低葡萄糖連續(xù)培養(yǎng)的釀酒酵母過量生產(chǎn)蘇氨酸醛縮酶會抑

1、低葡萄糖連續(xù)培養(yǎng)的釀酒酵母過量生產(chǎn)蘇氨酸醛縮酶會抑制丙酮酸脫氫酶的生物合成作用釀酒酵母（S. cerevisiae）丙酮酸脫羧酶缺陷（Pdc）突變體需要少量乙醇或醋酸鹽才能維持需氧的、低葡萄糖生長。這種營養(yǎng)需求是由于i脂質(zhì)和賴氨酸的生物合成需要胞漿乙酰-CoA，ii不能將線粒體基質(zhì)中的乙酰-CoA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。為了驗(yàn)證這種假設(shè)說并消除Pdc S. cerevisiae對C2的需求，我們嘗試采用一種胞漿乙酰-CoA合成的替代途徑。將L-肉毒堿加入培養(yǎng)基中并不能恢復(fù)Pdc在葡萄糖上的生長，這表明釀酒酵母對C2的需求不僅僅是因?yàn)樗荒芎铣蛇@種化合物。釀酒酵母GLY1 基因編碼蘇氨酸醛縮酶（EC.5

2、），這種酶催化蘇氨酸裂解為甘氨酸和乙醛。GLY1基因的過表達(dá)能使Pdc菌株在碳限制連續(xù)培養(yǎng)中以葡萄糖為唯一碳源生長，這表明由蘇氨酸醛縮酶產(chǎn)生的乙醛可作為胞漿乙酰-CoA合成的前體。分餾法研究發(fā)現(xiàn)了蘇氨酸醛縮酶在胞漿中的定位。培養(yǎng)過程中甘氨酸的缺乏表明蘇氨酸醛縮酶生產(chǎn)的所有甘氨酸都被同化或異化了。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了丙酮酸脫羧酶參與了胞漿乙酰-CoA的合成。在分批培養(yǎng)中Pdc GLY1基因過表達(dá)菌株仍然對葡萄糖敏感。就像其他Pdc菌株一樣，此菌株在過量葡萄糖分批培養(yǎng)中不能生長，并且將其從葡萄糖限制培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到葡萄糖過量培養(yǎng)基時會分泌出丙酮酸。丙酮酸脫氫酶（PDC）由PDC1，PDC5和PDC6編碼

3、，用于它催化酵母酒精發(fā)酵中的第一步且是不可逆的反應(yīng)，所以它一直被認(rèn)為是一個嚴(yán)格的異化酶。與這個看法一致的是，在葡萄糖復(fù)合培養(yǎng)基分批培養(yǎng)中，釀酒酵母PDC缺失突變體比生長率急劇降低，而葡萄糖代謝野生型釀酒酵母可以很好地發(fā)酵35。在低殘留葡萄糖濃度的需氧低葡萄糖連續(xù)培養(yǎng)中，葡萄糖對呼吸酶的抑制作用降低了4，37。在這種培養(yǎng)中比生長速率較低，野生型細(xì)胞僅通過呼吸作用來異化葡萄糖4，37。盡管如此，在這種條件下，釀酒酵母Pdc菌株不能以葡萄糖為唯一碳源生長，但往培養(yǎng)基中加入少量乙醇和醋酸鹽后可以恢復(fù)其生長10，12。釀酒酵母Pdc菌株這種對C2化合物的需求反映出了PDC在胞漿乙酰-CoA的合成中起到非

4、常重要的作用,而脂質(zhì)和賴氨酸的合成需要胞漿乙酰-CoA10。PDC催化將丙氨酸轉(zhuǎn)化為胞漿乙酰-CoA的第一步反應(yīng)，這步反應(yīng)中還需要乙醛脫氫酶和乙酰-CoA合成酶17，31，32。與所設(shè)想的這個PDC的生物合成作用相一致的是，實(shí)驗(yàn)證實(shí)Pdc突變體對C2化復(fù)合物需求的最小值符合胞漿乙酰-CoA的理論需求量10。在一定程度上來說PDC在胞漿乙酰-CoA生物合成中的重要作用是令人驚訝的，因?yàn)橐呀?jīng)知道有幾種缺乏PDC的酵母菌在葡萄糖上能迅速生長。例如，Pdc菌株Kluyveromyces lactis在以葡萄糖為唯一碳源時生長迅速2，14。此外，缺乏PDC的脂質(zhì)積累酵母Yarrowia lipolyti

