一個新的具有特殊結構和潛在趨化活性

1、一個新的具有特殊結構和潛在趨化活性的人細胞因子趨化素樣因子1的克隆和特性研究韓文玲 婁雅欣 唐軍民 張穎妹 陳英玉 馬大龍 等細胞因子是在免疫和炎癥反應中起重要作用的小分子蛋白質(zhì)。近年來，越來越多的細胞因子得以發(fā)現(xiàn)。本文介紹一種新的細胞因子趨化素樣因子1（CKLF1）的發(fā)現(xiàn)和特性研究。CKLF1全長cDNA序列包括530個堿基，有一個編碼99個氨基酸的完整開放讀碼框架。CKLF1與已發(fā)現(xiàn)的其它細胞因子沒有明顯的序列同源性。CKLF1在PHA刺激的U937細胞中的表達可被IL-10所部分抑制。重組的CKLF1能夠明顯趨化嗜中性細胞、單核細胞和淋巴細胞，同時，它能夠刺激小鼠骨骼肌細胞的增殖。以上結

2、果表明CKLF1可能在炎癥和骨骼肌再生過程中發(fā)揮重要作用。關鍵詞：白細胞介素10；骨骼肌細胞；剪切；抑制性減數(shù)雜交前 言細胞因子是一群在免疫和炎癥反應中起重要作用的小分子蛋白質(zhì)?？偟膩碚f，細胞因子在細胞被活化后呈一過性誘導表達，其表達受多種因素調(diào)控。細胞因子包括白細胞介素、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子等（1）。其中，趨化因子是結構相似的小分子蛋白質(zhì)，在吸引和活化白細胞過程中起重要作用。趨化因子在蛋白質(zhì)水平上含有4個保守的半胱氨酸，根據(jù)前兩個半胱氨酸的相對位置不同，趨化因子可分為CXC（）、CC（）、C（）和CX3C（）4個亞家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸（2）。以前的研究表明：人前

3、單核細胞系U937細胞在PHA刺激下，能夠產(chǎn)生多種細胞因子；而白細胞介素10能抑制多種細胞因子的產(chǎn)生（3）（4）?；谝陨涎芯拷Y果，我們設計了一條新的技術路線來發(fā)現(xiàn)新的細胞因子。利用抑制性減數(shù)雜交技術，從PHA刺激的U937細胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一個序列編碼一個新的分泌性細胞因子，含有CC家族趨化因子所具有的特征性結構即兩個連續(xù)的半胱氨酸，并對多種白細胞具有趨化作用，該因子被命名為趨化素樣因子1（CKLF1）。但是，該因子與其它CC家族趨化因子有如下區(qū)別：（1）CKLF1成熟蛋白質(zhì)只有一個連續(xù)的CC結構，其羧基端沒有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1與已發(fā)現(xiàn)的其它C

4、C家族趨化因子沒有明顯序列上的同源性； （3）CKLF1至少存在其它三種不同的RNA剪切形式；（4）它對骨骼肌細胞有刺激作用。CKLF1可能代表一個新的家族的趨化因子。因此，我們將其命名為趨化素樣因子1，其相應的變異體命名為CKLF2，CKLF3和CKLF4。材 料 和 方 法抑制性減數(shù)雜交（SSH）SSH的操作方法按Diatchenko報道的進行操作(5)， 用CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH技術把抑制性PCR(Suppression PCR)和傳統(tǒng)的減數(shù)雜交方法相結合(16)，可用于比較兩個群體的mRNA，得到在一組mRN

5、A中表達，而在另一組mRNA中低表達或不表達的基因。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中含有特異表達基因的樣本為tester，另一組為driver，tester和driver cDNA雜交，去除雜交體cDNA，沒有形成雜交體的cDNA即是在tester中特異表達或高表達的基因，而在driver中不表達或低表達的基因。抑制性PCR在選擇性擴增特異基因的同時，抑制自身的擴增，使雜交陽性率更高。在SSH操作過程中，人前單核細胞系U937細胞由本室長期傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清 ，100U/ml青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。用于SSH操作的U937細胞批量培養(yǎng)至2107細胞，離心收集細胞

