WORD格式7專業(yè)資料整理WORD格式3. 稀釋復

13、紅液1份鹼性復紅飽和液鹼性復紅 3.2克溶于 95%酒精 100毫升中。即為鹼性復紅飽和溶液加 9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復紅染液抗酸染色用，取 1份石炭酸復紅染液加 9份蒸餾水即為稀釋復紅染液。第二次實驗實驗內(nèi)容 1；細菌培養(yǎng)技術(shù)操作實驗內(nèi)容 2；細菌的生化反響檢測示教實驗內(nèi)容 3：播放錄象"細菌感染的檢查方法和防治原那么"實驗二細菌培養(yǎng)技術(shù)給細菌提供適宜的條件， 細菌即可以生長繁殖， 形成具有一定特征的培養(yǎng)物，學習細菌培養(yǎng)技術(shù)可以純化細菌， 了解細菌的生長特征， 并能進一步檢測細菌生化反響、 變異性，制備細菌抗原， 深入進展分子生物學工作等。了解細菌的培養(yǎng)特征也

14、有助于鑒別細菌。細菌培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基是用人工方法將適合細菌生長繁殖的各種營養(yǎng)物配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，以供細菌培養(yǎng)使用。一般培養(yǎng)基的主要成份為蛋白質(zhì)、糖類、鹽類、水分等。另外還有一些營養(yǎng)要求較高的細菌， 還必須參加血液或血清、 雞蛋、維生素等其他營養(yǎng)物質(zhì)。 有時為了鑒別或抑制某些細菌， 那么可參加各種專用基質(zhì) 如某種糖類、氨基酸等，指示劑，染料等。由于對培養(yǎng)基的使用目的不同，故在培養(yǎng)基的選擇上有所不同。 按其物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、 固體培養(yǎng)基、 半固體培養(yǎng)基。按其成分和用途可分為普通培養(yǎng)基， 鑒別培養(yǎng)基， 選擇培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基等。培養(yǎng)基需參加小試管、中試管、三角瓶、平皿等內(nèi)使用。培養(yǎng)基的種

15、類很多，但一般制備原那么有三條：1. 足夠和適當?shù)臓I養(yǎng)成份。 籍以滿足細菌生長繁殖的要求， 獲得典型細菌培養(yǎng)物，到達研究細菌的形態(tài)，生化反響，抗原構(gòu)造及致病力等方面的目的。2. 適宜的酸鹼度。 培養(yǎng)基的酸鹼度直接影響細菌的生長繁殖。 一般細菌最適宜 PH為7.27.6。測定的方法常用普通比色法或精細 PH試紙來測定見附錄。專業(yè)資料整理WORD格式8專業(yè)資料整理WORD格式3. 絕對無菌。培養(yǎng)基務(wù)必進展除菌處理，由于培養(yǎng)基所含成份不同，除菌的方法也不同。如普通培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法。一、常用培養(yǎng)基的制備一普通肉湯培養(yǎng)基【材料】1. 新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，蒸餾水。2. 酚紅指標

16、劑，比色架及標準比色管或精細 PH試紙。3. 漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等。【方法】1. 稱取去脂去腱絞碎的鮮牛肉 500克，浸于 1000毫升蒸餾水中， 冰箱過夜，次日煮沸 30分鐘，紗布過濾，蒸餾水補足其量，也可用牛肉膏 3克加蒸餾水 1000毫升加熱溶化，即為肉浸液。2. 取肉浸液 1000毫，氯化鈉 5克，蛋白胨 10克混合加熱溶化。3. 調(diào)整 PH為 7.6，用濾紙過濾分裝于中試管或三角燒瓶內(nèi)，塞緊棉塞。【用途】供根底培養(yǎng)基用，營養(yǎng)比肉膏湯好，一般營養(yǎng)要求不高的菌均可生長。二普通瓊脂培養(yǎng)基瓊脂是石花菜等海藻類提取的膠體物質(zhì)， 其化學成份主要是多糖。 當溫度到達 98以上可溶解于水，

