最新植物生理指標測定方法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實驗一 植物葉綠素含量的測定（分光光度法）(張憲政，1992)一、原理     根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即ACL式中：比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的

2、總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用效率的大小，比值高則大，則反之。二、材料、儀器設備及試劑    試劑：1）95%乙醇（或80%丙酮） 三、實驗步驟    

3、60; 稱取剪碎的新鮮樣品 0.20.3g，加乙醇10ml，提取直至無綠色為止。把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，在波長663nm和645nm下測定吸光度。       四、實驗結果按計算丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的計算】葉綠素a的含量（mg/g） =（12.71´OD663  2.59´OD645）V/1000*W葉綠素b的含量（mg/g） =(22.88OD645  4.67OD663) V/1000*W 葉綠素a、b的總含量（mg/

4、g） =(8.04´OD663 +20.29´OD645) V/1000*W按Inskeep公式葉綠素a的含量（mg/g） =（12.63´OD663  2.52´OD645）V/1000*W葉綠素b的含量（mg/g） =(20.47OD645  4.73OD663) V/1000*W葉綠素a、b的總含量（mg/g） =(7.90´OD663 + 17.95´OD645) V/1000*W注：1、葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用率 【1】 比如陽生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較大 【2

5、】陰生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較小 2、丙酮-熔點:-94 ；沸點:56.48；是一種無色透明液體，有特殊的辛辣氣味易溶于水和、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有機溶劑.下一步實驗方法比較【1】95%乙醇直接提?。ǎ?】95%乙醇加熱提取（馮瑞云，1985）【3】無水酒精和80%丙酮等體積混合提取實驗二、不良環(huán)境對植物細胞膜的傷害（(張憲政，1992)）一、 原理植物組織在受到各種不利的環(huán)境條件（如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染）危害時，細胞膜的結構和功能首先受到傷害，細胞膜透性增大。若將受傷害的組織浸入無離子水中，其外滲液中電解質(zhì)的含量比正常組織外滲液中含量增加，組織受傷害越嚴重，電解質(zhì)含量

6、增加越多。用電導儀測定外滲液電導率的變化，可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。在電解質(zhì)外滲透的同時，細胞內(nèi)可溶性有機物也隨之滲出，引起外滲液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸對紫外光有吸收，對紫外分光光度計測定受傷害組織外滲液消光值，同樣可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。用電導儀法和紫外法測定結果有很好的一致性。二、方法步驟1、取樣及處理 采用電導法(張憲政，1992)：將選取的幼嫩葉片和成熟葉片剪下，包在密封袋內(nèi)置于冰盒中帶回實驗室。將新鮮的葉樣先用自來水輕輕沖洗葉片，除去表面沾污物，再用去離子水沖洗12次，用濾紙輕輕吸干葉片表面水分，稱0.20.3 g并剪成切段，放入50 mL帶塞試管中，加

7、入20 mL 去離子H2O，浸沒樣品45 h，各處理浸泡時間和測定溫度一致，在室溫下進行，用DDs11型電導儀測其電導率，然后沸水浴15 min，冷卻至室溫再測一次總電導率值。以相對電導率表示細胞質(zhì)膜透性大小。2、計算：植物組織浸泡的電導率，特稱外滲電導率，此測定方法稱外滲電導率法。（1）外滲電導率 K（us/cm*g) =SQ=測定電導率/稱取質(zhì)量 或 K（us/cm*g*ml）=SQ=測定電導率/稱取質(zhì)量*量取體積（2）相對電解質(zhì)滲出率. 電解質(zhì)滲出率（%）= L1（浸泡液電導率）/ L2（煮沸后電導率）×100電解質(zhì)滲出率(%)= L1(浸泡液電導率)-本底電導率/ L2（煮沸

8、后電導率）-本底電導率×100 式中：L1：組織殺死前外滲液的電導值；L2組織殺死后外滲液的電導值。注：1、事先測定水的電導率 2、用吸水紙吸干探頭的水分實驗三 植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定一、目的在逆境條件下（旱、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標。另外，由于脯氨酸親水性極強，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點，有防止細胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標。二、原理磺基

9、水楊酸對脯氨酸有特定反應，當用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應，生成穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下測定吸光度，即可從標準曲線上查出脯氨酸的含量。三、材料、儀器及試劑1.試劑及配制：（1）2.5酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L1磷酸中（原液稀釋2.3倍），攪拌加熱（70）溶解，貯于4冰箱中，2-3日有效。（2）3磺基水楊酸配配制：3.496g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。（3）1