6、, 用Hanks液洗三遍后懸于含10ng/mlPHA的10% FCS RPMI1640中, 其中一半即1107細胞作為tester, 另一半細胞中加入終濃度為100ng/ml的IL-10作為driver。繼續(xù)培養(yǎng)8小時后收集細胞， 提取mRNA，取2mgmRNA合成雙鏈cDNA，用RsaI切后，將tester分為兩組，在T4 DNA連接酶作用下，分別連上Adapter1和Adapter2，進行兩輪雜交，雜交產(chǎn)物用作PCR擴增的模板。將雜交產(chǎn)物稀釋1000倍，利用試劑盒提供的PCR引物，進行第一輪PCR，擴增27輪，然后將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍，分別以NESTED PCR引物1和 NESTE

7、D PCR引物2R進行第二輪PCR，擴增15輪，得到的擴增產(chǎn)物即為差異基因片段，Glassmilk回收2001600bp的片段，克隆到pGEM-T easy中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-Blue菌，選白色克隆。得到約100個克隆，隨機篩選15個變大明顯的克隆，純化質(zhì)粒DNA，用ALF快速測序儀進行序列分析，并在NCBI中進行序列同源性比較。生物信息學將來自PHA刺激的U937細胞文庫的EST片段與GenBank TBLASTN 的EST數(shù)據(jù)庫進行比較。將與CKLF1片段有高度同源性的序列（50個以上堿基，95%以上同源性），通過 EST Assembly Machine (http:/www.tige

8、m.it). 進行EST拼接（6）。用于CKLF1拼接的EST片段的登記號為 W38899, N95062, AA429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657, AA455042, AA989129, AF151058，NM-016951，W52820。在PHA刺激的U937細胞中得到CKLF1的全長序列，測序證明EST拼接正確。CKLF1可能的信號肽切割位點分析用PcGene、Prosite軟件和 Signal P server (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進行分

9、析。CKLF1的染色體定位用HTGS數(shù)據(jù)庫分析（）。包含CKLF1基因的兩個染色體片段的登錄號為AC010542和AC018557。Northern Blot分析我們對目的基因的表達情況進行了Northern Blot分析，細胞總RNA的提取用生命公司的TRIZ0LTM試劑提取。分別取20 mg tester或driver RNA，在1.5%的甲醛變性膠中電泳，通過毛細管吸引法將RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上。探針的標記和雜交操作參照DUPONT公司Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluor

10、escein-HRP (DuPont NEN NELMGC-803)試劑盒說明書。標記探針的核苷酸均為來源于SSH雜交得到的全長EST片段（CKLF1全長cDNA片段中的53-530位堿基）。寡核苷酸用于擴增CKLF1及其變異體的全長cDNA片段的引物為： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于擴增CKLF1及其變異體的編碼區(qū)cDNA片段以構建pCDI-CKLF1的引物為： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA

11、, AT 3和P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG, C 3； 用于擴增不含終止密碼的CKLF1及其變異體的cDNA片段，以構建pEGFP-N1-CKLF1, pEGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物為： P5 5 CGG GAT CCA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表達譜分析用巢式PCR的方法對CKLF1及其變異體在各種不同組織中的表達水平進行分析，用Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels試劑盒提供的單鏈cDNA文庫作模板，利用P1，P2

12、和P3，P4引物，進行PCR擴增。在第一輪PCR反應中，取1lcDNA文庫作模板，反應體系為25l，進行25個循環(huán)；在第二輪PCR反應中，取1l第一輪PCR產(chǎn)物作模板，反應體系為25l，進行20個循環(huán)。取10l第二輪PCR產(chǎn)物，在5%SDS-PAGE膠中電泳。質(zhì)粒構建為了對CKLF1， CKLF2和CKLF4的亞細胞定位進行研究，將去終止碼的相應序列克隆到表達載體pEGFP-N1中。用P3和P5引物，從PHA刺激的U937細胞cDNA文庫中，擴增CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA序列，在P5引物中，終止碼被去除，并引入BamH1酶切位點。PCR產(chǎn)物用Klenow酶處理為平端，然后用B

