Fas和FasL在急性胰腺炎中的共表達及其與凋亡的關系J

1、Fas和FasL在急性胰腺炎中的共表達及其與凋亡的關系 作者：李震東1；馬清涌1；徐軍1；李明2(西安交通大學1第一醫(yī)院肝膽外科，2醫(yī)學院組胚教研室，陜西西安710061)摘要：目的探討凋亡調(diào)控基因Fas、FasL在大鼠急性胰腺炎中的表達及其與腺泡細胞凋亡的關系。方法通過胰膽管內(nèi)逆行注射不同濃度的牛磺膽酸鈉，建立不同嚴重程度的急性胰腺炎模型，用RT-PCR、免疫組化法檢測胰腺組織Fas、FasL mRNA及蛋白的表達，原位末端標記法檢測各組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡。結(jié)果在正常的胰腺腺泡細胞中即存在著Fas、FasL mRNA及蛋白的表達，且呈現(xiàn)共區(qū)域化特點，凋亡細胞極少。在炎癥程度較輕的胰腺組織，

2、Fas和FasL mRNA的表達水平顯著提高，腺泡細胞凋亡指數(shù)亦明顯提高，隨胰腺炎癥程度的加重，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達逐漸下降，腺泡細胞凋亡指數(shù)亦逐漸下降。結(jié)論Fas/FasL系統(tǒng)可能參與了正常胰腺組織的細胞更新和自穩(wěn)；是介導急性胰腺炎時腺泡細胞凋亡的一個重要途徑。關鍵詞：急性胰腺炎；細胞凋亡；Fas；FasL中圖分類號：R657.5文獻標識碼：A文章編號：1673-4254(2006)01-0025-05Colocalized expression of Fas and Fas-Ligand in acute pancreatitis and its correlation wit

3、h cell apoptosisLI Zhen-dong1；MA Qing-yong1；XU Jun1；LI Ming2Department of Hepatobiliary Surgery, First Hospital of Xian Jiaotong University1, Department of Histoembryology, Medical College2, Xian Jiaotong University, Xian 710061, ChinaAbstract: Objective To study the expressions of Fas and Fas-Ligan

4、d (FasL) genes in rats with acute pancreatitis (AP) and their relation to apoptosis of pancreatic acinar cells. Methods Rat models of acute pancreatitis with varied severity were established by retrograde injection of sodium taurocholate at different concentrations via the apancreatobiliary duct. Th

5、e expressions of Fas and FasL mRNAs and proteins were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. The apoptosis of acinar cells was quantified by in situ nick ending-labeling technique. Results of expressions fas, FasL mRNA and protein were colocali

6、zed in normal pancreatic acinar cells. In pancreatic tissue with less severe inflammation, the expressions of Fas and FasL mRNA increased significantly, and the apoptosis index of the acinar cells was also elevated; with the increase in the severity of the pancreatitis, the expression of Fas and Fas

7、L mRNAs were gradually lowered and apoptosis index of the acinar cells was increased. ConclusionFas/FasL system might be involved in the renewal and homeostasis of normal pancreatic tissue, and constitute an important pathway mediating the apoptosis of pancreatic acinar cells in AP .Key words: acute

8、 pancreatitis; apoptosis; Fas; FasL收稿日期：2005-08-16基金項目：國家自然科學基金(30371398)Supported by National Natural Science Foundation of China(30371398)作者簡介：李震東(1969-)，男，外科主治醫(yī)師，博士研究生，電話E-mail: victor7922通訊作者：馬清涌，教授，博士生導師，電話E-mail：qyma0 近年來在多種急性胰腺炎動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細胞凋亡程度與急性胰腺炎胰腺炎癥的嚴重度呈負

9、相關性，誘導凋亡可明顯減輕急性胰腺炎病情1。Fas/FasL系統(tǒng)是許多疾病如肝炎和自身免疫性疾病等的細胞凋亡介質(zhì)，F(xiàn)as(CD95)是腫瘤壞死因子(TNF)受體家族I型跨膜蛋白及FasL的受體，相對分子質(zhì)量45 000； FasL是TNF家族型跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量40 000，F(xiàn)as與其配體FasL或Fas抗體結(jié)合可誘導Fas表達細胞發(fā)生凋亡。但其在急性胰腺炎中的重要性尚未闡明，本文對此加以探討。1材料和方法1.1藥物與試劑?；悄懰徕c購自Sigma公司，使用前以生理鹽水配制成不同質(zhì)量濃度的溶液?？俁NA提取試劑盒(TRI試劑)購自美國MRC公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購自Ferme

