鱖胃蛋白酶原基因cDNA全長的克隆與序列分析

1、鱖胃蛋白酶原基因cDNA全長的克隆與序列分析吳雪峰，趙金良（上海水產(chǎn)大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)開放實驗室，上海200090）關(guān)鍵詞：鱖;胃蛋白酶原；cDNA末端快速擴(kuò)增；克隆；序列分析中圖分類號：S917文獻(xiàn)標(biāo)識碼：AClo ning and seque ncing of the full-le ngth cDNA ofpepsinogen gene from the Mandarin fish , Siniperca chuatsiWU Xue-Fe ng, ZHAO Jin-Lia ng(Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources an

2、d Aquacultural Ecosystem Certificated by the Ministry ofAgriculture, Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China)Abstract: Pepsinogen is one kind of gastric digestive proteinases belongling to a family of aspartic proteinases, which is synthesized in the gastric mucosa of vertebrates and c

3、onverted to pepsins in the acidic environment of gastric juice. The mandarin fish (Siniperca chuatsi) is a typical carnivorous fish which only prey on small live fishes after hatching. In order to understand the molecular characters of pepsinogen in fish, the full-length cDNA of pepsinogen gene of S

4、. chuatsi was cloned by means of RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE) and sequenced. The result reveals a 1367 bp cDNA full-length sequence containing 43 bp 5-untranslated region, 187 bp 3-untranslated region and 1137 bp open reading frame (ORF), which encodes 378 amino acids with char

5、acteristic signal peptides and activation peptides. The pepsinogen of S. chuatsi also has highly conserved amino acid residues essential for catalytic activity and conformational maintenance, which are two essential aspartyl residues in the active site and six cysteine residues involved in forming t

6、hree disulphide bonds. The homology of amino acid sequences between pepsinogen of S. chuatsi and other vertebrate pepsinogens ranges from 59.9% to 91.2%, which indicates the pepsinogen gene is highly conserved in evolution. The NJ phylogenetic tree of vertebrates from the amino acids sequences of pe

7、psinogen showed all fish were clustered as a group, the pepsinogen of S. chuatsi was the most close to pepsinogen A form n a of winter flounder. The successful cloning of pepsinogen gene from S. chuatsi not only lays the foundation for further study of its temporal and spatial expression, but also p

8、rovides new material for the molecular characteristic and evolution of fish pepsinogen.Key words: Siniperca chuatsi; pepsinogen; rapid amplification of cDNA ends; cloning; sequence analysis收稿日期：2007-07-19資助項目：上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目（Y1101）、上海水產(chǎn)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)學(xué)科開放課題（04SC11）、上海水產(chǎn)大學(xué)博士啟動基金作者簡介：吳雪峰（1982-）,男，江蘇宜興人，碩士研究生，主要從

9、事水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail: luckyfeng_82通訊作者：趙金良,E-mail: jlzhao胃蛋白酶原（pepsinogen）是胃蛋白酶的前體，胃蛋白酶是胃里特有的一種具有消化功能的蛋白酶， 其活性部位具有兩個天冬氨酸殘基， 屬于天冬氨酸蛋白酶家族 1。哺乳動物中， 胃蛋白酶是以無活性的酶原（即胃蛋白酶原） 形式、由胃上皮主細(xì)胞分泌， 在HCI的作用下，胃蛋白酶原激活， 自動水解形成胃蛋白酶。 胃粘膜中胃蛋白酶原和胃液中胃蛋白酶的含量很 高，所以通過一些分離技術(shù)（如硫酸銨分餾法）可以得到大量的胃蛋白酶原和胃蛋白酶2。胃蛋白酶原和胃蛋白酶的酶學(xué)、 蛋白質(zhì)化學(xué)包括它們的作用模式、 一

10、級結(jié)構(gòu)、 三級結(jié)構(gòu)和功 能研究較為廣泛深入 3-4，胃蛋白酶原還可以作為胃上皮細(xì)胞發(fā)育5和胃疾病診斷 6的分子標(biāo)記。目前，在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種類型的胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C （前胃亞蛋白酶）、胃蛋白酶原F和胃蛋白酶原Y （凝乳酶原）。鱖（ Siniperca chuatsi ）自古以來一直是我國最重要的淡水名貴經(jīng)濟(jì)魚類，具有生長快、 肉質(zhì)鮮嫩、少刺的特點(diǎn)，享有 “淡水石斑魚 ”的美譽(yù)。鱖為典型的肉食性魚類，自開食起終生 以活魚蝦為食， 且十分頑固，因而， 餌料成為鱖大規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展的主要限制因素之一。 國內(nèi) 學(xué)者對鱖消化酶活性方面已有一些研究 7-9，然而，有關(guān)鱖