13、amH1酶切。pEGFP-N1載體先用EcoRI酶切，再用Klenow酶處理為平端，然后用BamH1酶切。酶切處理后的載體片段和目的基因片段回收后，連接得到重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4。用P3和P4引物從PHA刺激的U937細胞cDNA文庫中，擴增CKLF1的 ORF片段，克隆入pGEM-T載體中，測序。用EcoRI將插入片段釋放出來，連接至經(jīng)EcoRI切后，并用CIP處理后的pcDI載體中，經(jīng)酶切鑒定可得到CKLF-1的正義表達載體pcDI-CKLF1。pcDI是將pcDNA3的BglI-kpnI片段與pCI的BglI-Kp

14、nI片段置換后得到的一個真核表達載體（7）。轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染試劑在瞬時轉(zhuǎn)染中， COS-7細胞在10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。用SuperFect轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)說明轉(zhuǎn)染COS-7細胞。48小時后，收集轉(zhuǎn)染上清，用于活性分析和Western blot分析。細胞用PBS洗，甲醛固定30分鐘，再用PBS洗，熒光顯微鏡觀察。CKLF1-EGFP，CKLF2-EGFP，CKLF3-EGFP在COS-7細胞上清中的Western blot分析將pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞，48小時后，各取70l

15、細胞上清，進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至尼龍膜上，與抗EGFP多克隆抗體反應，再與HRP標記的二抗反應，用化學發(fā)光的方法進行檢測。趨化實驗按照以前報道的方法（8），從健康成年志愿者外周血中分離嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。純化的嗜中性粒細胞重懸于HBSS緩沖液中，細胞密度為1X106/ml；淋巴細胞和單核細胞重懸于含0.5%低內(nèi)毒素BSA和20mM Hepes的1640培養(yǎng)液中，細胞密度分別為5X106/ml和2X106/ml。細胞趨化實驗用48孔趨化小室，按照文獻報道的進行（9）。小孔的下面裝滿COS-7細胞的轉(zhuǎn)染上清，上面是各種不同類型的細胞。用于嗜中性細胞的聚炭膜孔徑為3m，趨化時

16、間為30分鐘；用于單核細胞和淋巴細胞的聚炭膜孔徑為5m，趨化時間為90分鐘。DNA注射和肌肉切片分析所有的實驗動物均購自北京大學醫(yī)學部實驗動物部。將100gpcDI-CKLF1或pcDI分別溶于100l生理鹽水中，取6-8周齡BALB/c小鼠，分別注射pcDI-CKLF1或pcDI于骨胳肌中，同時用40ms，80V電刺激，以提高質(zhì)粒的攝取量（10）。10天后，處死小鼠，將注射質(zhì)粒部位的肌肉取出。標本分為兩部分，一部分用于常規(guī)組織學處理，分別進行Feulgen，ANAE，POX和HE染色。另外一部分用于提取RNA，進行RT-PCR分析。 結 果差異顯示cDNA片段的獲得利用SSH技術，我們從PH

17、A刺激的U937細胞中得到了能被IL-10所抑制表達的cDNA序列。篩選了15個插入序列大于200個堿基的克隆，測序，并在Genbank公共數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)其中6個克隆包括CKLF1為新基因。Northern blot分析再次證明白細胞介素10能夠抑制CKLF1的表達，CKLF1約為600個堿基（見圖1）。 圖1. CKLF表達的Northern blot分析第2和第4泳道的RNA來自PHA刺激的U937細胞；第1和第3泳道的RNA來自PHA刺激同時IL-10抑制的U937細胞。CKLF1在PHA刺激的U937細胞中的表達可被IL-10部分抑制（第1和第2泳道）。CKLF1全長DNA序列克隆

18、及其編碼蛋白質(zhì)的特征通過SSH技術從PHA刺激的U937細胞中獲得的CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相對少見的加尾信號ATTAAA，人趨化因子Eotaxin和TARC的加尾信號也是ATTAAA（11，12）。這表明該片段包含完整的3非翻譯區(qū)（13，14）。該片段有一個編碼99個氨基酸的完整開放讀碼框架，96-98位為翻譯起始密碼ATG，其周邊序列為GCGATGG，符合Kozak規(guī)律（15）。在Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)，CKLF1為一個新基因；但是EST數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),來自不同cDNA文庫的多條EST序列與我們得到的序列部分相同或高度同源。通過EST延伸技術，在CKLF1原有cDNA序列