17、45以下那么凝固。瓊脂對細菌一般無營養(yǎng)作用 除自然界中極少數(shù)菌可利用瓊脂之外，純屬賦形劑。便于人們制做斜面、平板、高層等不同類型的固體培養(yǎng)基。【材料與方法】普通肉湯培養(yǎng)基 100毫升，參加瓊脂 23克，加熱溶化，用蒸餾水補足失去水分，調(diào)整 PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣 15磅滅菌 20分鐘，可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板。【用途】供一般細菌培養(yǎng)用，并可作無糖基培養(yǎng)基。三半固體培養(yǎng)基【材料與方法】取普通肉湯培養(yǎng)基 100毫升，參加瓊脂 0.50.7克，加熱溶化。調(diào)整 PH為7.6，分裝于小試管內(nèi)，每管 15毫升，高壓蒸氣磅滅菌 20分鐘，待冷后放入 4冰箱專業(yè)資料整理WORD

18、格式9專業(yè)資料整理WORD格式備用?！居猛尽勘４嬉话憔N用，并可觀察細菌的動力及生化反響。四血液瓊脂培養(yǎng)基【材料與方法】將高壓滅菌后普通瓊脂培養(yǎng)基。冷至45 50時以無菌手續(xù)操作參加5%10%血液人或動物脫纖維無菌血液?？芍瞥裳桨搴脱泵??！居猛尽抗I養(yǎng)要求較高的細菌別離培養(yǎng)用，亦可觀察細菌的溶血特征。二、細菌接種技術(shù)及生長表現(xiàn)由于細菌感染而致病的各種標本及帶菌者所需檢查的各種標本， 往往并非單一的細菌， 而混有其它非致病菌 人體正常菌群 。因此當對此標本須作出細菌鑒定時，就必須從標本中別離出致病菌，稱為 細菌別離培養(yǎng)技術(shù) 。另外，對已得到可疑病菌進展細菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng)，稱為 純培養(yǎng)接

19、種技術(shù) 。一平板劃線接種法又稱別離培養(yǎng)法平板別離劃線的方法較多， 其中以分區(qū)劃線法與曲線劃線法較為常用。 其目的都要使細菌呈現(xiàn)單個菌落生長，便于同雜菌菌落鑒別?，F(xiàn)只介紹分區(qū)劃線法?！静牧稀?. 細菌：大腸桿菌、葡萄球菌 1824小時普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3. 酒精燈，接種環(huán)等?！痉椒ā?. 右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌或葡萄球菌培養(yǎng)物少許。2. 左手斜持瓊脂平板， 皿蓋留在桌上， 于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜約占平板總外表積的 1/10，劃線時接種環(huán)與平板外表成3040o角，輕輕接觸，以腕力在平板外表行輕快地滑移動作，接種環(huán)不應(yīng)

20、劃破培養(yǎng)基外表。3. 燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細菌，待冷是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，假設(shè)瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試，從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線 見圖 3，約占平板外表 1/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線以同樣方專業(yè)資料整理WORD格式10專業(yè)資料整理WORD格式法作第四次，第五次劃線，將平板外表劃完。4. 劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標簽或臘筆注明菌名檢驗，接種者班級，*，組別等，置 37孵育培養(yǎng) 24小時后觀察結(jié)果見圖 4。二純培養(yǎng)細菌接種法1. 斜面培養(yǎng)基接種法：用于培養(yǎng)，保存菌種及其它實驗用?！静牧稀?大腸桿菌，葡萄球菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2普通瓊脂斜面培

