一株乳酸菌產(chǎn)類細(xì)菌素

1、一株乳酸菌產(chǎn)類細(xì)菌素Enteriocin LK-S1的初步研究王云華 李 健*聯(lián)系作者 收稿日期: 2001-11-18 作者簡介: 王云華(1979-), 女, 碩士生(山東大學(xué)，山東 濟(jì)南 250100)摘要: 從雞腸道分離的59株乳酸菌中，通過雙層平板法試驗(yàn)，篩選出一株產(chǎn)類細(xì)菌素的乳酸菌，編號為SE-81。初步鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）。在排除有機(jī)酸和過氧化氫的干擾作用后，SE-81菌株對溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草桿菌（Bacillus subtilis）等革蘭氏陽性

2、菌和大腸桿菌（Escherichia coli）及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）等革蘭氏陰性菌有強(qiáng)烈的抑制作用。用胰蛋白酶處理發(fā)酵上清液后，抑菌活性喪失。因此初步認(rèn)為該菌株產(chǎn)生一類具有廣譜抑菌活性的類細(xì)菌素物質(zhì)，命名為EnteriocinLK-S1。它具有較廣的抗菌譜，作用pH在4.0-6.0，有很好的熱穩(wěn)定性。關(guān)鍵詞: 腸球菌；類細(xì)菌素；乳酸菌；生物學(xué)特性中圖分類號: Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A乳酸菌(Lactic acid bacteria LAB)是一類利用可發(fā)酵糖并產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱。長期以來，乳酸菌廣泛應(yīng)用于乳制品、蔬菜及肉制品的發(fā)酵和防腐中1。

3、許多乳酸菌代謝除了產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸和過氧化氫外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌生物活性的細(xì)菌素（bacteriocin），在抑制多種病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要的作用2，其中以乳鏈球菌肽Nisin為代表。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成的具有抑菌活性的多肽或蛋白質(zhì)。但它通常具有較為窄譜的抑菌活性3，僅僅抑制其親緣關(guān)系很近的乳酸菌株和非乳酸菌的革蘭氏陽性細(xì)菌，對革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌則無效。類細(xì)菌素是用來描述那些不符合或不完全符合細(xì)菌素定義的拮抗物質(zhì)。類細(xì)菌素不僅能抑制革蘭氏陽性菌，而且對革蘭氏陰性菌和真菌也有抑制作用4。這一特性決定了類細(xì)菌素具有比細(xì)菌素更為廣泛的應(yīng)用前景。目前關(guān)于

4、乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素的研究已深入到分子水平，而對乳酸菌類細(xì)菌素的研究卻很少，國內(nèi)尚未見報(bào)道。本文對59株乳酸菌株進(jìn)行了篩選，得到一株產(chǎn)類細(xì)菌素的菌株，該菌株是自雞腸道中分離得到的，經(jīng)鑒定為腸球菌，并對它產(chǎn)生的類細(xì)菌素EnteriocinLK-S1的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。1 材料和方法1.1 材料 菌種Enterococcus SE-81：自雞腸道中分離得到抑菌試驗(yàn)中的指示菌：溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、 乳酸乳球菌(Lactococcus lactic

5、) 、干酪乳球菌（Lactococcus casei）、大腸桿菌(Escherichia.coli)、 鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、海洋假單胞菌(Pseudomonas sp.)、黑曲霉（Aspergillus niger）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）均為實(shí)驗(yàn)室保存。 培養(yǎng)基BCP 培養(yǎng)基和MRS 培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)5配制指示菌生長培養(yǎng)基：LB、PDA和MA參照文獻(xiàn)6配制抑菌活性檢測用底層培養(yǎng)基：指示菌生長培養(yǎng)基加入瓊脂2% 抑菌活性檢測用上層培養(yǎng)基：指示菌生長培養(yǎng)基加入瓊脂0.75%1.2 分析方法 乳酸的定量分析：采用40B