10、0g·ml-1脯氨酸標準母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100g·ml1脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml， 加蒸餾水稀釋定容至100ml，即為10g·ml-1脯氨酸標準液。四、實驗步驟1、脯氨酸標準曲線的制作1.1取6支試管，編號，按下表配制每管含量為012g的脯氨酸標準液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻。以去離子水溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。試 劑管 號01234510g·ml-1脯氨酸標準液（ml）蒸餾水（ml）冰醋酸（

11、ml）3%磺基水楊酸2.5酸性茚三酮（ml）022240.21.82240.41.62240.61.42240.81.22241.01.0224每管脯氨酸含量（g）02468101.3標準曲線的繪制以15號管脯氨酸含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。2.樣品的測定2.1脯氨酸的提取稱取0.20.3g葉片于20ml試管 + 10ml 3磺基水楊酸溶液沸水浴10min（提取過程中要經(jīng)常搖動）冷卻過濾于干凈的試管中脯氨酸提取液。2.2測定吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸 + 4ml 2.5酸性茚三酮沸水浴30min溶液呈紅色冷卻取上層液于比色杯520mm處測定吸光度

12、（A）值。五、計算結果從標準曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量：X×提取液總量（ml）脯氨酸含量（g·g1Fw） 樣品鮮重（g）× 測定時提取液用量（ml）公式中：X 從標準曲線中查得的脯氨酸含量（g）實驗四 植物體內(nèi)丙二醛含量的測定一、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系。測定植物體內(nèi)丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應，生成紅棕色的三甲川（3、5、5三甲基惡唑2、4二酮），三甲川最

13、大的吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物含量時一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g·g1Dw，根據(jù)植物樣品量

14、和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5nmol· L1。在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值，即可計算出丙二醛含量。二、實驗步驟（1）提取采用硫代巴比妥酸顯色法（趙世杰等，2002）。稱取0.20.3 g樣品，加10%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml 三氯乙酸進一步研磨，勻漿后4000 rpm，離心10min。（2）顯色取上清液5 mL，加0.6% TBA 5 mL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，方法一： MDA質(zhì)量摩爾濃度(nmol/g

15、)=( A532-A600)×VZ×V1/(0.155×W×V2)式中：VZ: 反應液總量(4 mL)； V1: 提取液體積(10 mL)； V2: 測定用用提取液量(2 mL)； W: 取樣葉鮮重(g)0.155:為MDA的消光系數(shù)（nmol/l）方法二：方程組： A450=（85.4×103）·C糖（A532A600）=（155×103）·CMDA+（7.4×103）·C糖解得： A450 C糖= = 11.71A450（mmol·L1） 85.4×103 CMDA= 6

16、.45（A532A600）0.56A450（mol·L1）公式中：A450在450nm波長下測得的吸光度值A532在532nm波長下測得的吸光度值A600在600nm波長下測得的吸光度值 1.55×105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、CMDA分別是反應混合液中可溶性糖、MDA的濃度。1.  按下式計算提取液中MDA濃度反應液體積（ml） CMDA × 1000 提取液中MDA濃度（mol·ml1）= 測定時提取液用量（ml）2.按下式計算樣品中MDA含量 提取液中MDA濃度（mol·ml1）×提取液總量（ml） MDA含量

17、（mol·g1 Fw）= 植物組織鮮重（g）試劑： 1、10三氯乙酸：稱取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml2、0.6硫代巴比妥酸（用10三氯乙酸配制）：稱0.6707g TBA用少量1mol/L氫氧化鈉溶解后加10TCA溶解定容至100ml（4貯存） 實驗五、SOD活力測定(NBT還原法)植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標在一定程度上反映衰老過程的變化。近來大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。過剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂

18、過氧化作用，造成細胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡。自由基是具有未配對價電子的原子或原子團。生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基主要有超氧自由基（O2）、羥自由基（OH.）、過氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物細胞膜有酶促和非酶促兩類過氧化物防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶?？箟难幔╒C）、VE和還原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。SOD、CAT等活性氧清除劑的含量水平和O2、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作為植物衰老的生理生化指標。超氧自

19、由基（O2.）是生物細胞某些生理生化反應常見的中間產(chǎn)物。自由基是本身帶有不成對價電子的分子、原子、原子團或離子，化學性質(zhì)非?；顫?，是活性氧的一種。如果細胞中缺乏清除自由基的酶時，機體就會受到各種損傷。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），簡稱SOD，能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2。H2O2由過氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2，從而減少自由基對有機體的毒害。一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實驗依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光