21、養(yǎng)基。3接種環(huán)，接種針，酒精燈等?！痉椒ā?取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管的棉塞。勿放置桌上，如棉塞太緊時應(yīng)預先松動。（ 2試管口部于火焰上往返通過 23次滅菌，將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管中，取少量細菌一般應(yīng)從斜面底部沾取，然后小心移至準備接種的試管中。（ 3接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線，假設(shè)以保存菌為目的時可自管底上劃一粗直線即可。（ 4取出接種環(huán)，將試管上部再經(jīng)火焰滅菌，塞好棉塞，接種環(huán)滅菌后放回原處。（ 5假設(shè)自平皿培養(yǎng)物中取菌時，只應(yīng)沾取一個單個菌落。（ 6接種菌應(yīng)作好標記，標明菌種名稱

22、，日期等，置 37溫箱中培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。2. 液體培養(yǎng)基接種法：用于增菌及鑒定細菌生長特點，如外表生長，沉淀生長，均勻混濁生長等。專業(yè)資料整理WORD格式11專業(yè)資料整理WORD格式【材料與方法】操作技術(shù)根本與上法一樣， 只是接種時應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體外表之管內(nèi)壁輕輕摩擦 勿用力振蕩 使細菌混入培養(yǎng)基內(nèi)， 置 37溫箱中培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。3. 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法用于保存菌種及間接觀察細菌之動力無動力之細菌僅沿穿刺線生長，清晰可見；有動力的細菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣，穿刺線甚至難以看出。用無菌操作技術(shù)， 滅菌穿刺針沾取細菌后， 垂直刺入半固體培養(yǎng)基中央直達近管底處，再沿原穿刺線抽出即

23、可，置37溫箱培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。實驗內(nèi)容 2； 實驗三細菌的生化反響檢測 示教不同細菌由于所含的酶系統(tǒng)不完全一樣， 因而對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及代謝產(chǎn)物亦不一致，據(jù)此，可用以鑒別細菌的種類。一、單糖發(fā)酵試驗【原理】單糖發(fā)酵是將葡萄糖， 乳糖或麥芽糖等分別參加蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為 0.751。并參加一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種細菌經(jīng) 37培養(yǎng) 1824小時，假設(shè)能分解糖產(chǎn)酸那么酚紅指示劑由紅變黃，假設(shè)能分解甲酸有 C02和 H2等氣體形成，小倒管內(nèi)那么聚集有氣泡； 不分解，那么指示劑不變色。【材料】1菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2培養(yǎng)基：葡萄

24、糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等?！痉椒ā?將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵管內(nèi)。2置 37孵箱培養(yǎng) 1824小時。3觀察結(jié)果：由于一些細菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中PH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“ +表示，如果同時產(chǎn)生氣體， 那么培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)， 此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣， 以“專業(yè)資料整理WORD格式12專業(yè)資料整理WORD格式表示，不分解，那么指示劑不變色，用“- 表示?！窘Y(jié)果】傷寒桿菌大腸桿菌葡萄糖+乳 糖-二、 V-P(Voges-Proskauer)試驗【原理】有些細菌如產(chǎn)氣桿菌， 分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸， 丙酮酸

25、脫羧， 生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰， 再與培養(yǎng)基內(nèi)胍基結(jié)合， 生成紅色化合物，V P試驗陽性?！静牧稀?菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3試劑： V-P試劑 40氫氧化鉀水溶液 (內(nèi)含 0.3肌酸 )和 6% -奈酚酒精溶液 。【方法】1. 分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白胨水中。2. 置37培養(yǎng) 48小時后，取出分別參加 KOH1ml 和-奈酚溶液 1ml ,搖勻，靜置試管架上 515分鐘。3. 觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性?！窘Y(jié)果】大腸桿菌： - ；產(chǎn)氣桿菌： +三、甲基紅 M 、R試驗【原理】