6、型葡萄糖-乳酸分析儀（山東省省科學(xué)院） EnteriocinLK-S1的制備：培養(yǎng)24h的發(fā)酵液，離心（8000rpm）去菌體，經(jīng)過濾除菌得到發(fā)酵上清液。再經(jīng)真空冷凍干燥成為干粉，即為類細(xì)菌素粗制品。用時(shí)以原體積1/5的無菌水重新溶解。 細(xì)菌數(shù)的測定：用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)和平板統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)（CFU/ml） 抑菌試驗(yàn)：牛津杯雙層平板法。將各指示菌培養(yǎng)到指數(shù)期，經(jīng)無菌水系列稀釋到8.0×108CFU/ml，取100ul加入到4.5ml上層培養(yǎng)基中，振蕩混勻，然后倒入預(yù)先準(zhǔn)備的裝有10ml底層培養(yǎng)基的平板上。向牛津小杯中加入0.15ml 乳酸菌發(fā)酵濃縮液，平板在室溫下擴(kuò)散3h，于38下培養(yǎng)12h

7、，測抑菌圈的直徑。 排除干擾因素：采用中和法排除有機(jī)酸的干擾；加入適量的過氧化氫酶（1mg/ml），37水浴保溫1h，排除過氧化氫的抑菌作用。 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 產(chǎn)類細(xì)菌素菌株的篩選和菌種分離鑒定采用平板稀釋法和厭氧培養(yǎng)技術(shù)，從雞腸道中分離經(jīng)純化得到59株乳酸菌；通過牛津杯雙層平板法，篩到一株編號為SE-81，對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用的菌株，結(jié)果見圖1；對其進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化性質(zhì)測定，菌體細(xì)胞呈球形，單個(gè)或成雙、四聯(lián)球體出現(xiàn)；革蘭氏陽性，無芽孢，菌落邊緣整齊，光滑，乳白色不透明；接觸酶反應(yīng)、硝酸還原試驗(yàn)、水解淀粉試驗(yàn)、水解明膠試驗(yàn)、檸檬酸生長試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)和產(chǎn)生

8、吲哚試驗(yàn)均為陰性；發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、核糖和葡萄糖酸鈉產(chǎn)酸，但發(fā)酵葡萄糖和葡萄糖酸鈉均不產(chǎn)氣，屬于異型發(fā)酵，發(fā)酵棉子糖、蜜二糖、纖維二糖、乳糖、半乳糖、甘露糖和山梨醇，不發(fā)酵鼠李糖和巖藻糖，弱發(fā)酵阿拉伯糖、松三糖、木糖和七葉靈；1045均生長。根據(jù)SE-81菌株的形態(tài)特征及生理生化特性，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊（第八版）和乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法7 ，初步鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）。2.2 SE-81菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定 酸性末端產(chǎn)物的排除腸球菌SE-81發(fā)酵液的上清液對指示菌的抑制作用，可能是它代謝合成的細(xì)菌素，也可能是酸性末端產(chǎn)物如乙酸、乳酸及其它有機(jī)酸作用的結(jié)果。為

9、了排除酸性末端產(chǎn)物的干擾，將培養(yǎng)24h菌株發(fā)酵液離心，取上清液，中和至pH5.0后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)(以溶壁微球菌為指示菌)，以pH5.0乳酸和乙酸為對照。重復(fù)三次，抑菌結(jié)果如表1所示。表1 排除有機(jī)酸的抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of antibacterial by supernatant without organic acid樣品抑菌圈平均直徑(mm)發(fā)酵上清液23.28pH為5.0的發(fā)酵液15.10pH為5.0的乳酸pH為5.0的乙酸注: 不抑制 No inhibitory結(jié)果表明，pH5.0的乳酸和乙酸不能抑制指示菌的生長，相反pH為5.0的發(fā)酵上清液對指示菌仍具有強(qiáng)烈

