論文格式參考

1、虎杖甙對(duì)炎癥狀態(tài)下多形核白細(xì)胞趨化活性調(diào)節(jié)的機(jī)制研究黃海瀟1(3252000025) 趙清1(3252000064 ) 指導(dǎo)老師：金春華2(1.學(xué)員一旅十三隊(duì)臨床本 廣州510515 2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心廣州510515)摘要：目的：初步研究虎杖甙對(duì)內(nèi)毒素刺激下白細(xì)胞趨化活性調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法：觀察虎杖甙對(duì)LPS刺激下白細(xì)胞上清對(duì)白細(xì)胞趨化活性的影響及PD對(duì)LPS刺激下FPRL1/293趨化活性的影響。結(jié)果：LPS也可增加PMN趨化因子的分泌，PD可以下調(diào)PMN對(duì)LPS刺激后PMN懸液上清趨化性的升高。PD同樣可以下調(diào)LPS刺激下轉(zhuǎn)染了甲?；臉邮荏w基因的細(xì)胞株的細(xì)胞趨化性的升

2、高。結(jié)論：PD可以通過(guò)抑制白細(xì)胞趨化因子的分泌和下調(diào)甲?；臉邮荏w活性下調(diào)白細(xì)胞的趨化活性，進(jìn)而發(fā)揮抗感染性休克的作用。關(guān)鍵詞：虎杖甙；趨化作用；內(nèi)毒素；甲?；臉邮荏w；多形核白細(xì)胞Role of polydatin in the chemotaxis of polymorphonuclear leukocytesunder the stimulation of LPSAbstract: Objective To understand the action mechanisms of polydatin (PD) in the regulation of polymorphonuclear l

3、eukocytes (PMN) chemotaxis under the stimulation of LPS. Method Chemotaxis assay was used to investigate the regulative role of formyl peptide receptor like-1 in the chemotaxis of PMNs in response to PD and LPS. Results LPS could increase the secretion of PMN chemotactic factor and up-regulate the f

4、unction of formyl peptide receptor like-1. PD did not obviously affect the normal secretion of PMN chemotactic factor and the function of formyl peptide receptor like -1, but it could significantly reduce the rise of the excretion of PMN chemotactic factor caused by LPS stipulation and up-regulate P

5、MN formyl peptide receptor expression. Conclusion PD can regulate PMN chemotaxis by down-regulate the secretion of chemokine and the function of FPRL1 and may play a crucial role in the treatment of inflammation.Key words: polydatin; chemotaxis; LPS; formyl peptide receptor like-1; polymorpho- nucle

6、ar leukocytes近年來(lái)在對(duì)革蘭氏陰性(G-)菌引起中毒性休克的機(jī)制研究中，認(rèn)識(shí)到內(nèi)毒素(endotoxin，LPS)引起休克、造成多器官功能衰竭(MOF)的機(jī)理并非由細(xì)菌感染直接作用,而是宿主受LPS刺激后體內(nèi)釋放多種內(nèi)源性細(xì)胞因子引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)的結(jié)果1。虎杖甙（Polydatin,PD）是從具有清熱解毒、涼血行淤功能和抗病毒、抗菌作用的中藥虎杖中提取的主要成份，對(duì)燒傷性、感染性和失血性休克有良好療效。近來(lái)的工作證實(shí)2PD在炎癥狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞趨化性的調(diào)節(jié)可以使炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)趨于平衡。但其調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化性的具體機(jī)制尚不明確，為了進(jìn)一步探討PD的作用機(jī)理，我們用趨化性分析的技術(shù)觀察

7、了PD對(duì)正常及LPS刺激下白細(xì)胞分泌趨化因子及白細(xì)胞膜上甲酰化肽受體異構(gòu)體（formyl peptide receptor like-1）活性的影響。1 材料與方法1.1材料：1.1. 1主要試劑與儀器：fMLP、LPS 購(gòu)自Sigma公司；DMEM、RPMI-1640為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品；小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。PD由深圳海王制藥公司提?。慌Ｑ灏椎鞍踪?gòu)自上海伯奧生物科技有限公司；糖原購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司； 其余為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。趨化實(shí)驗(yàn)裝置和趨化膜購(gòu)自NeuroProbe公司，由美國(guó)王吉明博士提供。1.1.2 穩(wěn)定表達(dá)FPRL1的293細(xì)胞株（FPRL1/293）由美國(guó)王