20、下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2-，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。二、試劑（一）試劑（1）0.2 mol/L pH7.8磷酸鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液：A液（0.2 mol/L NaH2PO4溶液）：準確稱取NaH2PO4·2H2O （MW=156.01）15.715g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后 ，移入500mL

21、容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。B液（0.2 mol/L Na2HPO4溶液）：準確稱取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）71.63g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鯝液34mL與B液366mL充分混勻后即為0.2mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液。4冰箱中保存?zhèn)溆谩＃?）0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液取0.2 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液250mL，移入1000 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆谩＃?）130

22、mmol/L 蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液準確稱取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.9699g于小燒杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。【溶于水，3.3g/100ml 25，不溶于有機溶劑】4保存可用12d.（4）750mol/L 氮藍四唑溶液：稱取0.03066g NBT用磷酸緩沖液定容至50ml，避光4保存，先用現(xiàn)配.（5）100mol/L EDTANa2溶液：稱取0.03721g EDTANa2用水定容至1000ml【稱取7.442

23、g EDTANa2用水定容至200ml，吸取1ml用水定容1000ml】（6）20mol/L 核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存【稱取1.8825g核黃素用少量NaOH溶解并用蒸餾水定容至25ml，吸取1ml用水定容1000ml】。4保存810天。三、實驗步驟 1. 酶液提取取植物葉片0.2g0.3g于預冷的研缽中，加2ml預冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為10ml。于4000rpm下離心15min，上清液即為SOD粗提液。2. 顯色反應取試管3支，1支為測定管，另2支為對照管，按下列加入一依次加入各溶液：名

24、稱樣品管對照管1對照管250mmol/L 磷酸緩沖液（ml）5.05.05.0130mmol/L Met溶液（ml）0.30.30.3750mol/L NBT溶液（ml）0.30.30.3100mol/L EDTANa2液（ml）1.01.01.0去離子水（ml）2.02.02.020mol/L 核黃素（ml）0.30.30.30.3（酶液）0.3（緩沖液）0.3（緩沖液）混勻后將1支對照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應20min，然后立即遮光，以遮光管為對照調(diào)零，于560nm下測定光密度。（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，低時延長）。3.SOD活性測定與計算至反應結束后，以不

25、照光的對照管做空白，分別測定其它各管的吸光度。四、結果計算 已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性(AckAE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)=(AckAE)/(Ack×0.015×W)SOD比活力SOD總活性/蛋白質(zhì)含量上式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示； SOD比活力：單位以酶單位mg蛋白表示Ack：照光對照管的吸光度 AE：樣品管的吸光度V：樣品液總體積（ml） Vt測定時樣品用量（ml）實驗六、過氧化物酶活性測定一、試驗目的：過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的

26、活性較高的一種酶，他與呼吸作用、光合作用以及生長素的氧化等都有密切關系。在植物生長發(fā)育過程中他的活性不斷發(fā)生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。通過本實驗了解過氧化物酶的作用，掌握常用的測定過氧化物酶的方法愈創(chuàng)木酚法。二、實驗原理：在過氧化物酶催化下，雙氧水將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在470 nm處有最大吸收峰，故可以通過測其吸光度的變化測定過氧化物酶的活性。三、實驗試劑 1、0.05 mol/L PH 7.0的磷酸緩沖液： 0.2M A液（Na2HPO4）61ml和0.2M B液（NaH2PO4）39ml混合100ml，用去離子水定容400ml2、0.05 mo

27、l/L愈創(chuàng)木酚溶液：取0.6207g定容100ml 1%愈創(chuàng)木酚溶液：吸取1毫升愈創(chuàng)木酚，加入少量95%酒精溶解，用水定容100ml，放于棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆?3、2%雙氧水溶液:：取30% H2O2 10ml用去離子水定容150ml4.、反應混合液取50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）30mL，2%過氧化氫10mL，1%愈創(chuàng)木酚10mL混合。四、操作步驟1酶液提?。呵逑锤蓛羧~片擦干，稱取0.20.3 g葉片，剪成小片，放入研缽加入適量10%PVPP（除去酚類物質(zhì)）、石英沙、及2ml 50mmol的PH 7.0(5.5-7.5)的磷酸緩沖液PBS（0.02-0.1mmol）進行研磨，磨碎后

