高蛋白酶活性地衣芽孢桿菌熱帶菌種的篩選與鑒定

1、文章編號(hào)：1674-7054（2010）02-0000-00高蛋白酶活性的地衣芽孢桿菌熱帶菌種的篩選與鑒定陳圣豐1，林 欽2，周永燦1，歐陽吉隆1，王世鋒1，謝珍玉1（1. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；2.中國水產(chǎn)科學(xué)院 南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；）摘 要：從海南省文昌市、?？谑械暮ＫB(yǎng)殖池和天然海域中采集的海水與底泥樣品中中分離和篩選出13株具有高蛋白酶活性的地衣芽孢桿菌菌株，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、標(biāo)準(zhǔn)生理生化分析和16S rDNA測序，確定所獲得菌株均為野生型熱帶種地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。關(guān)

2、鍵詞：地衣芽孢桿菌；高蛋白酶活性；熱帶種；篩選中圖分類號(hào)：Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）能產(chǎn)生高效的胞外蛋白酶1、脂肪酶2和淀粉酶3等生物活性物質(zhì)。近年來，地衣芽孢桿菌作為一種生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，它和其他種類的芽孢桿菌、光合細(xì)菌等有益微生物共同作用，可有效改善養(yǎng)殖水質(zhì)，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的生長和發(fā)育4, 5。地衣芽孢桿菌為多種污水和有機(jī)物無害化處理的常用菌種，也是重要的蛋白改性和助消化的有益微生物，受到國內(nèi)學(xué)者的廣泛關(guān)注。如杜珍輝等將地衣芽孢桿菌工業(yè)菌株應(yīng)用于豬糞液的無害化處理9；李紅梅等研究了丹麥的地衣芽孢桿菌菌株的堿性蛋白

3、酶對(duì)玉米蛋白改性的作用10；劉波等人研究了美國的地衣芽孢桿菌菌株對(duì)魚類消化功能的影響11；謝航等人研究了從福建土壤中分離的地衣芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體中殘余餌料的降解特性12。但國內(nèi)學(xué)者的研究均未涉及地衣芽孢桿菌的熱帶地理種群的應(yīng)用研究。筆者采用脫脂牛奶平板法，從海南省文昌市、?？谑械乃a(chǎn)養(yǎng)殖池和天然海域中采集的海水與底泥樣品中分離和篩選出具有高蛋白酶活性的菌株，并用表型鑒定和16S rDNA序列分析等方法對(duì)所分離的菌株進(jìn)行鑒定，為熱帶海水養(yǎng)殖的水質(zhì)凈化提供高效的土著菌種參考菌株。1 材料與方法1.1材 料 樣品 用于分離篩選芽孢桿菌的樣品為筆者于2008年12月和2009年5月從海南省文昌市、海口

4、收稿日期:2010-04-08資助項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2009GB2E200302）；科技人員服務(wù)企業(yè)項(xiàng)目（2009GJE20024）；海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目（090501）；農(nóng)業(yè)部漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室和廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2007-10）.作者簡介：陳圣豐(1983)，男，海南萬寧人，海南大學(xué)海洋學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)2007級(jí)碩士研究生.通信作者：謝珍玉(1974)，男，江西吉安人，海南大學(xué)海洋學(xué)院博士、副教授. E-mail: xiezyscuta市的水產(chǎn)養(yǎng)殖池和天然海域中采集的海水和底泥樣品。對(duì)照菌株為目前海南水產(chǎn)養(yǎng)殖中2種常見的有益微生物制劑所分離的菌株。 培養(yǎng)

5、基 芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基配比：胰蛋白胨 5 g.L-1、酵母浸膏 2.5 g.L-1、葡萄糖 1 g.L-1、瓊脂13 g.L-1、NaCl 70 g.L-1、pH 7.5。普通海水液體培養(yǎng)基配比：酵母浸膏 1 g.L-1、牛肉膏 3 g.L-1、蛋白胨 5 g.L-1、NaCl 30 g.L-1，pH 7.5。普通海水固體培養(yǎng)基配比：在普通海水液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入瓊脂 13 g.L-1， pH 7.5。 試劑 固定液：=10%的三氯乙酸。染色液：乙醇45 mL、冰乙酸10 mL、考馬斯亮蘭G-250 0.25 g、蒸餾水45 mL。脫色液：乙醇50 mL、冰乙酸75 mL、蒸餾水875 mL

