銅綠假單胞菌生物膜對(duì)大薊乙醇提取物的抗力研究_圖文

1、文章編號(hào):1001-7658(201002-0142-03【論著】銅綠假單胞菌生物膜對(duì)大薊乙醇提取物的抗力研究黃曉敏,柯野,鄭秋樺,李海妙,彭曉云,曾松榮(韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院,廣東韶關(guān)512005提要目的研究銅綠假單胞菌生物膜對(duì)大薊乙醇提取物的抵抗力。方法采用B r own 平板改良法和載體定量殺菌試驗(yàn)法,進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室抗菌效果和殺菌效果檢測(cè)。結(jié)果培養(yǎng)3d 形成的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)含大薊生藥200g/L 的乙醇提取物耐受時(shí)間為20m in,含大薊生藥100g/L 的乙醇提取物耐受時(shí)間為60m in 。用含大薊生藥200g/L 的乙醇提取物對(duì)培養(yǎng)3d 的銅綠假單胞菌生物膜作用30m in,

2、可達(dá)到完全殺滅。培養(yǎng)7d 形成的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)含大薊生藥200g/L 的乙醇提取物的耐受時(shí)間為60m in,作用90m in 對(duì)其可達(dá)到完全殺滅。結(jié)論經(jīng)過(guò)培養(yǎng)可形成銅綠假單胞菌生物膜,其對(duì)大薊乙醇提取物耐受時(shí)間和殺滅時(shí)間均隨濃度降低而增加。關(guān)鍵詞大薊;乙醇提取物;銅綠假單胞菌;生物膜;抗性中圖分類號(hào):R187文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ASTU DY O N THE RES I STANCE O F P sedom onas aeruginosa B IO F I LM T O ETHAN OL -EX 2TRACT O F C I RS IU M JAP O N I CU M DCHUAN G X i

3、ao -m in,KE Ye,ZHEN G Q iu -hua,L I Ha i -m iao,PEN G X iao -yun,Z EN G Song -rong (Yingdong College of B i o -engineering,Shaoguan University,Shaoguan 512005,China Abstract O bjecti ve To study the resistance of Psedo m onas aerug inosa bi ofil m t o ethanol -extract of Cirsiu m japoni 2cu m DC .M

4、ethods Effects of antibi osis and bactericide were tested by i m p r oved B r own p late method and carrier quantita 2tive ger m icidal test method .Results The endurable ti m e of P .aerug inosa bi ofil m cultivated for 3days t o 200g/L ethanol -extract of Cirsiu m japonicu m DC was 20m in,the endu

5、re ti m e t o 100g/L ethanol -extract of Cirsiu m japonicu m DC was 60m in,and P .aerug inosa was killed out after 30m in .The endurable ti m e of P .aerug inosa bi ofil m cultivated for 7days t o 200g/L ethanol -extract of Cirsiu m japonicu m DC was 60m in,and P .aerug inosa was killed out after 90

6、m in .Conclu 2si on s P .aerug inosa bi ofil m can be f or med by cultivati on .The endurable ti m e and the killed ti m e of P .aerug inosa bi o 2fil m t o ethanol -extract of Cirsiu m japonicu m DC were increased with decreasing the concentrati on .Key words C irsium japonicum DC;ethanol -extract

7、;Psedo m onas aeruginosa;biofil m ;resistance作者簡(jiǎn)介黃曉敏(1955-,女,湖南郴州人,大學(xué)本科,教授,從事醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究。基金項(xiàng)目廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2005B33001004;韶關(guān)市技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目(2007313-1404007;香港銘源基金資助項(xiàng)目。銅綠假單胞菌是常見(jiàn)的條件致病菌,也是極易形成生物膜的細(xì)菌之一,銅綠假單胞菌生物膜感染一旦建立既是各種醫(yī)院內(nèi)感染極難根治的原因,亦是目前造成大桶飲用水污染,新鮮家禽肉類腐敗變質(zhì),導(dǎo)致食源性疾病的主要原因。為研究細(xì)菌生物膜對(duì)中草藥抗菌制劑的抵抗力,我們選擇粵北山區(qū)瑤族民間常用的抗菌中草藥大薊乙醇提取物

8、作為試驗(yàn)對(duì)象,以銅綠假單胞菌生物膜作為生物膜(BF 的模型,在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了抗菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。1方法111大薊乙醇提取物制備取曬干后的大薊全草,用無(wú)菌蒸餾水洗凈晾干后粉碎,以50g/L 用量加入到體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液浸泡過(guò)夜,然后經(jīng)超聲提取45m in 。取出提取液經(jīng)3000r pm 離心分離,再進(jìn)行減壓濃縮制備成含生藥450g/L 的提取原液。試驗(yàn)菌株,選擇臨床分離的2株銅綠假單胞菌(YPa191、YPa243,來(lái)源于廣東省粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,經(jīng)T DR -200B 全自動(dòng)型微生物分析儀檢測(cè)鑒241Chinese Journal of D isinfecti on 2