26、某些細菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、 乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基 PH值降至 4.5以下，參加甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反響；假設(shè)產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等， 那么培養(yǎng)基的酸堿度仍在 PH 6.2以上，參加甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反響?！静牧稀繉I(yè)資料整理WORD格式13專業(yè)資料整理WORD格式1. 菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3. 試劑：甲基紅試劑?！痉椒ā?. 分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。2. 置37培養(yǎng) 23天取出，分別滴加甲基紅試劑 23滴，混勻，觀

27、察結(jié)果。【結(jié)果】大腸桿菌： +，產(chǎn)氣桿菌： - 。四、枸櫞酸鹽利用試驗【原理】枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基， 其中枸櫞酸鈉為唯一碳源， 磷酸二氫銨為唯一氮源。一般細菌能利用磷酸二氫銨作為氮源， 但不一定能分解枸櫞酸鹽取得碳源。因此，根據(jù)可否利用枸櫞酸鹽來鑒別細菌， 如產(chǎn)氣桿菌可利用枸櫞鹽作為碳源，細菌生長繁殖，形成菌苔，分解枸櫞酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基PH上升到 7.0以上，由綠色變?yōu)樯钐m色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性；而大腸桿菌那么不能分解枸櫞酸鹽，得不到碳源， 不能生長，無菌苔形成， 培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化，為枸櫞酸鹽利用試驗陰性?！静牧稀?. 菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌 1824小時瓊脂斜

28、面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽斜面?！痉椒ā?. 分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基。2. 置37恒溫培養(yǎng) 24小時后觀察結(jié)果。【結(jié)果】產(chǎn)氣桿菌： +有菌苔生長，培養(yǎng)基變色大腸桿菌： - 無菌苔生長，培養(yǎng)基不變色五、靛基質(zhì) Indol 試驗【原理】某些細菌如大腸桿菌， 變形桿菌等具有色氨酸酶， 能分解蛋白胨水培養(yǎng)基中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)無色吲哚，再與歐立希試劑對二甲基氨基苯甲醛專業(yè)資料整理WORD格式14專業(yè)資料整理WORD格式反響，形成紅色化合物玫瑰吲哚，即為陽性反響?！静牧稀?. 菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。3.

29、試劑，歐立希 Ehrlich 試劑對二甲基氨基苯甲醛【方法】1. 分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養(yǎng)基中。2. 置37培養(yǎng) 23天后，每管沿管壁各加歐立希試劑 0.51ml于培養(yǎng)液面上，待 1-2分鐘后觀察結(jié)果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為吲哚試驗陽性，無紅色環(huán)即為陰性。【結(jié)果】大腸桿菌： + ；傷寒桿菌： - 。六、硫化氫 H 2S產(chǎn)生試驗【原理】某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸 如胱氨酸、 半胱氨酸，生成硫化氫。硫化氫遇到培養(yǎng)基中的鉛鹽醋酸鉛或鐵鹽硫酸亞鐵，那么形成黑褐色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。 培養(yǎng)基內(nèi)含有復原劑硫代硫酸鈉， 使形成的硫化氫不再氧化?！静牧稀?. 菌種：大腸桿

30、菌，傷塞桿菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。【方法】1. 分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛培養(yǎng)基內(nèi)。2. 置37培養(yǎng) 48-72小時 2-3天。3. 觀察結(jié)果：取出后對光觀察，假設(shè)沿穿刺線有黑褐色沉淀物，即表示該菌能產(chǎn)生硫化氫 H2S，否那么反之?！窘Y(jié)果】大腸桿菌： - 無黑色沉淀線生成傷寒桿菌： +有黑色沉淀線生成專業(yè)資料整理WORD格式15專業(yè)資料整理WORD格式七、尿素分解試驗【原理】某些細菌如變形桿菌， 具有尿素分解酶， 能分解尿素而產(chǎn)生氨， 氨溶于水變成氫氧化銨，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽性。【材料】1. 菌種：變形桿菌，傷寒桿

31、菌 18-24小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。【方法】1. 分別以斜面接種法將變形桿菌， 傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。2. 置37培養(yǎng) 18-24小時。3. 取出觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗陽性，假設(shè)不變色，即為尿素分解試驗陰性。【結(jié)果】變形桿菌： + ；傷寒桿菌： - 。八、氧化酶試驗【原理】某些細菌如奈瑟菌和綠膿桿菌， 具有氧化酶靛基酚氧化酶 ，能將氧化酶試劑鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺 氧化成紅色的醌類化合物， 即為氧化酶試驗陽性?！静牧稀?. 菌種：淋球菌或腦膜炎球菌， 白色葡萄球菌 18-24小時巧克力斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：巧克力平板。3.