6、。1.2方 法菌種分離 參考文獻(xiàn)6方法制備芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基。海水樣品經(jīng)搖勻后，取100 L均勻涂布于芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基上，(50±1) 培養(yǎng)24 h，挑取表面粗糙、皺褶的乳白色單菌落為初篩的目標(biāo)菌株。對(duì)底泥樣品和市售的有益微生物制劑產(chǎn)品分別加適量滅菌海水充分均勻后進(jìn)行分離，分離方法同上。菌種保藏 分別將初篩的326株目標(biāo)單菌落接種于普通海水液體培養(yǎng)基，37 培養(yǎng)24 h，按1：1比例分別將菌液和=80%無菌甘油加入保種管，-80 長期保存?zhèn)溆?，每?管。 高蛋白酶活性菌株的篩選 目標(biāo)菌株培養(yǎng)液的制備：用接種環(huán)挑取初篩的326株目標(biāo)菌株，分別接種于普通海水液體培養(yǎng)基中，30 18

7、0 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，6 000 r·min-1離心10 min，收集上清液各10 mL，并用0.20 m濾膜過濾除菌，獲得目標(biāo)菌株培養(yǎng)液，-20 保存?zhèn)溆?。脫脂奶平板法測定蛋白酶活：配制含=5%無菌脫脂牛奶的滅菌海水瓊脂平板，用直徑4 mm的打孔器在平板上均勻打孔，孔間距為25mm。在孔內(nèi)加入20 L目標(biāo)菌株培養(yǎng)液。以等量的10 mg. L-1蛋白酶K和從市售有益微生物制劑產(chǎn)品中分離獲得菌株的培養(yǎng)液為陽性對(duì)照，無菌海水為陰性對(duì)照。30 下孵育24 h，=10%三氯乙酸固定2 h，去除固定液后染色液染色，直至平板培養(yǎng)基充分著色，去除染色液后用脫色液充分脫色，使

8、平板背景呈藍(lán)色而水解圈為無色。用游標(biāo)卡尺測量水解圈直徑。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)。繼代培養(yǎng)：將經(jīng)篩選的具有高蛋白酶活性（菌株培養(yǎng)液的水解圈較大）的菌株P(guān)b-WC09005，在高溫(50±1)，高鹽NaCl 70 g.L-1的選擇條件下進(jìn)行20代繼代培養(yǎng)，測定第20代菌株培養(yǎng)液的水解圈直徑。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)。 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS（Statistical Program for Social Sciences）的方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。1.2.5 高蛋白酶活性菌株的鑒定 表型鑒定：以廣東省微生物研究所生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌ATCC11091和ATCC11946共2株標(biāo)

9、準(zhǔn)菌株作對(duì)照，測定各分離的高蛋白酶活性菌株的形態(tài)與生理生化特征，按文獻(xiàn)7進(jìn)行鑒定，并參閱文獻(xiàn)8確定屬或種。16S rDNA序列測定：利用細(xì)菌16S rDNA通用引物Pf：5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3和Pr：5- GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3（由上海生物工程公司合成）對(duì)高蛋白酶活性菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 500 bp的片段。PCR反應(yīng)體系為：Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U.L-1，含Mg2+)0.3 L，dNTP 4 L，10×PCR 緩沖液5 L，正向引物Pf（10 mol.L-1）5 L，反向引物Pr（10

10、 mol.L-1）5 L，DNA模板2 L，加超純水至總體積50 L。樣品送至invitrogen廣州分公司測序。將獲得的序列提交到Genbank，利用在線軟件Blastn 2.0與該文庫中的序列比對(duì)，同時(shí)采用DNAstar 7.0軟件與從GenBank中獲得的同源性最高的25株細(xì)菌16S DNA 序列進(jìn)行多序列匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。2 結(jié) 果 2.1 菌種分離 從采集的樣品中分離獲得目標(biāo)菌株 326 株，從2種市售有益微生物制劑產(chǎn)品中共分離獲得目標(biāo)菌株2株。2.2高蛋白酶活性菌株的篩選 經(jīng)蛋白酶活測定，確定高蛋白酶活性菌株共13株，各菌株的編號(hào)和來源以及其蛋白酶活性見表1，各菌株蛋白酶活

11、性由高到低依次為：Pb-WC09005Pb-WC09002Pb-WC09009Pb-WC09008Pb-WC09006Pb-WC090010Pb-HK09001Pb-SP09001Pb-WC09003Pb-WC09001Pb-WC09004Pb-HK09002。對(duì)各目標(biāo)菌株蛋白酶活性差異顯著性分析結(jié)果表明，除Pb-HK09002外，其它10株菌株均極顯著高于10 g. mL-1的蛋白酶K的活性(P<0.01)；Pb-WC09002、Pb-WC09005、Pb-WC09009 蛋白酶活性均極顯著高于Pb-SP09001（P<0.01）；蛋白酶活性最高的Pb-WC09005菌株分離于海