10、ntas公司，F(xiàn)as、FasL多克隆抗體購自武漢博士德生物制品有限公司，TUNEL法細胞原位凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司。1.2實驗動物分組與模型制備將40只SD雄性大鼠(購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，體質(zhì)量250300 g)隨機分成4組，每組10只， 經(jīng)十二指腸壁潛行穿刺膽胰管注射?；悄懰徕c以誘導急性胰腺炎(AP)。其中A組為假手術(shù)對照組，僅行剖腹探查，牽引胰腺后關腹；B、C、D組為AP模型組，分別給予2.0%、3.5%、5.0%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g體質(zhì)量，建立不同炎癥程度的AP模型。術(shù)后6 h處死大鼠，快速切取胰尾部組織液氮保存?zhèn)銻NA提取，取病變較為一致的胰頭

11、部組織置4% PBS多聚甲醛中固定，4 m連續(xù)切片供HE染色及免疫組化研究。1.3胰腺組織病理損害評分常規(guī)制作胰腺病理HE切片，鏡下比較胰腺病理組織學改變，采用Schmidt2的胰腺組織學改變評分系統(tǒng)，由專人盲法在光鏡下按照水腫、腺泡細胞壞死、出血和脂肪壞死、炎癥和血管周圍浸潤程度不同分04分評分。1.4RT-PCR法檢測胰腺組織Fas、FasL mRNA的表達用TRI試劑提取胰腺組織總RNA，將5 g總RNA反轉(zhuǎn)錄后行PCR。PCR擴增體系25 l，其中含2PCR master mix 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，cDNA模板(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 l，以PTC-200型(MJ公司，

12、美國)PCR儀作熱循環(huán)：預變性94 3 min；循環(huán)：94 45 s、60 45 s、72 45 s、共35循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 10 min。Fas、FasL及內(nèi)參GAPDH引物由大連寶生物工程公司合成，引物序列如下：Fas 上游：5GATATGCTGTGGATCAT GGC 3，下游：5AACTTTTCGTTCACCAG 3(201 bp，下同)；FasL 上游：5ATGGAACTG CTTTGATCTCTGG 3，下游：5AGATTCCTCAAAA TTGATCAGAG 3(320 bp)； GAPDH 上游：5CATAG ACAAGATGGTGAAGG3，下游：5TCCACAGTCTT

13、 CTGAGTGGC 3(570 bp)。取PCR產(chǎn)物各5 l在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳(150 V恒壓電泳0.5 h)，應用Gel-Doc2000型全自動凝膠成像分析儀(Boi-Rad公司，美國)照相并測定每條帶的光密度值，以GAPDH的表達量為內(nèi)對照計算并比較各組樣本Fas、FasL的相對表達量。1.5胰腺組織Fas、FasL免疫組化檢測兔抗大鼠Fas、FasL多克隆抗體，工作濃度均為1200。免疫組化操作過程按試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡觀察。1.6胰腺組織凋亡檢測采用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)。操作嚴格按照說明書進行

14、。以雙蒸水代替TDT作陰性對照，DNAase 處理的切片作陽性對照。根據(jù)染色結(jié)果于每張切片中選取10個高倍視野(400)，計數(shù)1000個胰腺腺泡細胞中的陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(即每100個細胞中TUNEL陽性細胞所占的百分比)。1.7統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)以(s)表示，以SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計。采用單因素方差分析計算各組間差異，檢驗水準=0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1光鏡下胰腺組織學改變及病理評分對照組胰腺在光鏡下無異?；騼H有輕度水腫；在造模后的B組，可見大鼠胰腺間質(zhì)水腫，小葉和腺泡間隙增寬，伴多量中性粒細胞及少量淋巴細胞浸潤，胰腺實質(zhì)內(nèi)可見點片狀出血和壞死，在?；悄懰徕c濃度逐漸增大的C