32、 試劑： 0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺或鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸對氨基二甲苯胺水溶液?！痉椒ā?. 將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；2. 置37培養(yǎng) 24小時后取出；3. 滴加新鮮配制的 0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺水溶液于固體培養(yǎng)基上；4. 觀察結(jié)果：加試劑后，假設(shè)菌落出現(xiàn)紅色深紅色紫黑色變化均為陽性；反之陰性。專業(yè)資料整理WORD格式16專業(yè)資料整理WORD格式【結(jié)果】腦膜炎球菌和淋球菌： + ；白色葡萄球菌： - ?！颈揪眄氈?. 此項試驗應(yīng)防止含鐵物質(zhì)，因遇鐵會出現(xiàn)假陽性。2. 試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新鮮配制。冰箱保存使用不超過兩周。3. 假設(shè)要別離培養(yǎng)腦膜

33、炎球菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種。否那么細菌容易死亡。"附錄"1V-P試驗劑的配制甲液：-萘酚6g95%灑精100ml乙液： KOH40g肌酸 0.3g蒸餾水100ml2甲基紅試劑的配制甲基紅 0.04g95%酒精 60ml蒸餾水40ml先使甲基紅溶解于酒精中，再參加蒸餾水，混合，搖勻即成。3歐立希 Ehrlich 試劑的配制對位二甲基氨基苯甲醛4g95%酒精380ml濃硫酸或濃鹽酸 80ml三種成分混合即成，瓶口要嚴密，以免揮發(fā)。4蛋白胨水培養(yǎng)基的制備成分：蛋白胨 10g氯化鈉 5g蒸餾水 1000ml制法：1先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量

34、。2調(diào)節(jié) pH至7.6、用濾紙過濾。3分裝中試管，每管約 3-4ml，加塞滅菌后備用。用途：供吲哚試驗用5單糖發(fā)酵管的制備成分：蛋白胨水培養(yǎng)基100ml0.2%酚紅1ml所需糖葡萄糖或乳糖0.75-1g專業(yè)資料整理WORD格式17專業(yè)資料整理WORD格式制法：1將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約 2ml，加塞。2小倒管排氣，滅菌 8-10磅， 20-30分鐘，貯存?zhèn)溆?。用途：供單糖發(fā)酵試驗用。附注： 0.2%酚紅配制法酚紅 phenol red 0.2g1/10N苛性鈉 NaOH 8ml蒸餾水 92ml將酚紅入研缽徐徐參加苛性鈉研磨，再補足蒸餾水即成。假設(shè)需長時間保

35、存，可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物成分：蛋白胨 5g葡萄糖 5g制法：（ 1將上述成分溶解于蒸餾水中。（ 2調(diào)節(jié) pH至7.6，用濾紙過濾除渣。（ 3分裝中試管，每管約 3-4ml，滅菌后備用。用途：供甲基紅及 V-P試驗用。7枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基的制備成分：磷酸二氫銨 0.1g磷酸氫二鉀 0.1g硫酸鎂 0.02g枸櫞酸鈉 0.23g氯化鈉 0.5g瓊脂 2g蒸餾水 100ml0.5%溴麝香草酚藍酒精溶液 2ml制法：（ 1先將上述各種鹽類溶解于蒸餾水中，使其完全溶解。（ 2矯正 pH至6.8，然后參加瓊脂和指標劑。（ 3搖勻，脫脂棉過濾，分裝中試管，每管約 3-5ml 。（ 4