8、吉明博士提供。1.1.3 趨化緩沖液（binding medium, BM）: 含終濃度為1%BSA、30mmol/L HEPES、20mmol/L Glutamine、200units/L Penicillin和200g/L Streptomycin的RPMI-1640。1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: SD大鼠，體重180200g，清潔級(jí)，由第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2 中性粒細(xì)胞的制備：用糖原生理鹽水腹腔注射的辦法分離PMN3。1.3 PMN懸液上清的制備：獲得的PMN以趨化緩沖液重懸，分為5組進(jìn)行處理：1）不進(jìn)行任何處理；2）按所需終濃度加入1mg/ml的LPS處理30分鐘；3）在30分

9、鐘后按所需終濃度加入8mg/ml的PD孵育30分鐘；4）先按所需終濃度加入1mg/ml的LPS，30分鐘后按所需終濃度加入8mg/ml的PD孵育30分鐘。處理后分別以2500rpm離心5分鐘，取上清，細(xì)胞再以趨化緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/L備用。1.4PD對(duì)LPS刺激下PMN分泌趨化性細(xì)胞因子的影響趨化性的檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)分組：1.4.1 細(xì)胞趨化性的檢測(cè)：趨化活性的檢測(cè)方法用趨化小室法4。1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組：（1）空白對(duì)照組：下孔為單純的趨化緩沖液；（2）陰性對(duì)照組：下孔為未加任何刺激的PMN懸液上清；（3）LPS刺激組：下孔分別為終濃度10、100、1000ng/ml L

10、PS處理30分鐘后PMN懸液上清；（4）PD處理組：下孔分別為不同終濃度PD處理30分鐘后PMN懸液上清；（5）PD治療組：下孔為L(zhǎng)PS孵育30分鐘后再以PD處理30分鐘后PMN懸液上清。1.5細(xì)胞甲?；臉邮荏wFPRL1對(duì)細(xì)胞趨化性的影響的趨化性檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為4組，除空白對(duì)照組下層為單純趨化緩沖液外，其余各組下層小孔內(nèi)均為濃度為10-7mol/L的fMLP，具體分組如下：（1）空白對(duì)照組：趨化小室上層為293或FPRL1/293細(xì)胞；（2）正常組：趨化小室上層為未做任何處理的293或FPRL1/293細(xì)胞；（3）LPS組：上層為100ng/ml LPS刺激30分鐘的293或FPRL

11、1/293細(xì)胞；（4）PD組：上層為在LPS刺激組基礎(chǔ)上又以0.08mg/ml PD處理30分鐘的293或FPRL1/293細(xì)胞；1.5 統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組均數(shù)之間的單向方差分析，方差齊性時(shí)使用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett´s C方法，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Microsoft Excel進(jìn)行圖表處理。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21 不同濃度LPS刺激及PD治療后PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），當(dāng)上層細(xì)胞為正常PMN時(shí)，陰性對(duì)照組對(duì)PMN的趨化指數(shù)與空白對(duì)照組基本一致（趨化指數(shù)分別

12、為1.20±0.47 vs 1.00，P>0.05）；在LPS刺激后PMN懸液的上清對(duì)PMN的趨化指數(shù)較陰性對(duì)照組有明顯增加，當(dāng)LPS濃度分別為10ng/ml，100ng/ml和1000ng/ml時(shí),白細(xì)胞趨化指數(shù)各為5.86±2.42，8.30±3.28和7.65±2.35，LPS刺激組顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。而在LPS刺激后再以PD作用，則可以明顯下調(diào)由LPS刺激產(chǎn)生的趨化性的增高，其趨化指數(shù)分別降為：1.69±0.55，2.49±0.84，3.15±1.01，分別與加藥前相比均有顯著性差異（P&