15、、D兩組，上述表現(xiàn)更加明顯，伴小葉結(jié)構(gòu)破壞，細胞輪廊不清，胰腺壞死周圍小血管擴張、紅細胞淤積并微血栓形成(表1)。 2.2Fas和FasLmRNA在正常胰腺及AP胰腺組織中的表達RT-PCR結(jié)果顯示，正常胰腺組織即有Fas和FasL mRNA的轉(zhuǎn)錄表達，在AP炎癥程度較輕的B組，F(xiàn)as和FasL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，在AP模型C、D兩組，隨胰腺組織炎癥程度的加重，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達水平逐漸下降。且Fas 表達水平在各個組間的變化趨勢與FasL 的變化趨勢相一致(圖1，2)。 圖1Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP胰腺組織中的RT-PCR凝膠電

16、泳圖Fig.1Fas mRNA(A) and Fas Ligand mRNA(B) expression detected by RT-PCR in normal and acute inflammatory pancreasLanes 1-4: Fas (201bp) and FasL (320 bp); Lanes 5-8: GAPDH (570 bp); Lanes 1,5: Group A;Lanes 2, 6: Group B;Lanes 3, 7: Group C; Lanes 4, 8: Group D圖2Fas mRNA (A)和FasL mRNA (B)在正常和AP各胰腺組織

17、中的RT-PCR半定量分析Fig.2Changes of Fas mRNA (A)and Fas Ligand mRNA(B) expression analyzed by semiquantitative RT-PCR inthe pancreas of normal and acute inflammatory ratsaP0.05 vs control group,; bP0.05 compared within AP groups. A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.3胰腺組織Fas、FasL蛋白表達定位在正常胰腺組織中，F(xiàn)a

18、s和FasL呈弱陽性表達，胞質(zhì)染成棕黃色，F(xiàn)asL也有少量胞膜著色，見于幾乎所有的腺泡細胞。連續(xù)切片分析顯示Fas和FasL共同表達于腺泡細胞質(zhì)內(nèi)，在AP模型B組，F(xiàn)as和FasL表達明顯增強，以炎癥浸潤區(qū)和腺泡細胞壞死區(qū)最為顯著。隨胰腺炎癥程度的加重，F(xiàn)as、FasL的表達逐漸減弱。另外，F(xiàn)as和FasL也表達于正常的胰島細胞、血管內(nèi)皮細胞，而胰腺導管上皮細胞、胰腺炎時浸潤的中性粒細胞內(nèi)均不表達(圖3)。 圖3連續(xù)切片免疫組化檢測正常及不同炎癥程度胰腺組織Fas、FasL蛋白表達定位Fig.3Immunohistochemistry of serial sections of normal

19、and inflammatory rat pancreas showing the expressions of Fas and FasL proteins (Originalmagnification: 200)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively2.4TUNEL法檢測各組胰腺細胞凋亡情況比較細胞凋亡陽性結(jié)果表現(xiàn)為胞核染成棕褐色，胞核固縮、空泡化，染色質(zhì)濃縮、邊聚，凋亡小體形成。結(jié)果可見正常組胰腺腺泡細胞凋亡極少(圖4A)，建立AP模型后, B組胰腺炎程度較輕，凋亡細胞多見(圖4B)，C組病理改變較B組加重，凋亡細胞較多見(圖4C)，D組

20、為重度出血壞死性胰腺炎，凋亡細胞少見(圖4D)。經(jīng)統(tǒng)計學處理各組胰腺細胞凋亡指數(shù)，各AP模型組與對照組凋亡指數(shù)相比(P0.01)，各AP模型組間比較(P0.01)，差異顯著。 圖4TUNEL原位末端標記法檢測各組大鼠胰腺細胞凋亡Fig.4In situ detection of apoptosis by terminal transferase mediated nick end labeling (TUNEL) showing brown and shrunk nuclei of the apoptotic cells with vacuolization, chromatin conden