10、的抑制作用，這說明在排除有機(jī)酸的干擾后，發(fā)酵液中存在其他的抑菌物質(zhì)。 過氧化氫干擾的排除乳酸菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫也可以抑制細(xì)菌的生長，尤其是抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的生長，因此必須排除過氧化氫的干擾。取1ml 發(fā)酵濃縮液，加入10mg/ml 的過氧化氫酶液1ml，在30水浴反應(yīng)60分鐘，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以大腸桿菌（E.coli）為指示菌。以未經(jīng)過氧化氫酶作用的發(fā)酵上清液為對照，重復(fù)三次，抑菌結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液的抑菌作用幾乎沒有變化，這表明發(fā)酵濃縮液抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的作用并不是過氧化氫作用的結(jié)果。表2 過氧化氫酶處理后的抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results

11、 of antibacterial after treatment with hydrogen peroxidase樣品抑菌圈平均直徑(mm)活性下降百分率(%)對照20.340.00過氧化氫酶處理的發(fā)酵液19.424.50 蛋白酶處理法取兩份等量（1ml）的SE-81發(fā)酵濃縮液，用1mol/L的HCl和2mol/L NaOH調(diào)節(jié)其pH至胰蛋白酶作用的最適pH值7.6 ，分別加入0.5mg的胰蛋白酶和無菌水，37水浴中溫育1h，再將pH值調(diào)回到類細(xì)菌素的最適pH，并與未經(jīng)任何處理的原液作比較，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。圖 1 SE-81 發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)結(jié)果Figure. 1 Result

12、s of antibacterial from SE-81 supernatant 1 指示菌為大腸桿菌2 指示菌為溶壁微球菌圖 2 胰蛋白酶處理后抑菌試驗(yàn)結(jié)果Figure. 2 Results of antibacterial from supernatant after treatment with trypsin1 SE-81發(fā)酵液2 經(jīng)胰蛋白酶作用的發(fā)酵液3 加入無菌水的發(fā)酵液從圖2中可知，經(jīng)胰蛋白酶處理的發(fā)酵濃縮液喪失抑菌活性。這證實(shí)了腸球菌SE-81產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)或多肽，并對胰蛋白酶敏感。 該菌株所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)，可抑制革蘭氏陽性菌，也可以抑制革蘭氏陰性菌，而且這種抑菌結(jié)

13、果，排除是有機(jī)酸和過氧化氫所為，再加上對胰蛋白酶敏感，因此可認(rèn)為是一種類細(xì)菌素，命名為EnteriocinLK-S1。下面對EnteriocinLK-S1粗制品的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。3 討論自雞腸道中分離得到的能夠抑制其他細(xì)菌生長的乳酸菌是改善雞腸微生態(tài)環(huán)境的最適益生菌。由于這些乳酸菌已經(jīng)完全適應(yīng)雞腸道的生態(tài)條件，因此比從其他生境中分離的乳酸菌更有優(yōu)勢。故我們對從雞腸道分離得到的59株乳酸菌進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果從中篩選出一株有抑菌活性的腸球菌SE-81。眾所周知，乳酸菌通過代謝合成有機(jī)酸、過氧化氫以及細(xì)菌素等化合物的途徑來抑制其他微生物的生長和繁殖，因此在食品防腐方面有重要的應(yīng)用前景。

14、但研究報(bào)道的大多是乳酸菌產(chǎn)生僅僅抑制同種的或親緣關(guān)系很近的乳酸菌和以溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)菌素，關(guān)于乳酸菌抑制革蘭氏陰性菌和真菌的報(bào)道很少。如Virginia等1999年報(bào)道從健康成年婦女陰道中分離得到一株產(chǎn)類細(xì)菌素的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，能夠殺死革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌4。參考文獻(xiàn)：1. Daeschel MA. Antimicrobial Substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives J . Food Technol . 1989; 43: 1641712. 朱文淼, 劉穩(wěn). 乳酸菌細(xì)菌素的研究動向 J . 生物技術(shù), 1999; 9(6): 32363. 楊杰彬等. 乳酸菌-生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用 M . 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1996. 2412464. Virginia S. Characterization of a Bacteriocin-like Substance produced by a vaginal Lactobac