11、消化酶的分子特性方面至今未見 報道。本研究擬通過 RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增法（RACE），從鱖胃粘膜中克隆并獲得 鱖胃蛋白酶原基因全長 cDNA序列，為研究該基因的時空表達(dá)特征以及進(jìn)一步探討魚類消化 生理的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 實驗材料1.1.1 實驗動物鱖購于上海市楊浦區(qū)圖們路農(nóng)貿(mào)市場，體重560g，實驗室飼養(yǎng)2天，解剖取其胃粘膜進(jìn)行總RNA提取。1.1.2 試劑總 RNA 抽提試劑 TaKaRa RNAiso Reage nt、RT-PCR 所用試劑盒 TaKaRa RNA PCR Kit（AMV ） Ver. 3.0、 pMD19T 載體系統(tǒng)購自寶生物工程（大

12、連）有限公司；BD SMART TMRACE cDNA AmpIification Kit 購于 BD Biosciences ；DNA Ladder 、 Loading Buffer 、普通瓊 脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌 DH5z購自天根生物有限公司。1.2 實驗方法1.2.1 胃總RNA的提取活體解剖，取鱖胃粘膜于 1.5mL離心管中，加入1mL RNAiso reage nt試劑，勻漿器勻漿 后，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%酒精清洗，適量0.01% DEPC處理過的水溶解總 RNA。然后通過變性瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色顯示28S和18S,檢測RNA的完整性。1.2.2

13、 引物設(shè)計與合成根據(jù) Genebank 中已報道的魚類胃蛋白酶原基因序列，運(yùn)用 Primer Premier 5.0 結(jié)合Dnastar 分析軟件及 BLAST 程序，設(shè)計了一對擴(kuò)增部分序列的兼并引物，引物序列如下：正向引物 Pi： 5-TAC/TGGG/C/TACTGGG/CAGCATG- 3'反向引物 P2: 5-TTGA TGGTA ACA/GCTGTCCA- 3'以引物Pi和P2進(jìn)行鱖胃蛋白酶原基因部分序列擴(kuò)增，以擴(kuò)增出來的部分序列為基礎(chǔ)，設(shè)計3端的基因特異性引物 P3,參考3端序列設(shè)計5端的基因特異性引物 P4,引物序列如 下：P3： 5 -ACGCCTGTCTGCT

14、TCTGGCGCGACA -3P4： 5 -GTGTCAACGATAGCCTGGCAACCACCGC- 3所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.3 RT 及 RACE擴(kuò)增RT及cDNA末端快速擴(kuò)增按照 BD SMART TM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒的說明書進(jìn)行。主要步驟如下：取1 總RNA為模板，采用引物3 -CDS primer A和反轉(zhuǎn)錄酶BD PowerScriptTM Reverse Transcriptase在 10 卩 I的反應(yīng)體系中合成 3 '-RACE-Ready cDNA 。RT反應(yīng) 產(chǎn)物用200卩L Tri

15、cine-EDTA Buffer稀釋后，取稀釋液 2.5 為模板，采用聚合50dvantage 2 Polymerase Mix，通用引物UPM和P3進(jìn)行3擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94C, 30s, 72 C, 3min , 5個循環(huán)；94C, 30s, 70C, 30s, 72C, 3min, 5個循環(huán)；94C, 30s, 68C, 30s, 72C, 3min , 25個循環(huán)；最后4C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。5 ' RACE操作流程基本同 3 ' RACE 5 ' RACERT 以 5 -CDS Primer A 及 SMART n A O

16、ligo nucleotide 為反轉(zhuǎn) 錄引物；再用5 -RACE-Ready cDNA為模板，通用引物 UPM和P4進(jìn)行5端擴(kuò)增。1.2.4 PCR 產(chǎn)物克隆及測序?qū)ACE產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后， 用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的 基因片段進(jìn)行回收純化，并將純化后的 RACE產(chǎn)物與pMD19-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌 DHa，經(jīng)LB平板（含Amp+、IPTG和X-gal）培養(yǎng)后，篩選重組子進(jìn)行插入片段檢測。序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。1.2.5 生物信息學(xué)分析應(yīng)用 EditSeq 程序進(jìn)行開放閱讀框( ORF )分析并將其推導(dǎo)為相應(yīng)