12、南文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池，其蛋白酶活性極顯著高于從市售有益微生物制劑產(chǎn)品中分離的2株菌株（P<0.01）。將蛋白酶活性最高的Pb-WC09005菌株傳代20代后，第20代菌株的蛋白酶活性與第一代菌株相當(dāng)，沒有顯著性差異（P>0.05）。表1 13株高蛋白酶活性菌株的來源及其蛋白酶活性分析菌株編號(hào)來源水解圈直徑（mm）Pb-WC09001文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體10.24±0.08 ccPb-WC09002文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖場排水口底泥12.32±0.03 aa.cc Pb-WC09003文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖場周邊海域水體10.30±0.21 ccPb-WC09004文昌某

13、對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體10.18±0.06 ccPb-WC09005文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體 14.16±0.04aa,bb,ccPb-WC09006文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體11.54±0.16 ccPb-WC09008文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體11.64±0.14 ccPb-WC09009文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體12.24±0.02 aa. ccPb-WC09010文昌某對(duì)蝦養(yǎng)殖池水體11.50±0.06 ccPb-HK09001?？诎咨抽T海域自然海水11.44±0.06ccPb-HK09002?？诎咨抽T海域自然海水9.46±0.14Pb

14、-SP09001某品牌超級(jí)底改（陽性對(duì)照）11.32±0.04Pb-SP09003某品牌產(chǎn)酶利生素粉劑（陽性對(duì)照）12.72±0.16蛋白酶K陽性對(duì)照9.12±0.02滅菌海水陰性對(duì)照0注：a.表示水解圈直徑與Pb-SP09001存在顯著差異（P<0.05）；aa.表示水解圈直徑與Pb-SP09001存在極顯著差異（P<0.01）；b.表示水解圈直徑與Pb-SP09003存在顯著差異（P<0.05）；bb.表示水解圈直徑與Pb-SP09003存在極顯著差異（P<0.01）；c.表示水解圈直徑與10g/ml蛋白酶K存在顯著差異（P<0.

15、05）；cc.表示水解圈直徑與10g/ml蛋白酶K存在極顯著差異（P<0.01）。2.3 菌種鑒定 菌落特征和生理生化特征 筆者所分離的13株目標(biāo)菌株的菌落特征均為乳白色，扁平，表面粗糙、皺褶，邊緣不整齊，培養(yǎng)24 h的菌落直徑為35 mm。革蘭氏染色結(jié)果表明，所有菌株均為革蘭氏陽性。生理生化特征分析表明，除淀粉水解、明膠液化和對(duì)10%NaCl的耐受性3指標(biāo)因菌株不同而存在一定差異外，其他檢測指標(biāo)均與地衣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一致（表2）。表2 13株高蛋白酶活性菌株的生理生化特征菌株編號(hào)淀粉水解明膠液化硝酸鹽還原檸檬酸鹽葡萄糖果糖甘露醇D-核糖對(duì)NaCl的耐受性3%6%7%10%Pb-SP0

16、9001+-+-+-+Pb-SP09003-+-+-+Pb-WC09001+-+-+-+Pb-WC09002-+-+-+Pb-WC09003-+-+-+Pb-WC09004-+-+-+Pb-WC09005-+-+-+Pb-WC09006-+-+-+Pb-WC09008-+-+-+Pb-WC09009-+-+-+Pb-WC090010-+-+-+Pb-HK09001-+-+-+-Pb-HK09002+-+-+-+ATCC11946+-+-+-+ATCC 11091+-+-+注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。ATCC11091和ATCC11946為地衣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。 2.3.2 菌株16S

17、rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 分別以各目標(biāo)菌株的基因組總DNA為模板，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增，除Pb-HK09001、Pb-WC09008和Pb-WC09009分別產(chǎn)生1 510，1 512，1 512 bp的擴(kuò)增片段外，其余10株目標(biāo)菌株都產(chǎn)生了1 511 bp的16S rDNA產(chǎn)物。測序后，將所得序列提交至Genbank中，登錄號(hào)分別為HM006899、HM006900、HM006901、HM006902、HM006903、HM006904、HM006905、HM006906、HM006907、HM006908、HM006909、HM006897、HM006898。將獲得的16S rDNA序列在G

18、enbank中進(jìn)行比對(duì)，所有菌株都與地衣芽孢桿菌具有極高的同源性；下載與Pb-WC09001的相似度極高的25株細(xì)菌和地衣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14580的16S rDNA序列，并將它們與筆者所獲得的13株細(xì)菌的同源基因序列作多序列匹配排列和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，除Pb-WC09001與ATCC14580的16S rDNA的同源性為99.3%外，其他12株菌株均為99.4%99.8%，從Genbank中獲得的其它序列與ATCC14580的16S rDNA的同源性為98.7%99.4%，普遍低于筆者所獲得的13株細(xì)菌與ATCC14580的同源性；在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，筆者所獲得的13株細(xì)菌也明顯