28、在加入8mlPBS溶液洗滌研缽一并裝入離心管內(nèi)，4下4000rmin-1離心15min，收集上清液4保存?zhèn)溆谩?顯色反應類別對照管樣品管反應液3.0 mL溫度25緩沖液0.5 mL酶液0.5 mL測定波長470nm五、計算 過氧化物酶活性（OD470/(min.g)） =（A470×VT）/（W×VS×0.01×t） 式中：A470為反應時間內(nèi)吸光度的變化，W為葉片鮮重g，t為反應時間min，Vt為提取酶液總體積ml，Vs為測定時取用的酶液體積ml。實驗19植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 考馬斯亮藍 G 250 染色法一、原理 考馬斯亮藍 G 250

29、（ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白質(zhì) 染料結合的原理，定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍 G-250 存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍色形式，最大光吸收由 465 nm 變成 595 nm ，通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結合是一個很快的過程，約 2 min 即可反應完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定 1 h ，之后，蛋白質(zhì)染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出

30、來。此法靈敏度高（比 Lowry 法靈敏 4 倍），易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結合狀況有一定差異。 二、實驗材料、試劑與儀器設備 （一）試劑 1. 標準蛋白質(zhì)溶液（100 g/mL 牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液40 mL ，用蒸餾水稀釋至100 mL 即可。 2. 考馬斯亮藍試劑：稱取 100 mg 考馬斯亮藍 G-250 ，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入 100 mL 85（ W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到 1000 mL ，貯于棕色瓶中。常溫下可

31、保存一個月。 三、實驗步驟 1. 標準曲線的繪制 取 6 支試管，按表 261 加入試劑，搖勻，向各管中加入 5 mL 考馬斯亮藍試劑，搖勻，并放置 5 min 左右，以 0 號試管為空白對照，在 595 nm 下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。 試 劑管 號012345標準蛋白質(zhì)（ mL ）00.200.400.600.801.00蒸餾水量（ mL ）1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量（ g ）0204060801002. 樣品測定 （ 1 ） 樣品提取 稱取鮮樣 0.25 0.5 g ，用 5 mL 蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后， 300

32、0 r/min 離心 10 min ，上清液備用。 （ 2 ）吸取樣品提取液 0.3 mL （視蛋白質(zhì)含量適當稀釋），放入試管中（每個樣品重復 2 次），加入 5 mL 考馬斯亮藍試劑，搖勻，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，測定吸光度，并通過標準曲線查得蛋白質(zhì)含量。 四、結果計算 （ mg/g ）   式中： C 查標準曲線值， g 。 V T 提取液總體積 , mL 。 W F 樣品鮮重 , g 。 V S 測定時加樣量 , mL 。  注意點：1，考馬斯亮藍G-250所配溶液不穩(wěn)定，所以每次實驗都必須新配，且必須新做標準曲線；2，考馬斯亮藍G-250配制完

33、畢，如果發(fā)現(xiàn)溶液中有絮狀沉淀，可以試用濾紙過濾后使用，如果實驗中發(fā)現(xiàn)使用過濾后的考馬斯亮藍G-250溶液在與樣品接觸后短時間內(nèi)便又發(fā)生絮凝，基本上推測該考馬斯亮藍G-250過期（比較容易出現(xiàn)）。實驗七、過氧化氫酶的活性測定高錳酸鉀滴定法 【原理】過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。  據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應系統(tǒng)中加入一定量（反應過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4

34、+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量?！驹噭俊?】3M H2SO4：吸取濃硫酸80ml用去離子水定容至500ml【2】0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.0；【3】0.1mol/L高錳酸鉀標準液：稱取KMnO4（AR）16 g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液4.87ml，稀釋至500ml，用標準0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進行標定；【實驗步驟】 1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml

35、pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。2.滴定反應管 號對照管樣品管粗酶液(ml)0.20.23mol/L H2SO4 (ml)50PH 7.0磷酸緩沖液1.81.80.1mol/L H2O2 (ml)55條 件加入H2O2立即計時于35恒溫水浴中保溫3min3mol/L H2SO4 (ml)05用0.1mol/L KMnO4標準溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點所用KMnO4體積（ml）AB【結果計算】： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：

36、酶活(mgH2O2/gFW·min)=式中 A對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應所用酶液量（ml）; W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相當于1.7mg H2O2。過氧化氫酶的活性測定紫外吸收法一、原理H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。二、實驗步驟 1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中

37、，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。4下保存?zhèn)溆谩?.測定：取10ml試管3支，其中1號為樣品測定管，1號為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管 號樣品管對照管粗酶液(ml)0.2（煮死酶液）0.2pH7.0磷酸(ml)1.51.5蒸餾水(ml)1.01.0 25預熱后，逐管加入0.5ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。3.結果計算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對照管吸光值； AS1， AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）。高錳酸鉀滴定液的配制和標定1高錳酸鉀滴定液（0.1molL）的配制市售