小鼠胸腺樹突狀細胞的形態(tài)學觀察

1、    小鼠胸腺樹突狀細胞的形態(tài)學觀察        【摘要】目的觀察小鼠胸腺樹突狀細胞(TDC)的形態(tài)。方法密度梯度離心結合小鼠CD5單抗淘洗法(panning)，分離出小鼠TDC并行光鏡及電鏡觀察。結果臺盼藍排斥試驗示90%以上細胞存活。光鏡下發(fā)現(xiàn)初分離的TDC常和周圍的胸腺細胞形成緊密的細胞簇。S-100蛋白染色見 TDC胞體和突起內有棕黃色反應產(chǎn)物。ANAE反應呈陰性或在核附近有數(shù)個小顆粒反應。ATP酶反應陰性。電鏡見細胞表面有許多樹狀突起，核形不規(guī)則，胞質電子密度低

2、，有豐富的線粒體、核糖體及完整的高爾基復合體。結論所分離的TDC具有典型的樹突狀細胞的形態(tài)學特征。【關鍵詞】樹突狀細胞；胸腺；細胞化學；電鏡；小鼠【中分類號】R322.5+3【文獻標識碼】A【文章編號】0529-1356(2000)04-375 THE MORPHOLOGY STUDY OF MOUSE THYMICDENDRITIC CELLSDING Bei-beiMIAO Ji-wuYANG NingYIN Lan-zhen（Department of Histology and Embryology）SONG Ji-zhi（Laboratory of Electron Microsco

3、pe, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, China）【Abstract】Objective To observe the morphology of mouse thymic dendritic cells(TDC). Methods TDCs were isolated from thymic suspension by Ficoll-Hypaque gradients and Percoll gradients of different densities followed by Panning procedure with

4、 anti-CD5 monoclonal antibodies. The cells in the TDC-enriched fraction were assayed. Results There were more than 90% of surviving cells in this fraction. It was found that TDC could contact and cluster with thymocytes. S-100 reaction product was detected primarily in the cytoplasm and cytoplasmic

5、processes of these cells. In the ANAE reaction, some cells were negative, and some contained small cluster of positive tiny granules located closely to the nucleus. The ATPase activity was negative. Most cells exhibited many bulbous protrusions. The nucleus was irregular in shape. The cytoplasm was

6、often electron-lucent, but contained large amount of free ribosomes, mitochondria and well-developed Golgi complexes. Conclusion The obtained TDCs had the classical morphology of dendritic cells.【Key words】 Dendritic cells; Thymus; Cytochemistry; Electron microscope; Mouse樹突狀細胞是一種重要的免疫輔助細胞，對T細胞免疫反應的

7、建立起著至關重要的作用。胸腺樹突狀細胞(thymic dendritic cell, TDC)能較強地遞呈各種內源性及外源性抗原，促進胸腺細胞增殖、刺激混合淋巴細胞反應；參與胸腺細胞的陰性選擇、形成自身免疫耐受，與自身免疫性疾病有密切關系。TDC含量極少，占胸腺細胞總數(shù)的0.05%0.07%1，原位研究較困難，很有必要做分離培養(yǎng)體外研究。本研究采用Percoll密度梯度離心結合小鼠CD5單抗淘洗法(Panning)分離出小鼠TDC，并對分離的細胞進行光鏡及電鏡觀察，為進一步研究其功能提供形態(tài)學資料。材料和方法1. 動物昆明種小鼠40只，5周齡，體重介于2025 g之間，雌性。2. 主要試劑膠原

8、酶(型，Sigma)，F(xiàn)icoll-Hypaque分離液(1.0781.080)，Percoll分離液(Pharmacia)，RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco),verapamil(江蘇興化制藥廠)，大鼠抗小鼠CD5單抗(Sigma),兔抗牛S-100蛋白抗體(Dako)，-醋酸萘酯(Sigma)，ATP(Sigma)。3. TDC分離純化小鼠頸椎脫臼致死，取胸腺用分離針撥成1mm3組織塊，置含膠原酶1.6 g/L消化液中，37，60 min。洗去消化液，在細胞懸液中加verapamil(5×10-2g/L)使細胞進一步分散。依次進行Ficoll密度梯度離心及Percoll密度梯