5、ca，可利用ATP檸檬酸裂解酶將乙酰-CoA從線粒體基質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在線粒體基質(zhì)中乙酰-CoA由丙酮酸脫氫酶復(fù)合物反應(yīng)得到8。ATP檸檬酸裂解酶并不存在于釀酒酵母中，所以排除了這種酶參與胞漿乙酰-CoA合成過程的可能33。通常認(rèn)為在包括釀酒酵母的真核細(xì)胞中 19，31，肉毒堿穿梭載體在乙酰-CoA通過線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到很大的作用。盡管釀酒酵母含有編碼肉毒堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰-肉毒堿移位酶的遺傳信息1，7，27，36，39，但近來卻發(fā)現(xiàn)釀酒酵母并不能合成L-肉毒堿39。由于并沒有研究表明L-肉毒堿是否能夠使釀酒酵母Pdc菌株在葡萄糖上生長，所以現(xiàn)在仍然不清楚肉毒堿穿梭載體能否催化乙酰-Co

6、A從線粒體基質(zhì)的輸出。釀酒酵母Pdc菌株對C2的需求營養(yǎng)要求并不僅僅具有重要的科學(xué)價值，Pdc菌株的酒精發(fā)酵作用的缺乏可能在生物質(zhì)定向應(yīng)用方面很有價值。這種菌株另一個已經(jīng)被證明了的應(yīng)用就是采用乳酸脫氫酶將糖分解所得的NADH用于具有商業(yè)價值的乳酸的合成29。在所有這些應(yīng)用中，消除對C2化合物的需求將會減輕工藝流程設(shè)計(jì)的困難。本次研究是為了檢驗(yàn)PDC對于生長在葡萄糖上的釀酒酵母中胞漿乙酰-CoA的合成是否必不可少，研究肉毒堿穿梭載體在將乙酰-CoA從線粒體基質(zhì)運(yùn)出過程中可能起到的作用，并通過代謝工程消除釀酒酵母Pdc菌株對C2的需求。下一步的研究目標(biāo)是在Pdc菌株中過量表達(dá)GLY1基因，這個基因

7、編碼能夠催化蘇氨酸降解成甘氨酸和乙醛的蘇氨酸醛縮酶21，25。表1 用于本次研究的釀酒酵母菌株菌株 基因型CEN.PK182 .MATa pdc1(-6,-2):loxP pdc5(-6,-2):loxP pdc6(-6,-2): loxPCEN.PK111-61A.MAT-a ura3-52 leu2-112 his3-1RWB882.MATa pdc1(-6,-2):loxP pdc5(-6,-2):loxP pdc6(-6,-2): loxP leu2-112 his3-1RWB893.MATapdc1(-6,-2):loxP pdc5(-6,-2):loxP pdc6(-6,-2):l

8、oxP leu2-112 his3:pYX022-Aat材料與方法菌株和保藏。本次研究所使用和構(gòu)建的釀酒酵母菌株（如表1 ）是CEN.PK家族的同類成員（ 38 ） 。原種培養(yǎng)是在30的搖瓶中，其中為100毫升含有20g/L葡萄糖的合成培養(yǎng)基 。到達(dá)穩(wěn)定期后加入20 （V/V）甘油,取2毫升存放在-80保存。質(zhì)粒的構(gòu)建。 在表達(dá)載體YEplac181上將GLY1基因克隆到TPI1啟動子之后（ 15 ） 。根據(jù)釀酒酵母M5（34 ）的染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到GLY1基因，PCR時的寡核苷酸引物為：5-GGAATTCTAGAATGACTGAGTTCGAATTGCCTCCAAAATATAC-3

