黑曲霉利用五倍子生料固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶優(yōu)化發(fā)酵條件研究

1、黑曲霉利用五倍子生料固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶優(yōu)化發(fā)酵條件研究 摘 要:單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase, EC31111120),它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,生成沒食子酸和葡萄糖。主要來源于微生物,存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外,目前研究得較多較為深入的是青霉和黑曲霉。本實驗對五倍子生料固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶進(jìn)行了研究,發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化后得到:初始水分含量80%,接種量1%, 20%五倍子,溫度30e為最佳產(chǎn)酶條件。在此基礎(chǔ)上,利用正交實驗對顯著影響產(chǎn)單寧酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件因素進(jìn)行優(yōu)化,得到固體發(fā)酵黑曲霉誘變菌株最佳產(chǎn)單寧酶條件為:濕度80%、接種量1%、發(fā)酵溫度33e、五倍子含量15%

2、。其中溫度對黑曲霉產(chǎn)單寧酶酶活性的影響是顯著的,并測得在此最佳發(fā)酵條件下產(chǎn)單寧酶活性達(dá)57132U/gds。關(guān)鍵詞:單寧酶;黑曲霉;固體發(fā)酵;優(yōu)化Optim ization of the production of tannase byAspergillusnigersolid-state fermentation using gallnutSHIRu-i li1,2, QIU Shu-yi1,2, LIYang-zhen1,2, ZHANG YI-m ing1,3(1. Guizhou ProvinceKeyLab ofFermentation Engineering and Biopham

3、acy, Guiyang 550003;2. ChemicalEngineeringCollege, GuizhouUniversity, Guiyang 550003)Abstract:The systematic name ofTannase is tannin acylhydrolase (Tannase, the EC 31111120); it can hydrolysesthe ester and depside bonds of gallotannis and gallic acid esters to form glucose and gallic acid.Tannasewa

4、smainlyproduced bymicrobiology, existing inside and outside of the cel.l Penicillium andAspergillusNigerwere mostly stud-ied. This experimentwas focused on optimizing fermentation conditions byAspergillusNigerin solid-state fermentationusing gall nuts as substrate. The initialmoisturewas 80%, the in

5、oculum 1% and the 30 C was the best conditions bythe single factor optimization experiment. Furthermore, orthogonal optimization of themedium and the culturewas per-formed and the best conditions ofproducing tannase by solid fermentationwere: the initialmoisture content80%, theinoculum 1%, the tempe

6、rature 33eand the gallnuts15%. Among them, the temperature had a remarkable effectonTannaseactivities. The activity ofTannasewas up to 57132U/gds under the above condition.Key words:Tannase; AspergillusNiger;solid fermentation; optimization收稿日期:2009-02-25基金項目:貴州省科學(xué)技術(shù)基金,黔科合J字2008 2091號。作者簡介:石瑞麗(1985-

7、),女,河南許昌人,在讀碩士研究生,研究方向為發(fā)酵工藝。中國食品添加劑China FoodAdditives試驗研究108 單寧酶(Tannase, EC 31111120)是一種水解酶,全稱單寧酯酰水解酶,能水解沒食子酸單寧中的酯醚和縮酚酸鍵生成沒食子酸和其他化合物,也能水解沒食子酸甲酯類物質(zhì)1。幾十年來科學(xué)家發(fā)現(xiàn),能夠產(chǎn)生單寧酶的菌種十分豐富,除了傳統(tǒng)的曲霉、青霉、酵母,還有寄生內(nèi)座殼菌、巴斯德菌、茄形鐮刀菌和綠色木霉。這些菌種都是以單寧作為誘導(dǎo)物來產(chǎn)生單寧酶的,充分證明了單寧酶為一種誘導(dǎo)酶。除存在于富含單寧的植物例如茶葉提取物中外,還廣泛存在于微生物中,如真菌類的曲霉(Aspergill

8、us)、青霉屬(Pen-icillium)、根霉屬(Rhizopus)以及毛霉屬(Mucor)。單寧酶不僅分布廣,而且用途也較多。在酶制劑工業(yè)發(fā)達(dá)的國家,如日本、美國,單寧酶的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究工作開展得較早,并已在茶飲業(yè)中取得了較好的經(jīng)濟效益2-4。隨著不斷的發(fā)展,單寧酶在精細(xì)化工、皮革、飼料、化妝品等方面也得到了重要應(yīng)用,特別是制備藥用中間體沒食子酸和食品抗氧化劑沒食子酸丙酯(PG),以及在處理茶葉的/冷后渾0和啤酒沉淀等方面,有重要應(yīng)用價值5。五倍子中的主要有效成分為鞣質(zhì)和沒食子酸。鞣質(zhì)又叫單寧酸,它是倍酰葡萄糖的混合物,即葡萄糖上的羥基與沒食子酸形成的酯類化合物的混合物,屬于水解類鞣質(zhì)