9、010;27(2 定。112試驗(yàn)方法11211生物膜制備采用B r own 平板法1并進(jìn)行改良,將復(fù)蘇后的銅綠假單胞菌傳代培養(yǎng)16h,接種于Muller -H int on 肉湯和Muller -H int on 瓊脂(購(gòu)自北京天壇生物,于37培養(yǎng)過(guò)夜。次日從平板上挑取單個(gè)典型菌落接種到肉湯中,于35培養(yǎng)68h,稀釋制備成含菌量為5105cfu /m l 菌懸液。取該菌懸液5m l 注入到無(wú)菌試管內(nèi),同時(shí)放入已滅菌的110c m 110c m 的聚氯乙烯(P VC 片,置于37溫箱中孵育,每隔24h 換1次肉湯,連續(xù)培養(yǎng)3d 或7d,即可形成早期生物膜和成熟的生物膜。11212生物膜形成鑒定取

10、出已培養(yǎng)3d 或7d 的生物膜載體膜,用pH712的011mol/L 磷酸鹽緩沖液(4預(yù)冷漂洗,在4環(huán)境中以25g/L 戊二醛溶液固定4h 。再用磷酸鹽緩沖液漂洗3次,每次15m in 。按體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%、100%系列濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水,每梯度15m in,其中100%乙醇脫水3次。用醋酸異戊酯置換乙醇015h,于二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀上進(jìn)行二氧化碳臨界點(diǎn)干燥、粘臺(tái),用HCP -2離子濺射儀噴金,經(jīng)掃描電鏡觀察確認(rèn)。11213中和劑選擇試驗(yàn)以銅綠假單胞菌為指標(biāo)菌,設(shè)平行6組,用載體定量鑒定試驗(yàn)程序進(jìn)行中和劑試驗(yàn)。結(jié)果判定,依照2002版消毒技術(shù)規(guī)范規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)重復(fù)3次,每次結(jié)

11、果均符合要求,即可判定中和劑通過(guò)。11214生物膜對(duì)大薊乙醇提取物抵抗力測(cè)定分別將一定量的大薊乙醇提取物原液加入到肉湯培養(yǎng)液內(nèi),使大薊終濃度分別為200、150、100g/L,調(diào)pH 值至714。分別各取5m l 大薊乙醇提取物溶液置50m l 無(wú)菌三角燒瓶?jī)?nèi),并取培養(yǎng)3d 和7d 的生物膜載體膜片,用無(wú)菌生理鹽水沖洗1m in,每個(gè)三角燒瓶?jī)?nèi)放入一張膜片,于22水浴(陽(yáng)性對(duì)照為P BS 。作用不同時(shí)間,取出生物膜載體,加入裝有5m l 中和劑的玻璃勻漿器內(nèi),中和作用10m in 。將膜片研磨,使載體表面的細(xì)菌脫落,形成菌懸液,連同陽(yáng)性對(duì)照各取1m l 作傾注接種,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每個(gè)時(shí)間段測(cè)試

12、3次。11215懸液定量殺菌試驗(yàn)試驗(yàn)在22水浴中進(jìn)行,將試驗(yàn)濃度提取物溶液和菌懸液經(jīng)過(guò)恒溫。在無(wú)菌試管內(nèi)加入5m l 含大薊200g/L 乙醇提取物溶液(陽(yáng)性對(duì)照為P BS 和011m l 菌懸液,混合作用至規(guī)定時(shí)間。取015m l 樣液置于415m l 中和劑試管內(nèi),混合中和作用10m in,取樣液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng),計(jì)算平均殺滅率。試驗(yàn)重復(fù)3次。2結(jié)果211中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明,用含卵磷脂1g/L 、硫代硫酸鈉1g/L 、10g/L 吐溫80組成的中和劑,可有效中和大薊乙醇提取物對(duì)試驗(yàn)菌的殘留作用,該中和劑及其中和產(chǎn)物對(duì)銅綠假單胞菌及培養(yǎng)基無(wú)明顯影響。212生物膜形成鑒定結(jié)果經(jīng)掃描電鏡

13、觀察表明,培養(yǎng)3d 的銅綠假單胞菌生物膜中菌體呈桿菌狀,隱約可見(jiàn)細(xì)菌之間的黏液絲借助其使部分細(xì)菌相互連接,而大部分細(xì)菌仍呈分散狀為不成熟生物膜(圖1。培養(yǎng)7d 的銅綠假單胞菌生物膜細(xì)菌數(shù)量增多,細(xì)菌之間的黏液絲將細(xì)菌相互連接形成生物膜。由于在載體樣品處理過(guò)程中經(jīng)脫水、干燥等步驟,因此可以推測(cè)生物膜中細(xì)菌之間在未經(jīng)處理前充滿了黏液(圖2 。圖1培養(yǎng)3d 的P .aerug inosa BF( 3000圖2培養(yǎng)7d 的P .aerug inosa BF(3000213生物膜抗性檢測(cè)結(jié)果結(jié)果表明,培養(yǎng)3d 形成的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)含大薊生藥200g/L 的乙醇提取物耐受時(shí)間為20m in,作用30