19、與ATCC14580單獨(dú)聚為一類，其它25株細(xì)菌聚為數(shù)目不等的7支（圖1）。 圖1 13株高蛋白酶活性菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹3 討 論 筆者從熱帶海水養(yǎng)殖環(huán)境中分離獲得的13株具有高蛋白酶活的菌株均為革蘭氏陽性細(xì)菌，除了淀粉水解、明膠液化和10%NaCl耐受性3指標(biāo)外，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽反應(yīng)、碳源需求和對(duì)3%、6%、7% NaCl的耐受性的生理生化指標(biāo)與芽孢桿菌一致，根據(jù)一般細(xì)菌常用鑒定方法7和伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊8對(duì)芽孢桿菌的描述，初步確定這13株細(xì)菌為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。16S rDNA的序列比對(duì)結(jié)果表明，所有菌株都與地衣芽孢桿菌具有極高的同源性。因此，筆者分離獲得的所有菌株都

20、被鑒定為地衣芽孢桿菌。筆者從海南省海口市和文昌市的海水養(yǎng)殖池和自然海域的水體和底泥中分離獲得的高蛋白酶活性的地衣芽孢桿菌屬于該菌種的熱帶地理種群，所分離菌株不僅對(duì)海南獨(dú)特的熱帶海水環(huán)境有較好的適應(yīng)性，部分菌株的蛋白酶活性也顯著高于目前海南常用的有益微生物制劑菌株，具有開發(fā)地方特色有益微生物制劑的良好前景。其中，蛋白酶活性最強(qiáng)的菌株在高溫高鹽條件下繼代培養(yǎng)20代后，其蛋白酶活性沒有發(fā)生顯著變化，這表明該地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶基因和酶的活性穩(wěn)定，為開發(fā)特別適合海南等熱帶地區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖和養(yǎng)殖污水無害化處理的有益微生物制劑奠定了良好基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)： 1 Pinar C,Esra B,Güzide

21、C ,et al.Influence of pH conditions on metabolic regulations in serine alkaline protease production by Bacillus licheniformis J.Enzyme and Microbial Technology. 2002,31:685-697.2 Maitin V,Kavitha R,Umesh-Kumar S.Properties of an extracellular amylase purified from a Bacillus speciesJ.World Journal o

22、f Micro2 biology and Biotechnology. 2001,17:823-826.3 Mulalo B N ,Hugh-George P, Andrévan T, et al. Over2expression and properties of a purified recombinant Bacillus licheniformis lipase:a comparative report on Bacillus lipaseJ. Enzyme and Microbial Technology. 2001,28:705-712.4 張慶, 李卓佳, 陳康德. 復(fù)

23、合微生物對(duì)水體生態(tài)因子的影響. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999,8:43-47.5 Gatesoupe F J. The use of probiotics in aquacultureJ. Aquaculture, 1999,160:177-203.6 陳天壽主編. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用M. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995.326-328.7 中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組. 一般細(xì)菌常用鑒定方法M. 北京:科學(xué)出版社, 1978.242-398.8 布坎南 R E,主編. 伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊 M. 8版. 北京:科學(xué)出版社, 1984:677-830.9 杜珍輝. 芽孢桿菌 1018

24、2 對(duì)豬糞液的無害化處理與利用的初步研究J，渝西學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2005,4(2):50-53.10 李紅梅, 李琳, 侯立琪, 等. 地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶酶解改性玉米蛋白的研究J. 糧食與飼料工業(yè). 2008.(3):21-23.11 劉波, 劉文斌, 王恬. 地衣芽孢桿菌對(duì)異育銀鯽消化機(jī)能和生長的影響J. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005,28(4):80-84.12 謝航, 邱宏端, 王秀彬, 等. 地衣芽孢桿菌降解水產(chǎn)養(yǎng)殖中殘余餌料的特性研究J. 福建水產(chǎn), 2008.118(3):31-35.Screening and Identification of the tropica

25、l strains of Bacillus licheniformis with high protease activity CHEN Shengfeng1, LIN Qin2, ZHOU Yongcan1, OUYANG Jilong1, WANG Shifeng1, XIE Zhenyu 1*( 1.The College of marine sciences, Hainan University, Haikou 570228, China;2.South China Sea Fisheries Instiute , Guangzhou Guangdong 510300 )Abstrac

26、t: In this study, samples were collected from the sea water and sediments of the aquaculture systems and the natural sea area in Wenchang and Haikou, Hainan province. At the same time, kinds of effective microorganism preparations frequently used in aquacultural system in Hainan province were chosen as control strains. Totally 326 strains of Bacillus were isolated with high-temperature (50) and high-salt (70g / L) selective medium. Then 13 stra