9、。五倍子中鞣質(zhì)含量高達(dá)70%以上6。單寧酶是一種誘導(dǎo)酶,因此,當(dāng)富含單寧酸的五倍子作為一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,則能夠很好地誘導(dǎo)黑曲霉生產(chǎn)單寧酶。本實驗采用五倍子生料進(jìn)行發(fā)酵,即對其培養(yǎng)基不經(jīng)過滅菌而直接進(jìn)行發(fā)酵,是對滅菌情況的一種創(chuàng)新,既節(jié)約了能量、資金,又節(jié)省了時間,操作簡便。我國直到20世紀(jì)90年代才開始進(jìn)行單寧酶的研究,至今對單寧酶的基礎(chǔ)理論研究報道仍很少。在新的高產(chǎn)單寧酶菌株篩選、發(fā)酵生產(chǎn)工藝,特別是固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝的優(yōu)化、單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)的誘導(dǎo)底物選擇及優(yōu)化培養(yǎng)基組成的研究等方面,我國還與國外存在一定的差距。本實驗采用五倍子生料固態(tài)發(fā)酵法黑曲霉產(chǎn)單寧酶,并對其培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素實驗研究

10、,同時采用正交方法優(yōu)化了固體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件,從而確定最佳發(fā)酵條件,增加酶產(chǎn)量、提高酶活、縮短發(fā)酵時間,降低生產(chǎn)成本。1 材料與方法111 材料11111 菌種黑曲霉B-0201 (Aspergillus niger),由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室紫外誘變原始黑曲霉菌株篩選出來,菌種在4e條件下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA)上。11112 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基五倍子、麩皮混合物共5g,無機鹽溶液(1%(w/v)NH4NO3+011% MgSO4#7H2O +011%NaCl)5mL。112 儀器設(shè)備722S分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;精密酸度計PHS-3C:上海虹益儀

11、器儀表有限公司; MJ-160B-II霉菌培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠; 100500LL微量進(jìn)樣器:上海求精生化試劑儀器有限公司; FA1004電子天平:上海良平儀器儀表有限公司; DZKW -4電子恒溫水浴鍋:上?？莆鲈囼瀮x器廠; ZHWY-111B恒溫培養(yǎng)震蕩器:上海智城分析儀器制造有限公司113 方法11311 黑曲霉B-0201孢子菌懸液的制備黑曲霉B-0201菌株在無菌操作臺中接種于馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上, 30e恒溫培養(yǎng)4天,待孢子成熟后,加入適量無菌生理鹽水,在酒精燈旁用接種環(huán)刮下孢子,置于裝有玻璃珠的三角瓶中, 30e震蕩培養(yǎng)1h,使孢子充分分散。取1mL孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋并

12、鏡檢計數(shù)。在移入發(fā)酵錐形瓶之前,將孢子懸液稀釋至11109個/mL。11312 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)取五倍子和麩皮作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)。由NH4Cl1% (w/v), MgSO4#7H2O 011% (w/v), NaCl011% (w/v)組成培養(yǎng)基的無機鹽溶液。取5g五倍子及麩皮的混合物裝入250mL三角瓶中,加入5mL上述無機鹽溶液和3mL蒸餾水,用移液管吸取1mL黑曲霉孢子懸液(11109個/mL孢子)移入三角錐瓶中,用玻璃棒充分?jǐn)嚢枋规咦优c培養(yǎng)基混合均勻,用八層紗布包扎好,不進(jìn)行滅菌,試驗研究中國食品添加劑China FoodAdditives109 直接放置于30e的恒溫培養(yǎng)箱中培

13、養(yǎng)96h。11313 粗酶液的提取取出恒溫培養(yǎng)箱中已培養(yǎng)96h的產(chǎn)單寧酶的固體培養(yǎng)基,加入50mL pH=510的檸檬酸緩沖液,用玻璃棒攪拌均勻,包扎好,放置于180r/min、30e搖床培養(yǎng)箱上培養(yǎng)1h后取出,用定性濾紙過濾,濾液即為粗酶液。11314 單寧酶酶活力的測定7參考文獻(xiàn)7測定單寧酶活力的方法測定。將單寧酶在pH510, 30e條件下每分鐘產(chǎn)生1Lmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。2 結(jié)果與分析211 發(fā)酵溫度的選擇基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接入黑曲霉No121孢子懸液1mL (11109個/mL孢子),用玻璃棒攪拌均勻,包扎好后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別控制溫度為25e、3