36、滅菌后置成斜面?zhèn)溆美浜鬄榫G色用途：供枸櫞酸鹽利用試驗用。8醋酸鉛培養(yǎng)基的制備專業(yè)資料整理WORD格式18專業(yè)資料整理WORD格式成分： 2%肉湯瓊脂 200ml硫代硫酸鈉 0.05g醋酸鉛 10g蒸餾水 100ml制法：（ 1先將 10g醋酸鉛參加 100ml蒸餾水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備用 10%醋酸鉛溶液。（ 2加熱溶化 2%肉湯瓊脂 200ml，參加硫代硫酸鈉 0.05g，混合后高壓滅菌。3從高壓滅菌鍋取出， 待冷卻至 45左右時。無菌操作參加無菌的 10%醋酸鉛溶液 1毫升，搖勻。4分裝小試管，每管約 2ml ，直立待冷凝后備用。用途：供硫代氫生成試驗用。說明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不

37、宜久然。9尿素培養(yǎng)基的制備成分： 蛋白胨 1g氯化鈉 5g葡萄糖 1g蒸餾水 900ml瓊脂 1520g0.1%酚紅12ml20%尿素水溶液無菌 100ml制法： 1除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正 pH至6.86.9。2參加瓊脂和酚紅， 810磅10分鐘滅菌。3冷卻至 60后參加無菌尿素溶液，搖勻。4分裝中試管無菌，每管34ml，置成斜面?zhèn)溆?。用途：供尿素分解試驗用。說明： 1尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。2無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g，混合于 100ml蒸餾水中，充分搖勻，用 G6濾菌器過濾除菌，以到達無菌的目的。10巧克力色瓊脂平板的制備成分：肉湯瓊脂

38、 100ml無菌脫纖維羊或兔血 10ml。制法：1將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱參加脫纖維血，搖勻。專業(yè)資料整理WORD格式19專業(yè)資料整理WORD格式2傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。用途：用于培養(yǎng)腦膜炎雙球菌或淋球菌。說明：加血一定要趁熱加。實驗內(nèi)容 3：播放錄象"細菌感染的檢查方法和防治原那么"專業(yè)資料整理WORD格式20專業(yè)資料整理WORD格式第三次實驗實驗四細菌分布及外界因素對細菌影響的檢測實驗內(nèi)容： 1課堂上全部操作；2次日預約看結(jié)果一、自然沉降法檢查空氣中的細菌【材料】普通瓊脂平板。【方法】取普通瓊脂平板一個， 翻開皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中， 置于實驗臺上或

39、需要測定的地方 1530分鐘。蓋上皿蓋，用記號筆或蠟筆注明放置地點、實驗日期和實驗者班級、*等，放入 37溫箱培養(yǎng) 1824小時，觀察細菌的生長情況和數(shù)量。并分析其意義。二、傾注法檢查水中的細菌【材料與方法】1. 用無菌吸管吸取勝 0.5ml水樣參加肉湯培養(yǎng)基中。2. 另取一支未接種的肉湯管做對照，與上管一起置于37溫箱培養(yǎng)1824小時，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】對照管應(yīng)透明清亮， 試驗管變混濁， 說明水樣中有活菌存在。 并可通過比濁法估計細菌生長繁殖后的數(shù)量。三、人體體表及各種物品外表的細菌檢查 拭子法和涂抹法【材料】普通瓊脂平板?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€，在平板底面用記號筆或蠟筆將平板分成假設(shè)干