19、基礎上，向5非翻譯區(qū)延長了52個堿基。Northern blot顯示CKLF1與預期的大小基本相符。為證明EST拼接是否正確，我們設計了引物P1和P2，從PHA刺激的U937細胞中成功得到CKLF1的全長cDNA序列，DNA序列分析表明我們的EST拼接是正確的。CKLF1的全長cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列如圖2A所示（CKLF1在GenBank中的登錄號為AF096895）。 圖2. CKLF1的核酸和相應的蛋白質(zhì)序列及其與TARC和STCP-1的序列比較（A）CKLF1的核酸和蛋白質(zhì)序列。核酸序列為正義鏈，從5到3方向。核酸序列下為相應的蛋白質(zhì)序列，終止碼用星號表示。（B）CKLF1的蛋

20、白質(zhì)序列與CC家族趨化因子TARC和STCP-1的比較。加深的為保守的氨基酸。CKLF1編碼的蛋白質(zhì)含有99個氨基酸，分子量為10.9KDa，為高度堿性的疏水性蛋白質(zhì)。CKLF1蛋白沒有N糖基化位點，SignalP分析發(fā)現(xiàn)沒有典型的信號肽切割位點（16，17），轉(zhuǎn)基因分析和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，CKLF1可被分泌到細胞上清中。其他實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，一些沒有前導序列的蛋白質(zhì)能被分泌出來，如乳腺來源的生長抑制因子，白細胞介素1和巨噬細胞移動抑制因子2等（18）。因此，CKLF1可能利用另外一種分泌機制。CKLF1在蛋白質(zhì)水平上僅與線蟲的amino acid permease蛋白有低水平

21、的同源性，與其它蛋白質(zhì)沒有明顯的同源性。CKLF1蛋白具有兩個結構特性：（1）CKLF1僅有三個半胱氨酸，最后兩個連續(xù)排列，具有CC家族趨化因子的結構特征；（2）BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，CKLF1與其它CC家族趨化因子之間沒有明顯同源性。但是，手工排列發(fā)現(xiàn)，CKLF1與兩個位于16號染色體上CC家族趨化因子TARC和STCP-1在CC附近有數(shù)個關鍵的氨基酸相同（圖2B所示）。CKLF1三個變異體的克隆化通過RT-PCR技術，我們從PHA刺激的U937細胞中得到CKLF1的全長cDNA序列，同時，得到了其它三條片段，經(jīng)克隆化和序列分析后，發(fā)現(xiàn)它們?yōu)镃KLF1的三種變異體，分別命名為CKLF2（AF1

22、35380），CKLF3（AF135381）和CKLF4（AF145216）。在PHA刺激的U937細胞中，CKLF1比CKLF2，CKLF3和CKLF4的表達水平高，且該基因的表達可被IL-10所抑制，因此Northern Blot檢測時只看到一條帶，可能因為其它變異體豐度較低，Northern Blot敏感度不夠而未能檢測到。讀碼框架分析表明：CKLF-2 、CKLF-3和CKLF-4分別編碼152個氨基酸， 67個氨基酸和120個氨基酸，它們與CKLF1有相同的氨基端和羧基端， 中間27-112為氨基酸不同， 但都有CC結構。用編碼最多氨基酸的CKLF2作參照， CKLF1，CKLF3和

23、CKLF4分別缺失27-79，27-111，80-111位氨基酸（圖3所示）。 圖3. CKLF1、CKLF2、CKLF3和CKLF4的蛋白質(zhì)序列圖4.人CKLF基因內(nèi)含子和外顯子交界處序列及CKLF1，2，3，4結構示意圖（A）人CKLF基因內(nèi)含子和外顯子交界處序列。外顯子序列用大寫字母表示；內(nèi)含子序列用小寫字母表示。（B）CKLF對外顯子的選擇性應用及CKLF1，2，3，4的結構示意圖。CKLF1與其變異體有相同的氨基端和羧基端。在CKLF2蛋白質(zhì)的基礎上，CKLF1，CKLF3和CKLF4選擇性用27-79，27-111和80-111位氨基酸。下劃線序列指CKLF2和CKLF4可能的穿膜