9、5-CCGCTCGAGACATGATGCAACTGGAACGC-3PCR混合物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段分離，用EcoRI和XhoI酶切。酶切后的片段連接到也用EcoRI和XhoI酶切過的pYX042 - AatII質(zhì)粒上。pYX042 - AatII質(zhì)粒來自pYX042 （R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州），將pYX042用AatII酶切，插入其他4個限制酶的酶切位點(diǎn)： XhoI ，BamHI ， SmaI ，NheI，并破壞了AatII的酶切位點(diǎn)。重組質(zhì)粒pRWGLY1再用NheI和SacI酶切，將獲得的目的片段連入已用XbaI 和SacI酶切過的YEplac181載體，得到

10、重組質(zhì)粒YEpGLY1 。菌株構(gòu)建。61A的雜交（由P. Ko¨tter提供，法蘭克福，德國）。由此產(chǎn)生的二倍體孢子于56 加熱15分鐘后，在以0.2 醋酸鈉作為碳源的YP培養(yǎng)基上培養(yǎng)。再用葡萄糖檢驗(yàn)所得菌落。PCR檢測不能在葡萄糖上生長的菌落，看其PDC6基因是否被破壞。然后在合成培養(yǎng)基中選擇所需的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型就是RWB882 。為了消除組氨酸營養(yǎng)缺陷型，先轉(zhuǎn)化pYX022得到RWB882。此菌株轉(zhuǎn)入質(zhì)粒YEpGLY1和YEplac181 （ 15 ）后得到GLY1-過表達(dá)菌株RWB893 （ YEpGLY1 ）和相應(yīng)的空載體菌株RWB893 （ YEplac181 ）。聚合酶

11、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。根據(jù)說明書，PCR使用Vent DNA聚合酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）。PCR反應(yīng)進(jìn)行的情況如下：94 變性1分鐘，然后65 退火1分鐘，然后75延伸3.5分鐘，共 30個周期。培養(yǎng)基。根據(jù)Verduyn等人的研究成果，連續(xù)培養(yǎng)所用的合成培養(yǎng)基成分為：每公升軟化水含5g (NH4) 2SO4, 3g KH2PO4, 0.5g MgSO4.7H2O，0.05ml硅防沫劑，以及微量元素（ 41 ）。培養(yǎng)基在120 高溫滅菌20分鐘后，加入Verduyn等人所述的過濾除菌的維生素溶液（ 41 ）。儲存培養(yǎng)基中碳源濃度總是250mM。碳源是葡萄糖（6.75 g/L）和醋酸鹽（ 0.75g/L）的

12、混合物或單獨(dú)的葡萄糖（7.5g/L）。110高溫滅菌后葡萄糖單獨(dú)加入。未預(yù)先滅菌的純醋酸加入到高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基中。分批培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基含有1.5 的乙醇作為唯一碳源，其他成分同連續(xù)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還要補(bǔ)充L -肉毒堿，其最終濃度為0.4g/L。連續(xù)培養(yǎng)。需氧連續(xù)培養(yǎng)溫度為30，工作體積為1升，在2升發(fā)酵罐中進(jìn)行（ Applikon ，斯希丹，荷蘭）。通過自動加入2M氫氧化鉀將pH值控制在5.0。整個連續(xù)培養(yǎng)過程中為保持溶氧濃度高于60 的空氣飽和度，攪拌速度為800rpm，氣流為0.5升每分鐘。培養(yǎng)基各成分的加入由蠕動泵控制。電傳感器控制工作體積保持不變。至少在5倍體積的變化后培養(yǎng)

13、基應(yīng)仍處于穩(wěn)定狀態(tài)，每個體積變化后培養(yǎng)基的干重，葡萄糖濃度，二氧化碳產(chǎn)率和氧的消耗率變化應(yīng)小于2 。持續(xù)振蕩過程中的溶氧濃度沒有研究。培養(yǎng)物樣品和流出物的生物量無顯著性差異（ 小于1 ）。葡萄糖脈沖實(shí)驗(yàn)。葡萄糖脈沖實(shí)驗(yàn)是向穩(wěn)定狀態(tài)的葡萄糖有限的連續(xù)培養(yǎng)過程中加入葡萄糖。實(shí)驗(yàn)開始前蠕動泵關(guān)閉。為了實(shí)現(xiàn)50mM葡萄糖脈沖，將18毫升的50 (wt/vol)葡萄糖溶液通過橡膠隔墊無菌注入。在葡萄糖消耗和隨后的代謝物消耗過程中，每隔適當(dāng)時間測定培養(yǎng)物樣品在660 nm的光密度和葡萄糖及上清代謝物的濃度。培養(yǎng)物干重測定。為了確定生物量干重，將已知體積的培養(yǎng)物（干重0.01-0.03克）用預(yù)干燥的已知重量