9、度離心(1.078、1.062)，細胞濃度分別為1.0×107/ml及1.5×107/ml。用濃度為25 mg/L小鼠CD5單抗包被96孔克隆板，加入濃度為0.5×107/ml細胞懸液，室溫靜置1h。輕輕吹下未粘附的細胞即為進一步純化的TDC。詳見參考文獻5。4. 光鏡標本制備4.1瑞氏染色：瑞氏染液固定1 min，加蒸餾水混勻，染色10 min，流水沖洗。4.2S-100蛋白免疫染色(ABC法)：細胞涂片經(jīng)冷丙酮固定后，用0.3%的過氧化氫甲醇溶液去除內源性過氧化物酶，以1.5%的正常羊血清封閉，第一抗體為兔抗牛S-100蛋白(1：200)，37 孵育60 mi

10、n，二抗為生物素化羊抗兔IgG(1200)，作用30 min，親和素及生物素-辣根過氧化物酶復合物(1100)結合30 min，H2O2、DAB顯色。以大鼠頜下腺石蠟切片作陽性對照。蘇木素復染5 min。4.3ANAE染色：孵育液pH：6.40，37 ，3 h，水洗。2%甲基綠復染10 min。抽去底物以蒸餾水作對照。4.4ATP酶染色：孵育液pH：5.00，37 ，2 h，分別經(jīng)醋酸及硫化銨各作用1 min，水洗。甲基綠復染10 min。抽去底物以蒸餾水作對照。5. 電鏡標本制備將純化的細胞懸液棄上清加入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛電鏡固定液并將細胞打散，作用45 min后，再以1 800&

11、#215;g離心10 min。鋨酸后固定，逐級丙酮脫水，Epon812包埋，超薄切片(50nm)，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，H-600型電鏡觀察。結果和討論1. 光鏡下觀察光鏡下臺盼藍排斥試驗，細胞活率在90%以上。1.1瑞氏染色見細胞體積較大，核形態(tài)不規(guī)則(1)。1.2S-100蛋白免疫染色：初分離的TDC常和周圍的胸腺細胞形成緊密的細胞簇(2)。胞質和突起內呈現(xiàn)彌漫或顆粒狀棕黃色反應產(chǎn)物者為S-100蛋白陽性細胞(即TDC)，占細胞總數(shù)的75%90%(3)。1.3ANAE染色：單核細胞和T細胞呈陽性，見胞質內有彌散狀或顆粒狀紅色反應物：TDC呈陰性或在核附近有數(shù)個小顆粒反應(4)。1.4ATP

12、酶染色：所有細胞均呈陰性。2. 電鏡下觀察電鏡下TDC如淋巴細胞大小或稍大，形態(tài)不規(guī)則，有較多樹狀突起。核形不規(guī)則，核周可見少量異染色質(5)。胞質電子密度低，含豐富的游離核糖體及高爾基復合體，有數(shù)量不等的管泡狀結構，未見溶酶體、張力原纖維、橋粒及伯貝克顆粒(Birbeck granule,BG)(6)。從觀察結果可看出，TDC和外周樹突狀細胞有很多相似之處，主要有：(1)形態(tài)學特征：細胞形態(tài)不規(guī)則，有較多細長的突起；核質比例大，核形態(tài)不規(guī)則，胞漿內富含游離核糖體、線粒體，有完整的高爾基復合體。(2)組織化學染色特征：兩者S-100蛋白染色均呈陽性；ANAE染色陰性或弱陽性；ATP酶染色陰性。

13、然而，TDC還有其特殊性。(1)TDC含量甚少，僅占胸腺細胞總數(shù)的0.05%0.07%1。(2)TDC更易與周圍的胸腺細胞形成細胞簇2，正是這些細胞簇的形成構成了TDC陰性選擇功能的形態(tài)學基礎。(3)已證實外周樹突狀細胞(如朗罕細胞等)存在伯貝克顆粒，而伯貝克顆粒是否存在于TDC中，還有待進一步研究。實驗中發(fā)現(xiàn)無論在體內還是體外，TDC極易與周圍的胸腺細胞形成緊密的細胞簇，與國外報道一致2。目前認為，細胞簇的形成與胸腺細胞的陰性選擇有關2。近年來發(fā)現(xiàn)胸腺細胞表面分子與TDC表面配體形成許多分子對(molecular couple)，如細胞內粘附分子1(intercellular adhesio