13、lt;0.05）。*Fig 1.Effect of the culture supernatants of PMN under the different doses of LPS stimulation and PD treatment on PMN chemotactic indexThe concentration of PD is 0.08 mg/ml, 0, 10, 100 and 1000 ng/ml are concentrations of LPS.* P<0.05 vs control ; P<0.05 vs LPS group respectively. n=9

14、.圖1 不同濃度LPS刺激后及PD治療后PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響注： 10、100、1000 ng/ml為L(zhǎng)PS濃度。* 表示與陰性對(duì)照組相比P<0.05，表示分別與LPS刺激組相比P<0.05。n=922 不同濃度PD刺激PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表1），經(jīng)PD處理過(guò)的正常PMN上清（下孔分別為0.8、0.08、0.008mg/ml PD處理30分鐘后PMN懸液上清）對(duì)PMN的趨化活性沒(méi)有明顯改變.(P>0.05)Tab 1.Effect of the culture supernatants of PMN under the differe

15、nt doses of PD treatment on PMN chemotactic index (n=9)表1. 不同濃度PD刺激PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響（n=9）趨化指數(shù)空白對(duì)照陰性對(duì)照PD處理組0.008mg/ml0.08 mg/ml0.8 mg/ml均值1.001.201.191.171.54標(biāo)準(zhǔn)差0.470.780.570.732.3 不同濃度PD與LPS共同作用下PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響：實(shí)驗(yàn)中LPS刺激組趨化小室下孔為100 ng/ml LPS處理30分鐘后PMN懸液上清；PD治療組下孔為在LPS刺激組基礎(chǔ)上再分別以0.8、0.08、0.008mg/ml P

16、D處理30分鐘后PMN懸液上清。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），當(dāng)被趨化的細(xì)胞為正常PMN時(shí)，PD在0.8mg/ml到0.08mg/ml范圍內(nèi)均能抑制LPS刺激后PMN懸液上清對(duì)PMN的趨化作用，以PD濃度0.08mg/ml時(shí)效果最顯著，其趨化指數(shù)可達(dá)2.49±0.84。而0.008mg/ml的PD的作用則不顯著。而與陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05)。*Fig 2.Effect of the culture supernatants of PMN under LPS stimulation and the different doses of PD treatment on PM

17、N chemotactic index.All group except blank and control were treated with 100ng/ml LPS, 0.8,0.08 and 0.008 were concentrations of PD. * P<0.05 vs control group; P<0.05 vs LPS group. n=9.圖2 不同濃度PD與LPS共同作用下PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響注： 0.8、0.08、0.008mg/ml為PD的濃度。* 表示與陰性對(duì)照組相比P<0.05，表示與LPS組相比P<0.05，表示與P

18、D治療組2相比P<0.05。n=924 PD、LPS刺激后PMN懸液上清對(duì)PD、LPS刺激后PMN趨化性的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，下孔為L(zhǎng)PS刺激組上清和PD治療組上清的細(xì)胞趨化性與空白對(duì)照相比明顯升高(P<0,05)，而下孔為空白對(duì)照和PD作用組的上清與空白對(duì)照相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。Tab. 2 Effect of PD, LPS on the chemotaxis of PMN under PD, LPS treatment表2. 不同濃度PD刺激PMN懸液上清對(duì)PMN趨化性的影響（n=9）upperblankPDLPSLPS+PDlowerblank12&

19、#177;3 12±413±515±5PD13±415±415±517±7LPS90±14 *86±20 *127±15 *70±14 *LPS+PD27±7 *18±7 *103±17 *26±9 *: P<0.05 vs upper and lower both blank group. n=9。2.5 細(xì)胞甲?；臉邮荏wFPRL1對(duì)細(xì)胞趨化性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3）：野生型293本身并不表達(dá)趨化性受體，它在各種刺激下趨化指數(shù)基本沒(méi)有