24、區(qū)序列CKLF基因定位和結構通過檢索HTGS數(shù)據(jù)庫，將CKLF2全長cDNA序列與人類基因組工作草圖相比較，我們發(fā)現(xiàn)兩個位于16號染色體上的片段與其有高度同源性。CKLF基因包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。內(nèi)含子和外顯子交界處的序列符合真核細胞剪接規(guī)律（圖4A）（19）。CKLF基因與cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)，外顯子1，2，3，4分別編碼1-26，27-79，80-111，112-152位氨基酸（圖4B）。CKLF1，2，3，4有共同的外顯子1和4，選擇性擁有外顯子2和3。因此，它們?yōu)橥换虻牟煌艚有问健KLF1 mRNA在不同組織中的表達CKLF1 mRNA在PHA刺激的U937細胞中存在不同

25、的變異體形式。我們用RT-PCR技術分析了CKLF1及其變異體在成年及胚胎組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)：CKLF1及其變異體在脾臟、肺、睪丸、卵巢、外周血白細胞、胎盤、胰腺、胎腦、胎兒骨胳肌和心臟中高表達；成年人骨胳肌、肝臟、胸腺、結腸、前列腺、胎脾和胎肝中表達水平較低；而在成年人腦組織、腎臟、心臟、小腸、胎肺和胎腎中的表達幾乎檢測不到。在絕大多數(shù)組織中，CKLF1和CKLF2的表達水平相類似，均比CKLF4的表達水平高，而CKLF3的表達水平最低（圖5所示）。 圖5.人CKLF1及其變異體在各種組織中的分布（A）CKLF及其變異體在胚胎組織中的表達。（B）CKLF及其變異體在成年組織中的表達。

26、左邊顯示的分子量標準。CKLF1，CKLF2和CKLF4的亞細胞定位為了研究CKLF1，2，4的細胞定位，我們構建了CKLF-EGFP融合表達載體，EGFP在CKLFcDNA序列的下游，二者位于同一讀碼框架。將融合表達載體和空載體對照分別轉(zhuǎn)染COS-7細胞。熒光顯微鏡下觀察熒光的分布。表達對照EGFP的細胞有分布均勻的亮綠色熒光，在細胞內(nèi)沒有特異性亞細胞定位（圖6A）；而轉(zhuǎn)染CKLF1-EGFP的細胞，細胞內(nèi)熒光很弱（圖6B）?；贑KLF1的結構特征，可以推測大部分CKLF1-EGFP蛋白可能被分泌到細胞培養(yǎng)上清中。相反，CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP主要位于細胞邊緣，在細胞的其

27、它位置，僅有很少的熒光分布（圖6C和6D）。轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，也得到相似的結果，這表明CKLF1，CKLF2和CKLF4的亞細胞定位不僅局限于COS-7細胞。圖6.EGFP、CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP融合蛋白的亞細胞定位EGFP位于CKLF1，CKLF2和CKLF4的羧基端，它們在同一讀碼框架上，瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，熒光顯微鏡觀察。（A）轉(zhuǎn)染EGFP對照。（B）轉(zhuǎn)染CKLF1-EGFP。（C）轉(zhuǎn)染CKLF2-EGFP。（D）轉(zhuǎn)染CKLF4-EGFP。放大倍數(shù)為400倍。CKLF1為分泌性表達從CKLF1的亞細胞定位結果來看，我們推測CKLF1可能

28、為分泌性表達。為證明這一點，收集COS-7細胞轉(zhuǎn)染上清，進行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。Western blot表明在pcDI-CKLF1-EGFP轉(zhuǎn)染細胞中，有一條約38KD的特異表達帶，分子量與CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（圖7）。而在其它三組轉(zhuǎn)染上清中，沒有檢測到特異的表達帶。因此，我們可以得出以下結論：雖然CKLF1的信號肽尚有待確定，但CKLF1為分泌性蛋白，在細胞上清中檢測不到CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP的存在。而且，計算機分析發(fā)現(xiàn)，CKLF2和CKLF4的27-79位氨基酸為高度疏水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。將CKLF2序列遞交到Gen