40、等份，于每份培養(yǎng)基外表分別用手指、衣物、書本、筆等輕輕涂抹不要擦破培養(yǎng)基。也可用無菌生理鹽水擦洗衣物等，用無菌棉拭子涂于培養(yǎng)基外表，蓋上皿蓋 ,分別標記清楚。 置37溫箱培養(yǎng) 1824小時觀察結(jié)果。 觀察各種物品中細菌的數(shù)量及類別，并分析其意義。專業(yè)資料整理WORD格式21專業(yè)資料整理WORD格式【本卷須知】本實驗檢出的除細菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請注意加以區(qū)別。四、人咽喉部位的細菌檢查【材料】血液瓊脂平板?！痉椒ā?. 咳碟法取血液瓊脂平板一個，翻開皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約 10厘米處，用力咳嗽數(shù)次讓飛沫落在培養(yǎng)基外表，然后蓋上皿蓋，注明被檢查者*、實驗日期等。置 37培養(yǎng) 182

41、4小時觀察結(jié)果。觀察細菌的數(shù)量、種類等，注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。2. 試子法用無菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物， 在血瓊脂平板外表涂布成線， 然后改用接種環(huán)，作分區(qū)劃線接種，置 37培養(yǎng) 1824小時觀察結(jié)果。觀察細菌的數(shù)量、種類等。注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。五、化學因素對細菌的影響化學消毒劑的殺菌試驗【材料】1. 菌種：葡萄球菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3. 化學消毒劑： 5%石炭酸、 2%碘酒、 70%酒精、 0.1%升汞。4. 其他：直徑 0.6cm無菌圓形濾紙片、小鑷子、接種環(huán)等?！痉椒ā?. 將瓊脂平板分為四等分，并在其底面做標記。2. 用

42、接種環(huán)取葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于整個瓊脂培養(yǎng)基外表。3. 用小鑷子夾取無菌小濾紙片，分別蘸取上述消毒劑消毒劑不宜蘸得過多，防止外流。平貼于各相應(yīng)分區(qū)的中央，蓋上皿蓋，標明日期和試驗者。4. 置37培養(yǎng) 1824小時后觀察各種化學消毒劑的殺菌作用。 紙片周圍無細菌生長的區(qū)域， 稱為抑菌圈， 分別測量四種消毒劑抑菌圈的直徑， 以毫米為單位記錄之。六、細菌的藥物敏感試驗【材料】專業(yè)資料整理WORD格式22專業(yè)資料整理WORD格式1. 菌種：大腸桿菌，葡萄球菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3. 分別含各種抗生素的直徑 0.6cm的圓形紙片青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉

43、素、卡那霉素、小鑷子等?！痉椒ā?. 取瓊脂平板兩個，每個平板分為五等份，并做相應(yīng)標記。2. 用接種環(huán)分別密涂大腸桿菌及葡萄球菌于兩個瓊脂平板培養(yǎng)基外表。3. 用小鑷子以無菌操作技術(shù)先夾取一無菌不含抗生素的濾紙片平貼于平板中央，再分別夾取含抗生素的各種濾紙片平貼于各相應(yīng)區(qū)中央， 蓋上皿蓋。注明班級、*、日期等。4. 置37培養(yǎng) 1824小時，觀察各種抗生素的抑菌情況。5. 抑菌程度判定：抑菌程度的判定是依照濾紙片周圍細菌的生長與抑菌圈直徑大小來判定。對藥物的敏感程度抑菌環(huán)直徑 mm不敏感無抑菌環(huán)輕度敏感<10中度敏感1015高度敏感>15"附錄"抗生素濾紙片的制

44、備方法1. 取直徑 0.6cm園形濾紙片，每 100片置于一小平皿中， 15磅滅菌 20分鐘，再置于烤箱 60100烘干。2. 取一定濃度的不同抗生素 見表 1分別注入裝有無菌濾紙片的小平皿內(nèi)，每 100片參加 1ml抗菌素，浸泡半小時后，再置 37溫箱中 23小時枯燥。枯燥后保存冰箱備用。有效期約一年左右。表1 常用幾種抗生素的濃度表專業(yè)資料整理WORD格式23專業(yè)資料整理WORD格式抗生素名稱濃度每毫升標記字樣 /符號青霉素200青 P鏈霉素1mg鏈 S紅霉素1mg紅 E卡那霉素200卡 K慶大霉素40慶 G七、噬菌體的噬菌作用噬菌體 bacteriophage具有嚴格寄生性，對相應(yīng)的易感