14、0e、33e、37e、40e,培養(yǎng)96小時后,加入PH=5的檸檬酸)檸檬酸鈉緩沖溶液50mL,攪拌均勻后放入30e、180r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)1h,然后用三角漏斗過濾發(fā)酵液,棄濾渣取濾液作為酶液,測定單寧酶酶活力。由表1可以看出,隨著發(fā)酵溫度的增加,單寧酶的活性呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢,且在發(fā)酵溫度為30e時達(dá)到最大值。因此選擇30e為單寧酶固態(tài)發(fā)酵的最佳溫度。表1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響Table1 Effect of ferm entation temperatureon enzym e production項目溫度/e25 30 33 37 40單寧酶活性/(Ugds)17127 35

15、126 34113 28117 19119212 接種量的選擇基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種入015mL 11109個/mL, 1mL 11109個/mL, 115mL 11109個/mL, 2mL 11109個/mL, 1mL 1109個/mL, 1mL 1108個/mL, 1mL 1107個/mL,1mL 1106個/mL的黑曲霉孢子懸液,其他條件不變,用玻璃棒攪拌均勻,包扎好后放入30e恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后,加入pH=5的檸檬酸)檸檬酸鈉緩沖溶液50mL,攪拌均勻后放入30e、180r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)1h,然后用三角漏斗過濾發(fā)酵液,棄濾渣取濾液作為酶液,測定單寧酶酶活力。由表2可知

16、,加入1mL 11109個/mL孢子懸液時,菌絲生長較快,單寧酶活力達(dá)到最大。當(dāng)接種量太小或太大時,菌絲生長緩慢,延長了生長周期,單寧酶酶活均有所降低。因此,選擇1mL 11109個/mL孢子懸液為固態(tài)發(fā)酵的最佳接種量。表2 接種量對產(chǎn)酶的影響Table2 Effect of ferm entation temperature on enzym e production項 目接種量/ (個/mL)111091109110811071106015mL 1mL 115mL 2mL 1mL單寧酶活性/ (Ugds) 26159 30147 25116 23127 26121 18157 16123

17、18100213 五倍子含量的選擇五倍子的添加量分別為5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%,其余組分不變,然后接種入No121孢子1mL (11109個/mL孢子),用玻璃棒攪拌均勻,包扎好后放入30e恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時后,加入pH=5的檸檬酸)檸檬酸鈉緩沖溶液100mL,攪拌均勻后放入30e、180r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)1h,然后用三角漏斗過濾發(fā)酵液,棄濾渣取濾液作為酶液,測定單寧酶酶活力。由表3可知,當(dāng)五倍子含量為20%時單寧酶的酶活最高,約為25U/gds。當(dāng)五倍子含量過高或過低都將影響單寧酶的酶活,原中國食品添加劑China FoodAdditives試驗研究1

18、10 因可能是由于隨著五倍子含量的增加,培養(yǎng)基中pH值減少影響單寧酶的產(chǎn)生和活性。因此,五倍子的添加量最優(yōu)為固體培養(yǎng)基的20%,即為1g。表3 五倍子含量對產(chǎn)酶的影響Table3 Effect of different content ofgallnut on enzym e production項目五倍子含量/%5 8 10 15 20 25 30單寧酶活性/(Ugds)1213 1812 2113 2314 2510 2113 1616214 初始水分含量的選擇調(diào)整基本發(fā)酵培養(yǎng)基中水分添加量為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%其余組分不變,然后接種入No121

19、孢子1mL (11109個/mL孢子)后,用玻璃棒攪拌均勻,放入30e恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后,加入pH=5的檸檬酸)檸檬酸鈉緩沖溶液100mL,攪拌均勻后放入30e、180r/min的搖床上震蕩培養(yǎng)1h,然后用三角漏斗過濾發(fā)酵液,棄濾渣取濾液作為酶液,測定單寧酶酶活力。由表4可知,初始水分含量為80%時單寧酶酶活最高, 80% 100%單寧酶的酶活相當(dāng),說明80%為飽和濕度。因此,初始水分含量應(yīng)為80%。表4 初始水分含量對產(chǎn)酶的影響Table4 Effect of initialmoisture contenton enzym e production項目初始水分含量/%30 40 50