14、m in 可達(dá)到完全殺滅;對(duì)含大薊生藥100g/L 的乙醇提取物耐受時(shí)間為60m in,作用70341中國(guó)消毒學(xué)雜志2010年第27卷第2期m in可達(dá)到完全清除(表1。培養(yǎng)7d形成的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)含大薊生藥200g/L的乙醇提取物的耐受時(shí)間為60m in,作用90m in可達(dá)到完全殺滅;對(duì)含大薊生藥100 g/L的乙醇提取物耐受時(shí)間為120m in,作用150m in 可達(dá)到完全清除(表2。表1培養(yǎng)3d的生物膜對(duì)大薊乙醇提取物抵抗力測(cè)定結(jié)果作用時(shí)間(m in不同濃度(g/L大薊乙醇提取物作用后的生物膜存活菌數(shù)(cfu/片 20015010020765491730300108768400

15、851645001211360002470000注:0作用時(shí)間為陽(yáng)性對(duì)照組菌數(shù)。表2培養(yǎng)7d的生物膜對(duì)大薊乙醇提取物抵抗力測(cè)定結(jié)果作用時(shí)間(m in不同濃度(g/L大薊乙醇提取物作用后的生物膜存活菌數(shù)(cfu/片 2001501000689000000593000000601000000302030006200024300060251320015500900101340012000106150000注:0作用時(shí)間為陽(yáng)性對(duì)照組菌數(shù)試驗(yàn)結(jié)果還顯示,含大薊生藥200g/L的乙醇提取物溶液對(duì)懸液內(nèi)銅綠假單胞菌浮游菌,作用10 m in可達(dá)到完全殺滅,未檢出存活菌,陽(yáng)性對(duì)照組含菌量為5105cfu/m

16、l。3討論最近十多年來(lái),細(xì)菌(尤其銅綠假單胞菌生物膜方面的研究已成為對(duì)致病菌深入研究中的焦點(diǎn),并且成為研究進(jìn)展最快的微生物學(xué)領(lǐng)域之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者們已做了大量的研究工作,取得一些成果,但至今還沒(méi)有找到完全去除細(xì)菌生物膜的有效方法2。本試驗(yàn)采用模擬生物醫(yī)學(xué)材料體外制備細(xì)菌生物膜,采用人工生物膜發(fā)生裝置試管法檢測(cè)聚氯乙烯醫(yī)用材料對(duì)銅綠假單胞菌生物膜生成的影響。試驗(yàn)顯示,經(jīng)3d和7d的孵育,銅綠假單胞菌可在載體上形成早期和成熟的生物膜,從掃描電鏡照片上可見(jiàn)銅綠假單胞菌生物膜在聚氯乙烯片上形成,濃密的粘液樣物質(zhì)緊密包繞著大量的短桿狀細(xì)菌,聚集成團(tuán)塊狀。研究結(jié)果證明,培養(yǎng)3d的銅綠假單胞菌生物膜對(duì)大薊乙醇

17、提取物的耐受能力不如培養(yǎng)7d者強(qiáng),但成熟與不成熟的生物膜均隨大薊乙醇提取物濃度增加其耐受時(shí)間和殺滅時(shí)間縮短,此可能與生物膜細(xì)菌感受環(huán)境信號(hào)有關(guān),在抗菌藥物濃度增高環(huán)境信號(hào)刺激下,細(xì)菌表面相關(guān)蛋白發(fā)生應(yīng)答,使細(xì)菌粘附性發(fā)生改變,從而調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜的分散3,也就是將細(xì)菌從生物膜狀態(tài)恢復(fù)成浮游狀態(tài),則有利于恢復(fù)大薊乙醇提取物的敏感性,這個(gè)過(guò)程就是生物膜的分散。大薊為菊科薊屬植物的干燥地上部分或根,為多年生宿根草本。大薊在粵北瑤族民間常用于人和家畜的乳腺炎治療,實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)有抑菌作用4。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示,大薊乙醇提取物對(duì)銅綠假單胞菌生物膜有明顯的抗菌活性,但大薊的抗菌活性成分仍不清楚5,藥理研究?jī)H停留

18、在提取物階段,究竟是哪一種或幾種活性成分在起作用至今未見(jiàn)報(bào)道,有待于今后進(jìn)一步深入開(kāi)展有關(guān)大薊中的抗菌活性成分的篩選工作。本研究得到南方醫(yī)科大學(xué)電子顯微鏡室安連兵老師提供的電鏡技術(shù)支持,特此致謝。參考文獻(xiàn)1Hoiby N,Kr ogh JH,Moser C,et al.Pseudo m onas aerug inosa and the in vitr o and in viuo bi ofil m mode of gr owthJ.M icr obes I n2fect,2001,3(1:23.2Moskowitz S M,Foster J M,Emers on J,et al.Clinically feasible bi ofil m suscep tibility assay f or is olates of Pseudo m onas aerug inosefr om patientswith cystic fibr osisJ.J ClinicM icr obi ol,2004,42(7:1915.3St oodl