45、細胞，具有高度的種特異性和型特異性。感染細胞后， 或者裂解宿主細胞， 或者處于溶原狀態(tài)。 可應(yīng)用噬菌體作細菌的鑒定、分型、檢查未知細菌和防治某些疾病?！静牧吓c方法】1. 噬菌體的溶菌現(xiàn)象1取 4支肉湯管， 2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。2將上述兩種菌肉湯管各取1支，分別參加金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液0.2ml。3將上述 4支肉湯管，置 37培養(yǎng) 612小時后觀察結(jié)果。2. 噬菌體的溶菌斑1取普通瓊脂平板 1只，分為 4等分，注明、。2用無菌棉簽在、處涂布接種痢疾桿菌，在處接種大腸桿菌，在處接種白色葡萄球菌。3在、處各加 1小滴痢疾桿菌噬菌體肉泌液，在處加 1滴肉湯。4置 37培養(yǎng)

46、1618小時后觀察結(jié)果。圖5噬菌體的溶菌斑專業(yè)資料整理WORD格式24專業(yè)資料整理WORD格式【結(jié)果】1. 溶菌現(xiàn)象 加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均混濁。2. 溶菌斑 如圖 5，在處的中央有一無菌生長的空斑， 即溶菌斑或蝕斑，其余部位無此現(xiàn)象。八、紫外線的殺菌試驗【原理】波長 240nm280nm的紫外線，因與 DNA 吸收光譜一致，而具有明顯的殺菌作用。其機制是使細菌 DNA 鏈中兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體， 從而破壞 DNA構(gòu)型，干擾其正常復制，導致細菌死亡?！静牧稀?. 菌種：大腸桿菌 1824小時瓊脂斜面培養(yǎng)物。2. 培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。3. 無菌黑色圖案紙片，紫外線

47、燈，消毒液?！痉椒ā?. 用接種環(huán)取大腸桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)物， 密涂于普通瓊脂平板培養(yǎng)基外表。2火焰滅菌小鑷子、待稍涼后，翻開平皿蓋，取無菌黑紙片一片平貼于涂有細菌的平板培養(yǎng)基外表中間。3. 將平板暴露于距紫外燈管 2030cm處，翻開紫外線燈照射 30分鐘。4. 照射完畢，無菌操作取出黑紙片，投入消毒液中，蓋上皿蓋，做標記，注明日期，試驗者等。5. 置37培養(yǎng) 1824小時，觀察培養(yǎng)基外表細菌生長情況、并分析其結(jié)果?！窘Y(jié)果】黑紙片遮蓋處細菌生長形成灰白色菌苔，形狀同黑紙片形狀。 直接暴露在紫外線燈下的培養(yǎng)基外表無生長或僅有少量的細菌生長，形成菌落?！緫?yīng)用】紫外線的殺菌力雖強， 但穿透力弱，故僅用于實驗室、 手術(shù)室空氣及物體表面的消毒滅菌?！颈揪眄氈繗⒕ㄩL的紫外線對人體皮膚，眼睛有損傷作用，使用時應(yīng)注意防護。專業(yè)資料整理WORD格式25專業(yè)資料整理WORD格式九、濾過除菌【原理】濾過是一種機械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、毒素、抗毒素、藥物等。但濾過不能除去病毒、支原體和 L型細菌。【材料】1. 待濾的血清肉湯燒瓶分裝、有菌。2. 肉湯管3. 濾器已滅菌和過濾裝置、無菌刻度吸管和試管等?！痉椒ā?.