20、60 70 80 80 100單寧酶活性/ (Ugds)1915 2215 2414 2619 3112 3813 3719 3716215 正交實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇單因素實驗中得出的最優(yōu)水平為正交實驗的中心水平,即選取每個單因素對黑曲霉產(chǎn)單寧酶酶活影響出現(xiàn)拐點的左右水平和拐點水平,共3個水平作為水平參數(shù)進(jìn)行正交實驗。以單寧酶的活性為指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交實驗。正交實驗的因素和水平的選擇見表5,正交實驗結(jié)果見表6,運用正交設(shè)計助手V311專業(yè)版對結(jié)果進(jìn)行分析,得出五倍子生料發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的最優(yōu)條件。表5 正交實驗因素和水平設(shè)計Table5 design of orthogonal

21、experim entalfactors and levels水平濕度/%接種量/mL溫度/e五倍子含量/%1 70 015 25 152 80 1 30 203 90 115 33 25表6 發(fā)酵工藝條件正交實驗結(jié)果與直觀分析Table6 Result and intuitional analysis of orthogonal experim ent of the technique condition of ferm entation實驗濕度/%接種量/%溫度/e五倍子含量/%實驗結(jié)果/ (U/gds)NO1 1 1 1 1 37120NO2 1 2 2 2 38171NO3 1 3 3

22、 3 47149NO4 2 1 2 3 42183NO5 2 2 3 1 58143NO6 2 3 1 2 41120NO7 3 1 3 2 43140NO8 3 2 1 3 34131NO9 3 3 2 1 42177均值1 (K1) 411133 411143 371570 461133均值2 (K2) 471487 431817 411437 411103均值3 (K3) 401160 431820 491773 411543極差(R) 71327 21677 121203 51030試驗研究中國食品添加劑China FoodAdditives111 表7 正交實驗結(jié)果的方差分析Tabl

23、e7 Variance analysis of orthogonal experim ent因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性濕度/% 941992 2 11000 91000)接種量/% 141311 2 11000 91000)溫度/e2331372 2 161307 91000五倍子含量/% 461563 2 31254 91000)誤差14131 2從表6可知,多因素多水平對單寧酶酶活也有很大的影響,根據(jù)實驗因子的總計數(shù)和平均數(shù)可以看出: A取A2, B取B2, C取C3, D取D1為好,即A2B2C3D1組合。同時由R極差分析得出,各因素對發(fā)酵條件影響的主次關(guān)系為RCRARDRB

24、,發(fā)酵溫度對單寧酶的活性影響最大,結(jié)合實驗結(jié)果, No5實驗號與正交實驗基本吻合,所以取No5實驗號。即利用黑曲霉對五倍子產(chǎn)單寧酶提高酶活的最佳發(fā)酵生態(tài)條件為濕度80%、接種量1%、發(fā)酵溫度33e、五倍子含15%。由直觀分析表可以確定發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為實驗No5。由表7正交實驗的方差分析結(jié)果可知,在接種量存在一定誤差的情況下,取P=011,溫度大于F0105,即F溫度F溫度臨界值,溫度對黑曲霉產(chǎn)單寧酶酶活性的影響是顯著的,說明實驗結(jié)果具有一定的科學(xué)性。根據(jù)最佳發(fā)酵條件進(jìn)行了驗證性實驗,在此條件下進(jìn)行固體發(fā)酵重復(fù)實驗,酶活力為57132U/gds。3 結(jié)論分別從濕度、接種量、發(fā)酵溫度、五倍子含

25、量等不同的單因素發(fā)酵條件方面對黑曲霉單寧酶產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究,優(yōu)化了產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明用改方法產(chǎn)單寧酶的最適發(fā)酵條件為:溫度30e,接種量1%,五倍子含量20%,濕度80%,并對該四因素三水平做正交實驗,得出最優(yōu)化結(jié)果:濕度80%、接種量1%、發(fā)酵溫度33e、五倍子含量15%。根據(jù)最佳發(fā)酵條件進(jìn)行了驗證性實驗,在此條件下進(jìn)行固體發(fā)酵重復(fù)實驗,酶活力為57132U/gds。中國的酶制劑工業(yè)起步較晚,無論是在酶的理論研究、開發(fā)應(yīng)用還是在酶的生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)規(guī)模上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于酶制劑工業(yè)發(fā)達(dá)的國家,所以,開發(fā)新酶及酶的多種用途,提高酶的生產(chǎn)技術(shù),使之更好地為工農(nóng)業(yè)及醫(yī)療環(huán)保事業(yè)服務(wù),已成為酶學(xué)研究的一個重要任務(wù).單寧酶的應(yīng)用范圍十分廣泛,然而單寧酶的研究在我國尚屬起步階段,鑒于它的多種用途,加強對其理論研究并使之轉(zhuǎn)換為生產(chǎn)力,既可為其他新酶的開