21、sation, and formation of apoptotic bodies (Original magnification:400)A, B, C, D: Groups A, B, C and D respectively3討論Fas/FasL系統(tǒng)是細胞凋亡最主要的途徑之一，F(xiàn)as單抗誘導腫瘤細胞凋亡已被大量實驗證實3。FasL和Fas結(jié)合后，首先使Fas形成能傳遞信號的活性三聚體， 并將凋亡信號向胞內(nèi)傳遞、激活一系列被稱為Caspase的半胱氨酸蛋白酶，完成細胞凋亡過程。有研究發(fā)現(xiàn)45，F(xiàn)as/FasL凋亡通道介導了急性胰腺炎腺泡細胞凋亡，F(xiàn)as基因缺失可明顯加重蛙皮素誘導的鼠急性胰

22、腺炎病情，提示Fas凋亡通路在急性胰腺炎中扮演著重要的角色。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在正常的胰腺腺泡細胞中即存在著Fas和FasLmRNA及蛋白的表達，且呈現(xiàn)共區(qū)域化特點，這同Kornmann 等6的研究結(jié)果是一致的。Fas/FasL的共區(qū)域化表達同樣存在于胸腺、食管上皮78等組織中。提示正常組織的生理性細胞更新可能受Fas/FasL系統(tǒng)自分泌或旁分泌凋亡通路的調(diào)節(jié)。越來越多的證據(jù)表明Fas與FasL的相互作用有助于組織自穩(wěn)，如陰道上皮、肝臟和睪丸8。雖然Fas與FasL的共表達可能介導胰腺細胞凋亡，但Natoli 等9研究發(fā)現(xiàn)Fas/FasL系統(tǒng)的表達并不必然引起表達細胞的凋亡，F(xiàn)as/FasL凋亡

23、通道的啟動尚需要協(xié)同刺激信號的存在。另外，凋亡是一個由多因素控制的精細過程，多種凋亡通路共同存在，保證了表達組織的自穩(wěn)和對外來刺激的適度反應。在本研究中，我們通過經(jīng)胰膽管逆行注射不同濃度的?；悄懰徕c建立炎癥程度不一的AP模型，用TUNEL法檢測各組胰腺腺泡細胞凋亡率的變化，利用RT-PCR技術(shù)進一步檢測了凋亡調(diào)控基因Fas和FasL mRNA的表達。我們發(fā)現(xiàn)，正常胰腺組織腺泡細胞凋亡率很低，建立AP模型后，在炎癥程度較輕的B組，腺泡細胞凋亡率明顯升高，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達水平亦隨之顯著升高；隨胰腺炎癥程度的加重，腺泡細胞凋亡率逐漸下降，F(xiàn)as和FasL mRNA的表達亦逐漸下降。這

24、一結(jié)果再次證實在急性胰腺炎過程中，腺泡細胞凋亡與急性胰腺炎的嚴重程度呈負相關關系，腺泡細胞凋亡是對胰腺炎本身的一種保護性反應。胰腺腺泡細胞凋亡至少部分是由Fas/FasL系統(tǒng)介導而實現(xiàn)的，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)是介導胰腺炎細胞凋亡的重要途徑之一?？傊?，我們的研究證實了Fas及FasL在正常胰腺細胞中呈共區(qū)域化表達及其與腺泡細胞凋亡的關系。這一結(jié)果表明，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)可能參與了正常胰腺組織的自穩(wěn)和細胞更新；Fas/FasL系統(tǒng)可能是急性胰腺炎病程中介導凋亡的一個重要通路，通過Fas/FasL系統(tǒng)誘導凋亡可以減輕急性胰腺炎病情。有關Fas/FasL通路調(diào)節(jié)凋亡的確切機制尚須進一步研究。參考文獻

25、：1Bhatia M. Apoptosis of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis: is it good or badJ? J Cell Mol Med, 2004,8(3): 402-409.2Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapyJ. Ann Surg, 1992, 215: 44-56.3Roskams T, Libbrecht L, van Damme B,

26、 et al. Fas and Fas ligand: strong co-expression in human hepatocytes surrounding hepato- cellular carcinoma; can cancer induce suicide in peritumoural cellsJ? J Pathol, 2000, 191(2):150-53.4Yasuda H, Kataoka K, Ichimura H, et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after panc