20、變化，與空白對(duì)照組一致（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染了FPRL1受體的293細(xì)胞在趨化因子的影響下，其趨化指數(shù)達(dá)到了4.01±0.99，與空白對(duì)照組相比有了明顯升高(P<0.05)。而在LPS的刺激下，其趨化指數(shù)進(jìn)一步升高至8.00±2.57，較正常對(duì)照組有明顯升高（P<0.05）。在LPS刺激后加入PD處理，則發(fā)現(xiàn)升高的趨化指數(shù)明顯下降（P<0.05），為4.42±1.67。PD治療組的趨化指數(shù)與正常對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。*Fig.3 Effect of PD on FPRL1/293 chemotactic index

21、 under stimulation of LPS*P<0.05 vs blank group; P<0.05 vs normal group; P<0.05 vs LPS group. n=9圖3 PD對(duì)LPS刺激下FPRL1/293細(xì)胞趨化性的影響注：*表示正常對(duì)照組與空白對(duì)照組相比P<0.05,表示與正常對(duì)照組相比P<0.05，表示與LPS刺激組相比P<0.05。n=9。3 討論：感染性休克代表了宿主對(duì)全身性炎癥的病理生理反應(yīng)。 LPS作為誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)的兩類誘導(dǎo)劑之一，可以通過(guò)多種膜表面受體激活PMN趨化、聚集、游走到炎癥部位，釋放各種活性酶和白

22、細(xì)胞三烯B4（LTB4）等，引起炎癥反應(yīng)，造成組織細(xì)胞損傷5。近幾年研究闡明了炎癥期間白細(xì)胞滾動(dòng)、粘附、游走，并發(fā)揮其功能是造成炎癥損傷的主要機(jī)制6，7。該機(jī)制的關(guān)鍵步驟是趨化因子對(duì)白細(xì)胞激活信號(hào)系統(tǒng)的啟動(dòng),包括不同趨化因子與受體結(jié)合出現(xiàn)的一系列生化反應(yīng)過(guò)程。趨化因子是白細(xì)胞外滲和組織浸潤(rùn)的重要媒介。炎癥細(xì)胞可以和多種趨化因子反應(yīng)而引起細(xì)胞移動(dòng)、整合素活化、超氧陰離子產(chǎn)生和脫顆粒反應(yīng)。這些功能組成了對(duì)抗微生物入侵的第一條防線。到目前為止，很多種趨化因子已經(jīng)被分離純化出來(lái)，包括“經(jīng)典的”趨化因子，包括細(xì)菌甲?；募柞；琢虬彼?亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP），活化的補(bǔ)體5（C5a），白細(xì)胞三烯B4

23、（leukotriene B4, LTB4）和血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）以及新定義的趨化因子總科。體外實(shí)驗(yàn)表明，許多物質(zhì)可以刺激白細(xì)胞及非白細(xì)胞產(chǎn)生這些趨化細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)物的刺激下，趨化細(xì)胞因子mRNA水平在短時(shí)間內(nèi)可明顯升高8,9。其趨化白細(xì)胞的機(jī)制是通過(guò)特殊的信號(hào)傳遞系統(tǒng)，激活白細(xì)胞表面的粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)，后者與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用促使白細(xì)胞游向炎癥區(qū)域，使白細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、單核細(xì)胞脫顆粒并釋放某些酶產(chǎn)物發(fā)揮其效應(yīng)。趨化因子受體與三磷酸鳥苷蛋白(G蛋白)形成的耦合體，不同組織及器官的趨

24、化因子受體類型及分布數(shù)量各異，其性質(zhì)及量決定與趨化因子結(jié)合后所起的生物學(xué)作用 9。在本實(shí)驗(yàn)中, 我們利用LPS刺激動(dòng)物細(xì)胞模擬感染、炎癥條件，以fMLP為趨化因子來(lái)研究PD對(duì)白細(xì)胞趨化性的影響。LPS刺激后的PMN懸液上清表現(xiàn)出了明顯的趨化活性。我們推測(cè)可能是由于LPS激活PMN后，使PMN分泌了一些趨化性的細(xì)胞因子，從而使PMN的趨化性增加。PD作用后PMN懸液上清對(duì)細(xì)胞的趨化活性并沒(méi)有明顯改變，但PD可以明顯降低由LPS刺激引起的PMN懸液上清對(duì)細(xì)胞趨化活性的增高。因此我們考慮，LPS可以通過(guò)刺激細(xì)胞分泌趨化性的細(xì)胞因子來(lái)增高細(xì)胞趨化性，而PD可以減低LPS的這種作用，從而使細(xì)胞的趨化性不