17、的氨基酸序列。通過NCBI ( )BLASTX 進(jìn)行蛋白質(zhì)序列相似性檢索，蛋白質(zhì)的分子質(zhì) 量、等電點(diǎn)及基本性質(zhì)分析用 ProtParam( http:/www.expasy.ch/tools/ protparam.html )預(yù)測； 信號肽分析利用 Signal P 3.0 server 程序( http:/www.cbs.dtu.dk/service /SignalP )；氨基酸序 列的多序列比較應(yīng)用 Clustal W ( http:/www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html )進(jìn)行分析；應(yīng)用MEGA 3.1構(gòu)

18、建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。2 結(jié)果2.1 RNA 提取將提取的鱖胃總 RNA 進(jìn)行電泳檢測，電泳顯示 28S、 1 8S rRNA 條帶清晰，濃度比約為 2： 1 (圖未顯示) ，說明提取的 RNA 完整性良好，符合 RACE 擴(kuò)增的要求。2.2 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果用引物Pi和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在300bp400bp中間有一明顯的目的帶， 與預(yù)期的片段長度大小相符。 測序得到一個長度為 373bp 的序列， 該序 列與莫桑比克羅非魚、 赤鯛、褐牙鲆、美洲黃蓋鰈和紅鰭東方鲀的序列同源性分別為：67.6%、68.2%、68.4%、69.0%和 71.7%，故可推測是鱖

19、胃蛋白酶原 cDNA 的部分序列。2.3 3 ' RACE及 5' RACE吉果以通用引物UPM和特異性引物 P3進(jìn)行3端擴(kuò)增，在700bp900bp中間有一條明顯的 目的帶，與預(yù)期大小相符，測序后得到一個長度為 793bp 的序列。同樣以通用引物 UPM 和 特異性引物P4進(jìn)行5端擴(kuò)增，測序后得到一個長度為 913bp的序列。2.4 生物信息學(xué)分析將RT-PCR、3 RACE、5 RACE擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接，獲得鱖胃蛋白酶原基因cDNA全長序列(圖1 )。序列分析顯示：鱖胃蛋白酶原基因cDNA序列全長1367bp，其包括43bp的5端非翻譯區(qū)，187bp的3端非翻譯區(qū)和編碼

20、378個氨基酸殘基的1137bp開放閱讀框, 在poly A尾上游29bp處存在加尾信號序列 ATTAAA。鱖胃蛋白酶氨基酸序列中具有胃蛋 白酶催化活性必需的 2個天冬氨酸殘基（Asp90、Asp272）和構(gòu)成3個二硫鍵所需的6個半胱 氨酸殘基（Cys103、Cys108、Cys263、Cys267、Cys305、Cys339）。利用ProtParam預(yù)測了編碼蛋白的理化性質(zhì)，推測該蛋白的分子式為C1832H2787N483O563S20，相對分子質(zhì)量為 41227.3，等電點(diǎn)為5.01，理論半衰期大于 10 h,不穩(wěn)定參數(shù)為33.83,屬于穩(wěn)定蛋白。信號肽分析結(jié)果表明第116個氨基酸為鱖胃蛋

21、白酶原信號肽序列。根據(jù)紅鰭東方魨、褐牙鲆、美洲黃蓋鰈、美洲紅點(diǎn)鮭、人、鼠、狗胃蛋白酶原 激活肽氨基酸組成特征10，推測第1753個氨基酸為鱖胃蛋白酶原激活肽序列。-43gactcaggtttgagagtctacagttgacagcagagccgagaca1 ATGAAGTGGGTCTTTGTTATGTGTGCCATGGTGGCACTGTCTGAGTGCCTCATCCAGGTCCCTCTGGAGAAG1 M K W V F V M C A M V A L S E C L I Q V P L E K73 GGTAAGACAGCCAGGGAGTTGCTGGAGGAGCAGGGTCTATGGGAGGA