14、的硝酸纖維素過濾器過濾 。該過濾器用20毫升軟化水沖洗并在360W微波爐中干燥20分鐘，測量過濾器的重量增加。重復(fù)至變化小于1 。代謝產(chǎn)物分析。上清中的醋酸，葡萄糖，甘油和丙酮酸的濃度用高效液相色譜法測定分析，用Bio-Rad的陰離子交換柱HPX-87H于60°C測定。該柱用5mM硫酸洗脫，流速為0.6毫升每分鐘。丙酮酸和醋酸用Waters 2487雙波長吸光度探測器在214 nm測定。葡萄糖和甘油用Waters 2410折射率探測器測定。葡萄糖的濃度用商業(yè)羅氏診斷試劑盒（編號716251）確定 。氣體分析。用Rosemount NGA 2000分析器分析氧氣和二氧化碳的濃度前，連續(xù)

15、培養(yǎng)的廢氣經(jīng)冷卻和Permapure干燥機(jī)干燥。氣體流量用離子科學(xué)數(shù)字流量計(jì)測量。具體氧氣消耗量和二氧化碳產(chǎn)量的計(jì)算使用van Urk等人的方法（ 40 ） 。酶活性測定。細(xì)胞提取物的酶活性的測定準(zhǔn)備如前所述（ 6 ）。亞細(xì)胞成分的分離使用Luttik等人的方法。（ 23 ）。細(xì)胞色素C氧化酶（EC30 用日立model 100-60分光光度計(jì)根據(jù)先前公布的方法進(jìn)行測定。用Flikweert等人所述的方法測定PDC（ 12 ）。檢測蘇氨酸醛縮酶的混合物為含0.1mM HEPES buffer (pH 7.0)，0.05mM 5-磷酸吡哆醛， 88U/mL0.15mM 還原型輔酶I的軟化水。加入

16、10 mM 蘇氨酸后反應(yīng)開始。用日立100-60分光光度計(jì)測定其在340 nm的吸光度來測定還原型輔酶I的氧化。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，用Lowry法估計(jì)細(xì)胞提取物的蛋白濃度（ 22 ）。酶%回收的酶活力微粒部分可溶部分蘇氨酸醛縮酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶細(xì)胞色素c氧化酶11989410112表2 從需氧的葡萄糖限制的連續(xù)培養(yǎng)中獲得的GLY1-過表達(dá)Pdc 菌株RWB893（YEpGLY1）的組織勻漿微粒和可溶部分的蘇氨酸醛縮酶和標(biāo)志酶的回收aa呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)來自一個單獨(dú)的有代表性的實(shí)驗(yàn)。復(fù)制實(shí)驗(yàn)得到類似的結(jié)果。結(jié)果L-肉毒堿添加到Pdc釀酒酵母連續(xù)培養(yǎng)中。最近表明釀酒酵母不能合成L-肉毒堿（39）

17、。如果肉毒堿營養(yǎng)缺陷型是Pdc 釀酒酵母需要C2化合物的原因，需氧生長、低葡萄糖的連續(xù)培養(yǎng)應(yīng)該可以改為添加L-肉毒堿。為了研究這一可能性，做對照組連續(xù)培養(yǎng)，Pdc菌株RWB893（YEplac181）以添加了0.4g/L肉毒堿的葡萄糖和醋酸鹽作為碳源。培養(yǎng)基中添加L-肉毒堿和不添加相比，不影響單位體積內(nèi)菌體的碳產(chǎn)量（14.1g/mol），也不影響葡萄糖（1.07mmol/g/h），醋酸鹽（0.4mmol/g/h），O2（2.95mmol/g/h），或CO2（3.00mmol/g/h）的流量（表3）。當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，培養(yǎng)基會被換成以葡萄糖為唯一碳源但仍包含L-肉毒堿的培養(yǎng)基。在這個培養(yǎng)基中，P