29、Bank后，發(fā)現(xiàn)了其他兩個實驗室克隆的序列，與CKLF2有相同的讀碼框架，其中一個的登錄號為AF057306，被認為是穿膜蛋白脂，這提示CKLF2可能是穿膜蛋白。圖7.應用抗EGFP多克隆抗體，在COS-7細胞上清中檢測CKLFs/EGFP。第一泳道：高分子量蛋白質(zhì)標準；第二泳道：EGFP；第三泳道：CKLF1/EGFP；第四泳道：CKLF2/EGFP；第五泳道：CKLF4/EGFP重組CKLF1在體外的趨化活性為了研究CKLF1的生物學活性，我們構建了CKLF1真核表達質(zhì)粒pcDI-CKLF1，該質(zhì)粒包括CKLF1的完整讀碼框架。我們將pcDI-CKLF1和空載體pcDI分別轉(zhuǎn)染COS-7細

30、胞，收集細胞上清，進行趨化活性分析。重組CKLF1的趨化活性分析用穿孔移動分析法，趨化活性用趨化指數(shù)表示（趨化指數(shù)是指pcDI-CKLF1轉(zhuǎn)染細胞上清組的細胞數(shù)與空載體pcDI轉(zhuǎn)染細胞上清組的細胞數(shù)的比值）（20）。與pcDI轉(zhuǎn)染細胞上清相比較，pcDI-CKLF1轉(zhuǎn)染細胞上清對人中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞有明顯的趨化活性（圖8所示）。我們在果蠅S2細胞系統(tǒng)中得到相似的實驗結果，這說明CKLF1的趨化活性不僅局限于COS-7細胞系統(tǒng)。CKLF1體內(nèi)趨化活性我們將pcDI-CKLF1裸質(zhì)粒注射到BALB/c小鼠肌肉中，10天后，取注射部位肌肉組織，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)CKLF1的表達水平較高

31、；同時，肌肉縱切，F(xiàn)eulgen染色，發(fā)現(xiàn)與空載體對照組相比，注射pcDI-CKLF1裸質(zhì)粒的小鼠肌肉切片中有更多的細胞浸潤。這表明CKLF1能引起白細胞的聚集或能刺激干細胞的增殖或二者兼而有之。為進一步驗證CKLF1的體內(nèi)趨化活性，我們又對部分肌肉切片進行POX或ANAE染色，然后用HE復染（21）。如圖9D和圖9F所示，許多細胞呈POX或ANAE強陽性，而在圖9C和圖9E中，沒有發(fā)現(xiàn)相應的陽性細胞。眾所周知，POX陽性細胞主要是嗜中性粒細胞，而ANAE陽性細胞主要為單核細胞和T淋巴細胞（22）。在細胞染色的基礎上，結合形態(tài)學觀察，CKLF1在體內(nèi)能夠趨化嗜中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，這

32、與CKLF1的體外趨化活性一致。圖8.CKLF1對白細胞的趨化作用將人外周血淋巴細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞置于趨化小室中，下面孔中加入不同稀釋度的COS-7細胞轉(zhuǎn)染上清。在高倍鏡下，隨機選5個視野，計數(shù)穿膜細胞的數(shù)量。CI：趨化指數(shù)。 圖9.小鼠肌肉內(nèi)注射pcDI-CKLF1引起的白細胞浸潤A、C、E為注射pcDI組小鼠；B、D、F為注射pcDI-CKLF1組小鼠。注射質(zhì)粒10天后，取肌肉組織，作組織切片。D和F中可見白細胞浸潤。CKLF1在體內(nèi)引起骨胳肌的形態(tài)學改變將肌肉組織固定后，分別作縱切片和橫切片，HE染色。在表達CKLF1的肌肉組織中，除了觀察到多細胞浸潤現(xiàn)象外，還發(fā)現(xiàn)了肌肉組織的