22、GTACAGGCTCAAGTACCCATACAAC25 G K T A R E L L E E Q G L W E E Y R L K Y P Y N145 CCCATGGCCAAGTTTGACGAGCGCTTTGCAGTGGGCAGTGAGTCCATGACCAACGATGCTGATCTGTCTTAC49 P M A K F D E R F A V G S E S M T N D A D L S Y217 TATGGAATCATCTCCATTGGAACCCCTCCTCAGTCCTTCAAGGTCATCTTCGACACCGGCTCATCTAACCTG73 Y G I I S I G T P P

23、Q S F K V I FD T G S S N L289 TGGGTGCCCTCCATCTACTGCAACAGTGCAGCCTGCAACAACCATGACAAATTTAACCCAGGCAAGAGCAGC97 W V P S I Y C N S A A C N N H D g F N P G K S S361 ACCTACAGAAACAATGGCAGTCCTCTCACAATCCAATATGGCACCGGCAGCATGACTGGCTACCTTGGATAT121 T Y R N N G S P L T I Q Y G T G S M T G Y L G Y433 GACACTGTGACGGTCGG

24、TGGGCTTGCTGTTAAGAACCAGATCTTCGGCTTGAGCCAGACTGAGGCTCCCTTC145 D T V T V G G L A V K N Q I F G L S Q T E A P F505 ATGCAGTACATGCGTGCTGATGGTATTCTGGGCCTGGCATACCCACGCCTGTCTGCTTCTGGCGCGACACCC169 M Q Y M R A D G I L G L A Y P R L S A S G A T P577 GTCTTCGACAACATGATGAACGAGGGCCTGGTCAACCAGGACCTCTTCTCTGTGTACCTGAGT

25、GCTAACTCT193 V F D N M M N E G L V N Q D L F S V Y L S A N S649 CAGCAAGGCAGTGTTGTGACCTTCGGTGGTGTTGACCCCAACCACTACTATGGTTCCATCACCTGGATTCCC217 Q Q G S V V T F G G V D P N H Y Y G S I T W I P 721 CTCTCCAGTGAGCTGTACTGGCAGATCACAGTGGACAGTGTTACTGTCAATGGTCAGGTTGTGGCTTGCAGC241 L S S E L Y W Q I T V D S V T V

26、N G Q V V A C S793 GGTGGTTGCCAGGCTATCGTTGACACTGGCACTTCTCTGATTGTTGGACCTCAGAACAGCATCAGCAACATC265 G G C Q A I VD T G T S L I V G P Q N S I S N I865 AACAGTGGGGTGGGAGCTAGCGGCCAGAACGGAGACTATGTTGTCAACTGTAACAACATTGCCCAAATGCCT289 N S G V G A S G Q N G D Y V V N C N N I A Q M P937 GATGTGACCTTCCACATCCACGGACAGG

27、AATTCACCCTCCCAGCTTCTGCCTACGTCCGTCAGTCTCAATAC313 D V T F H I H G Q E F T L P A S A Y V R Q S Q Y 1109 TATGGCTGCCGTACTGGCTTTGGCAATGGAGGTGACAGCCTGTGGATCCTGGGTGATGTCTTTATCAGACAG337 Y G C R T G F G N G G D S L W I L G D V F I R Q1081 TACTATTCCATCTTCAGCAGAGCCCAGAATATGGTGGGTCTGGCCAGGTCTAGATAA361 Y Y S I F

28、S R A Q N M V G L A R S R1138 tcaacctgaagtcaccttacccactttacaacaatcatatatacatcttagtacaattgtaggattttcagcatgcatgggtttcagtgctactgtaattatgtgtgatgccaaatcttttccttgtcctataaatgATTAAAtttcctcaaattcaataaaaagagttatcaaaaaaaaaaaaaaa圖1鱖胃蛋白酶原基因cDNA核苷酸序列和氨基酸序列注：小寫字母代表3'、5端非翻譯區(qū)；大寫字母部分為編碼區(qū)，上面為核苷酸序列，下面為氨基酸序列；下劃線區(qū)域為信

29、號肽；表示終止密碼子；多聚腺苷酸加尾信號( ATTAAA )用方框標(biāo)出；活性部位的天 冬氨酸殘基(D90,D272)用黑框白字標(biāo)出；形成3個二硫鍵的6個半胱氨酸殘基(C103,C108,C263,C267,C305, C339)用白框黑字標(biāo)出。Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of pepsinogen gene ofS. chuatsiNote : 3 '-、5'-untranslated regions are shown as lowercases. Coding region is shown as uppe