14、n molecule 1, ICAM-1)-淋巴細胞功能相關分子1(leukocyte function-associated molecule,LFA-1)、Fas(apo-1,CD95)-FasL及CD40-CD40L等。目前猜想這些分子對與協(xié)同刺激的調節(jié)、處女型T淋巴細胞的激活、一些免疫反應的啟動(如MHC限制性T淋巴細胞的致敏)、抗感染及抗腫瘤、器官移植物的排斥以及T細胞依賴性抗體的形成等都有密切關系3。所以，進一步弄清細胞簇形成的分子機制及其相應的功能具有十分深遠的意義。目前對TDC是否存在伯貝克顆粒仍存在爭論。伯貝克顆粒是細胞膜結構的延伸，曾被認為是郎罕細胞所特有的細胞器，與受體介

15、導的細胞攝粒作用有關。我們分離的小鼠TDC未見伯貝克顆粒?？紤]原因主要為：幼稚樹突狀細胞(如郎罕細胞)需要伯貝克顆粒發(fā)揮其攝取和處理抗原功能，而成熟樹突狀細胞(如TDC等)的功能主要表現(xiàn)為抗原遞呈，此時伯貝克顆粒呈“廢用性消失”4。分離獲得的細胞90%以上仍然存活，S-100蛋白檢測TDC純度達75%90%，說明分離方法切實可行，詳細步驟見另文5。郭仁強教授為本文提出寶貴意見，特此致謝!本文16見插第15頁    1瑞氏染色觀察細胞形態(tài)。箭頭示TDC，見細胞體積較大，核形態(tài)不規(guī)則。標尺示20mFig.1 Wright staining of fresh

16、isolated cells. Note large cell with irregular nucleus().Bar=20m    2初分離細胞S-100蛋白免疫染色，見TDC和胸腺細胞聚集成簇，形成“花環(huán)”。中間()為TDC，其四周()為胸腺細胞。標尺示10mFig.2 S-100 protein staining of fresh isolated cells. TDC()contact and cluster with thymocytes(),formed thymic rosettes. Bar=10m   &

17、#160;3分離細胞S-100蛋白免疫染色，蘇木素復染。見TDC()呈陽性，其四周的胸腺細胞()呈陰性。標尺示10mFig.3 S-100 protein staining of enriched cells, counterstained with haematoxylin. TDC()appeared positive while the thymocytes() appeared negative. Bar=10m    4ANAE染色示TDC呈陰性或弱陽性反應()，巨噬細胞呈強陽性反應()。標尺示10mFig.4 Acid non-specifi

18、c esterase staining of enriched cells. Three TDC() appeared negative or contained small cluster of positive tiny granules located closely to the nucleus while the macrophages() are intensely stained. Bar=10m    5電鏡下示TDC有細長的突起()，核不規(guī)則，胞漿內見較多的線粒體及游離核糖體。標尺示1mFig.5 Ultrastructural mic

19、rograph of a TDC. Note several cytoplasmic processes () and a large, very irregular nucleus. The cytoplasm was electron-lucent, but contained large amount of free ribosomes and mitochondria. Bar=1m    65的局部放大，TDC胞漿內有豐富的線粒體()及核糖體，可見發(fā)達的高爾基復合體()。標尺示0.5mFig.6 A higher magnification o

20、f Fig.5 showing details of large amount of free ribosomes, mitochondria() and Golgi complex() in this cell. Bar=0.5m【作者簡介】丁蓓蓓(1972)，女(漢族)，江蘇沭陽人，博士，現(xiàn)在上海市計劃生育研究所生殖生物學研究室，郵政編碼：200032丁蓓蓓（南京鐵道醫(yī)學院組織學胚胎學教研室）繆繼武（南京鐵道醫(yī)學院組織學胚胎學教研室）宋繼志（電鏡室，南京210009）楊寧（南京鐵道醫(yī)學院組織學胚胎學教研室）尹蘭珍（南京鐵道醫(yī)學院組織學胚胎學教研室）參考文獻1Ardavin C, Shortman K. Cell surface marker analysis of mouse thymic dendriti