33、形態(tài)學改變，如圖10所示。在橫切面中，CKLF1組有細胞核居中現(xiàn)象（圖10B），而對照組沒有這種現(xiàn)象（圖10A）；在縱切面中，CKLF1組細胞核成串珠狀排列（圖10D）。這種現(xiàn)象說明肌衛(wèi)星細胞被活化，肌肉處于再生狀態(tài)（23）。目前，尚需進一步的實驗來證明這是CKLF1的直接作用還是由被趨化細胞產(chǎn)生的細胞因子導致的結果。圖10.CKLF1對BALB/c小鼠骨胳肌的作用裸質(zhì)粒注射后10天，取肌肉組織，作縱切片和橫切片，HE染色，200倍放大后鏡檢。表達CKLF1的肌組織切片中（B，D），可明顯觀察到肌纖維再生，即核居中現(xiàn)象。而在對照組肌肉切片中，無細胞核居中現(xiàn)象。討 論我們通過一種新的技術路線，成

34、功地克隆了新細胞因子CKLF1及其三種變異體。應用這條技術路線，把其它的細胞因子產(chǎn)生細胞和細胞因子合成抑制抑制因子結合起來，可發(fā)現(xiàn)更多新的細胞因子。CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF3-EGFP轉(zhuǎn)染COS-7細胞和HEK-293細胞的結果表明，CKLF1是分泌性蛋白質(zhì)，而CKLF2和CKLF4為穿膜蛋白。根據(jù)計算機分析結果，我們推測CKLF1的另外一個變異體CKLF3可能與CKLF1相同，為分泌性表達，目前這部分工作正在研究之中。令人感興趣的是，CKLF1的不同變異體可為分泌性表達，也可為跨膜蛋白。有人報道，新的CC家族趨化因子Eskine，由于選擇性應用5外顯子，而造成兩種

35、不同的變異體，其中之一為分泌性表達，另一種定位于細胞核（24）。對CKLF1的不同變異體而言，不同的表達形式可能是由于對27-79這段高疏水性氨基酸的選擇性應用有關。從CKLF1的結構上來看，CKLF1有三個半胱氨酸，最后兩個連續(xù)排列，呈CC家族趨化因子的特征性結構，第一個半胱氨酸可能位于信號肽內(nèi)。CKLF1與其它趨化因子的不同之處在于它的羧基端沒有其它的半胱氨酸。CKLF1基因定位于16號染色體，與CC家族趨化因子TARC和STCP-1有低水平的同源性（25）。在目前發(fā)現(xiàn)的所有CC家族趨化因子中，只有TARC和STCP-1定位于16號染色體上，其它絕大多數(shù)CC家族趨化因子位于17染色體上。F

36、RN是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種CX3C趨化因子，也是唯一一種膜結合型趨化因子，同樣定位與16號染色體（25）。重組的CKLF1在體內(nèi)外均具有廣譜的趨化活性， 我們認為CKLF1可能代表一個新的家族的趨化因子，它與TARC、STCP-1和FRN在進化上可能有一定的保守性。在小鼠肌肉中表達重組的CKLF1，可刺激肌肉細胞的增殖和分化，這與IGF-1對成年小鼠趾長伸肌的作用一致（27）。我們推測CKLF1可能通過以下幾種機制來調(diào)控骨胳肌細胞的再生：第一，與IGF-1相同，CKLF1本身能夠調(diào)控肌衛(wèi)星細胞的增殖和分裂；第二，CKLF1趨化的白細胞能夠產(chǎn)生多種細胞因子，這些細胞因子能夠影響肌細胞的生長；第三，

37、CKLF1與其它細胞因子具有協(xié)同作用，刺激肌細胞的再生和肌管的形成。目前，尚需進一步的實驗來證明我們的推測?？傊覀兂晒Φ乜寺×艘粋€新的細胞因子及其三種變異體。CKLF1的表達水平可被IL-10所部分抑制。功能實驗證明，CKLF1具有廣譜的趨化活性，并能刺激骨胳肌細胞的增殖和分化。致謝：感謝懷特博士對CKLF1命名所提的建議；感謝李凌松博士協(xié)助論文修改；感謝黃大無和鐘英誠在照片處理過程中所提供的幫助；感謝范中玉對論文的輸入所做的工作。這項研究工作是由國家863和973基金支持。參 考 文 獻1. Nicola, N. A., Walter and Hall, E. (1994) Guideb

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