30、rcases, where the upper sequence indicates the nucleotide and the lower shows the amino acids. The region of putative signal peptide is underlined. Asterisk indicates stop codon. Putative polyadenylation signal (ATTAAA) is boxed. Two aspartic90272acid residues associated with the active site motifs

31、(D , D ) is indicated in white with a black background. Thesix cysteine residues (C103, C108, C263, C267, C305, C339) involved in forming three disulphide bonds characteristic of pepsinogen are indicated black on a white background.2.5同源性比較鱖胃蛋白酶原氨基酸序列與其他脊椎動物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性比較結(jié)果表明，鱖胃蛋白酶原氨基酸序列與紅鰭東方魨、褐牙鲆

32、、美洲黃蓋鰈(AIIa/AIIb )、伯氏豚鰕虎魚(A1/A2/A3 )、美洲紅點(diǎn)鮭(C1/C2 )的序列同源性分別為 65.3%、72.0%、91.2%/73.5%、 73.3%/72.0%/85.2%、62.1%/61.3%，與人(A/C/Y)、鼠(F)、狗(B)、豬(A)、兔(A/F)的序列同源性分別為 70.1%/63.8%/69.4%、71.5%、59.9%、72.4%、69.7%/70.6% ;在這幾種脊椎動物的胃蛋白酶原氨基酸序列中均發(fā)現(xiàn)有定位相同的2個天冬氨酸殘基和 6個半胱氨酸殘基。2.6胃蛋白酶原的分子進(jìn)化圖2為鱖與其他脊椎動物胃蛋白酶原氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹，除了美洲

33、紅點(diǎn)鮭胃蛋白酶原屬C型外，其他魚類單獨(dú)聚為一支。 其中，鱖胃蛋白酶原與美洲黃蓋碟胃蛋白酶原Alla的親緣關(guān)系最近。75100 S.chPepW.FIP 即 Al 旳A.FiPepA3901001001001009S1000199FuguPep-A. FiPepAIA.FiPepA2-J FlPepW FIPepAllb-HumanPepYMousePepFRabbitPepFRabbitPepAHumanPepA-PigPepADogPepBHumanPepCITroutPepCI100 I TroutPepC2圖2脊椎動物胃蛋白酶原的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹GenBank登錄號：美洲黃蓋鰈胃蛋白酶原A

34、 n a (W.FIPepA n a), AAD56283 ;伯氏豚鰕虎魚胃蛋白酶原A3 (A.FiPepA3 ), AJ550951;伯氏豚鰕虎魚胃蛋白酶原A1 (A. FiPepAI) , AJ550949;伯氏豚鰕虎魚胃蛋白酶原A2 (A.FiPepA2 ) , AJ550950 ;褐牙鲆胃蛋白酶 (J.FI Pep) , AB120129 ;美洲黃蓋鰈胃蛋白酶原 A n b(W.Fl PepAn b), AAD56284 ;紅鰭東方魨胃蛋白酶原(FuguPep) , AB179547 ;人胃蛋白酶原 A(HumanPepA) , P00790;豬胃蛋白酶原 A (PigPepA) ,

35、AAA31096 ;兔子胃蛋白酶原 A (RabbitPepA), AAA85369 ;鼠胃蛋白酶原 F (MousePepF) , AAF61241 ;兔胃蛋白酶原 F (RabbitPepF) , AAA31440 ; 人胃蛋白酶原 Y( HumanPepY), M57258-M57260 , M57262 和 M57264-M57268 ;狗胃蛋白酶原 B( DogPepB), BAB86888 ;人胃蛋白酶原 C ( HumanPepC) , NP_002621;美洲紅點(diǎn)鮭胃蛋白酶原C1 (TroutPepC1 ),AAG35646 ;美洲紅點(diǎn)鮭胃蛋白酶原 C2 ( TroutPepC

36、2) , AAG47643。Fig.2 The NJ phylogenetic tree of pepsinogen of vertebratesGenBank accession nos: Winter flounder pepsinogen A form n a (W.FIPepA n a), AAD56283; Antarctic fish pepsinogen A3 (A.FiPepA3), AJ550951; Antarctic fish pepsinogen A1 (A.FiPepA1),AJ550949; Antarctic fish pepsinogen A2 (A.FiPep