25、至于過(guò)高，這樣即保持了對(duì)外界刺激的正常反應(yīng)性，又可以使細(xì)胞不至于被過(guò)度激活而發(fā)生聚集，從而在炎癥和感染性休克中起到保護(hù)組織細(xì)胞的作用。我們還利用轉(zhuǎn)染了FPRL1受體基因的細(xì)胞株研究了PD影響細(xì)胞趨化性的可能途徑。由于野生型的HEK-293細(xì)胞為人胚胎腎細(xì)胞，本身不具有趨化活性。而FPRL1/293細(xì)胞株中由于轉(zhuǎn)染了FPRL1基因并穩(wěn)定表達(dá)，因此可以對(duì)利用FPRL1受體的趨化因子表現(xiàn)出一定的趨化活性。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，LPS可以明顯增強(qiáng)FPRL1/293細(xì)胞株對(duì)fMLP的趨化活性。而PD則可以減低由LPS刺激引起的FPRL1/293細(xì)胞株的趨化活性增高。這就提示PD可能是通過(guò)影響FPRL

26、1的表達(dá)和/或功能來(lái)發(fā)揮其作用的。FPRL1是甲?；氖荏wFPR的異構(gòu)體，是一些自然的N-甲酰肽趨化劑包括N-甲酰肽原型fMLP的膜受體。N-甲?；氖亲钕确蛛x出來(lái)的和最重要的化學(xué)趨化劑。自從由細(xì)菌上清中提純以后，證實(shí)了它們是PMN及巨噬細(xì)胞上甲酰化肽受體（formyl peptide receptor,FPR）的配基。FPRL1是由FPR變異的克隆發(fā)現(xiàn)的，它能與高納摩爾至低微摩爾濃度的fMLP發(fā)生低親和力的作用，通過(guò)FPRL1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路還沒(méi)有進(jìn)行深入的研究。然而，與FPR 高度的同源性、對(duì)百日咳毒素敏感、介導(dǎo)有力的巨噬細(xì)胞泳動(dòng)和可以使激動(dòng)劑活化提示FPRL1和FPR可能在活化后有一些

27、相同的信號(hào)傳導(dǎo)步驟。由于炎癥過(guò)程中壞死組織釋放的線粒體蛋白同樣是N-甲?；模虼薋PRL1的功能狀態(tài)在炎癥調(diào)控過(guò)程中起了重要的作用10。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PD可以明顯降低由LPS引起的FPRL1/293細(xì)胞株的趨化活性的升高，因此我們認(rèn)為，PD可以通過(guò)調(diào)節(jié)在炎癥反應(yīng)發(fā)生和調(diào)控過(guò)程中起重要作用的FPRL1的功能來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化性，從而避免過(guò)度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，PD可以通過(guò)調(diào)節(jié)LPS刺激后白細(xì)胞分泌趨化因子及趨化因子膜受體結(jié)合趨化因子的活性來(lái)調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化作用，避免過(guò)度炎癥反應(yīng)，在抗感染性休克中發(fā)揮了重要的作用。但PD具體可以調(diào)節(jié)哪些趨化因子的分泌及趨化因子膜受體結(jié)合趨化因子能力的改變是由

28、于受體數(shù)量的改變或結(jié)合能力的改變還有待于進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)1. Ulevitch RJ, Tobias PS.Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol. 1995;13:437-57. 2. 黃海瀟,趙清,金春華.虎杖甙對(duì)LPS刺激下中性粒細(xì)胞趨化性的影響.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003;23(12):1253-56. 3. 金麗娟,王靜珍. 青藤堿對(duì)補(bǔ)體激活的中性粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和脫顆粒的抑制作用. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào). 1992; (4), 288- 291.4. Su SB,Gao JL, Shen W, Murphy PM, Oppenhe