37、A2), AJ550950; Japaneseflounder pepsinogen (J.Fl Pep), AB120129; Winter flounder pepsinogen A form n b (W.Fl Pep A n b), AAD56284; Fugu rubripes pepsinogen (FuguPep), AB179547; Human pepsinogen A (HumanPepA), P00790; Pig pepsinogen A (PigPepA), AAA31096; Rabbit pepsinogen A (PigPepA), AAA85369; Mous

38、e pepsinogen F (MousePepF), AAF61241; Rabbit pepsinogen F (RabbitPepF), AAA31440; Human pepsinogen Y (HumanPepY), M57258-M57260, M57262 and M57264-M57268; Dog pepsinogen B (DogPepB), BAB86888; Human pepsinogen C (HumanPepC), NP_002621; Brook trout pepsinogen C1 (TroutPepC1), AAG35646; Brook trout pe

39、psinogen C2 (TroutPepC2), AAG47643.3 討論胃蛋白酶原的多樣性在很多脊椎動物中已經(jīng)得到了證實。在人中發(fā)現(xiàn)了3種胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原Y10-12。豬胃蛋白酶原有4種：胃蛋白酶原A、 胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原丫13。Gildberg 14, Tanj嚴(yán)，Douglas何，Bobe and Goetz17分別在鱈、金槍魚、美洲黃蓋鰈、美洲紅點(diǎn)鮭有胃真骨魚類中也發(fā)現(xiàn)了有多種形式 的胃蛋白酶原， 其中美洲紅點(diǎn)鮭的多種胃蛋白酶原不僅在胃中表達(dá)， 而且在卵巢中也有表達(dá)。 在沒有胃的紅鰭東方鲀中也發(fā)現(xiàn)了一種胃蛋白酶原，它的mRNA不

40、在消化器官里面表達(dá)，而是在皮膚里表達(dá)18。本實驗運(yùn)用RACE法快速擴(kuò)增獲得了一條1367 bp的鱖胃蛋白酶原基因 cDNA全長序列，閱讀框長度 1137bp，編碼氨基酸378個。鱖胃蛋白酶原氨基酸序列與美洲 黃蓋鰈胃蛋白酶原 AIIa的同源性最高為91.2% ;與伯氏豚鰕虎魚（A1/A2/A3 ）、褐牙鲆、紅 鰭東方魨、美洲紅點(diǎn)鮭（C1/C2）的同源性次之， 分別為73.3%/72.0%/85.2%、72.0%、65.3%、 62.1%/61.3%，表明本研究獲得的是鱖胃蛋白酶原基因。除了美洲紅點(diǎn)鮭胃蛋白酶原 C1和C2,其他已知魚類的胃蛋白酶原 A型均聚為一支，這種聚類關(guān)系表明在長期的進(jìn)化過

41、程中，魚類 胃蛋白酶原基因相對保守。由于鱖胃蛋白酶原與美洲黃蓋鰈胃蛋白酶原AIIa最先聚類，親緣關(guān)系最近，推測本研究獲得的鱖胃蛋白酶原為A型?，F(xiàn)已證明，不同動物胃蛋白酶原的氨基酸序列中一般都含有2個定位相同的天冬氨酸殘基和 6個半胱氨酸殘基。 據(jù)對已知脊椎動物的胃蛋白酶原的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，這2個天冬氨酸殘基是胃蛋白酶的催化活性中心。6個半胱氨酸殘基的位置非常保守，它們在成熟肽中形成 3個二硫鍵， 對胃蛋白酶原的正常折疊、 蛋白質(zhì)構(gòu)象的確定、 維持空間結(jié)構(gòu)以發(fā)揮有效的生理 功能有著重要的作用。本研究獲得的鱖胃蛋白酶原氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)有2個天冬氨酸殘基（Asp90、Asp272）和6個半胱氨酸殘

42、基（Cys103、Cys108、Cys263、Cys267、Cys305、Cys339）。 魚類胃蛋白酶原基因克隆研究的開展可為深入理解魚類胃蛋白酶原基因的分子特征和分子進(jìn)化提供了新的資料。參考文獻(xiàn)：1 Foltmann B. Gastric proteinases structure, function, evolution and mechanism of actionJ.Essays Biochem, 1981, 17: 52 -84.2 Herriott R M. Isolation, crystallization and properties of swine pepsinogen

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