18、dc菌株從連續(xù)培養(yǎng)中洗脫。顯然，添加L-肉毒堿不能援救以葡萄糖為唯一碳源的連續(xù)培養(yǎng)中的Pdc 釀酒酵母。 Pdc 釀酒酵母中蘇氨酸醛縮酶過量生產(chǎn)。除了PDS，釀酒酵母的新陳代謝網(wǎng)至少包含一種可選擇的反應(yīng)能提供細(xì)胞溶質(zhì)的C2化合物。蘇氨酸醛縮酶（EC .5），GLY1基因編碼的合成氨基乙酸的關(guān)鍵酶，催化蘇氨酸分解為氨基乙酸和乙醛（21，25）。為研究蘇氨酸醛縮酶是否會取代PDC在其生物合成中的角色，我們嘗試在pdc1pdc5pdc6菌株中過表達(dá)C2化合物C2化合物GLY1。 為判定引入GLY1的表達(dá)菌是否會導(dǎo)致蘇氨酸醛縮酶的高活力，酶活力在細(xì)胞液中測量。攜帶GLY1表達(dá)菌的Pdc菌株的蘇氨酸醛縮

19、酶活力是0.75±0.01 U mg/蛋白，然而相應(yīng)空載體菌株的活力低于最低檢出量0.005 U mg/蛋白。 為研究過量生產(chǎn)的Gly1p的亞細(xì)胞定位，蘇氨酸醛縮酶活力從低葡萄糖的連續(xù)培養(yǎng)中獲得的細(xì)胞勻漿中的可溶部分和微粒部分決定。細(xì)胞溶質(zhì)酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在勻漿中的可溶部分全部回收。線粒體標(biāo)志酶，細(xì)胞色素c氧化酶的活力基本上專門位于特殊部分。過量生產(chǎn)菌株中蘇氨酸醛縮酶活力基本上專門發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞勻漿的可溶部分（表2），說明了Gly1p的細(xì)胞溶質(zhì)定位。 GLY1過表達(dá)消除Pdc 釀酒酵母對C2化合物的需求。在低葡萄糖連續(xù)培養(yǎng)中，Pdc 釀酒酵母的生長需要添加少量乙醇或醋酸鹽于葡萄糖

20、培養(yǎng)基中（10）。像其它Pdc突變一樣，Gly1p-過生產(chǎn)Pdc菌株不能生長于添加葡萄糖的分批培養(yǎng)中，即使存在少量乙醇或醋酸鹽（數(shù)據(jù)為給出）也不能生長。因此，為驗(yàn)證Gly1p-過生產(chǎn)菌株和空載體對照菌株生長能力，把以葡萄糖為唯一碳源，以0.10/h稀釋率生長的需氧混合培養(yǎng)基換成以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基。 正如所料，兩種菌株都能在混合了葡萄糖和醋酸鹽的連續(xù)培養(yǎng)中生長（表3）。在這種條件下，培養(yǎng)物的關(guān)鍵生理學(xué)參數(shù)，如單位體積菌體的產(chǎn)量和呼吸商（RQ），對這兩種菌株而言沒有明顯的不同（表3）。培養(yǎng)基中單位體積生物碳和二氧化碳的完全（97%）回收有一致性，沒有明顯的代謝物積聚，如乙醇、醋酸鹽或甘油，

21、發(fā)現(xiàn)浮在培養(yǎng)物表面。 在培養(yǎng)基換成以葡萄糖為唯一碳源后，空載體Pdc對照菌株從連續(xù)培養(yǎng)中洗脫（圖1）。隨著葡萄糖和丙酮酸鹽的積聚，單位體積生物濃度成指數(shù)下降和0.03/h的低剩余生長率一致。先前證明不同基因的Pdc 釀酒酵母以相似的方式從連續(xù)培養(yǎng)物中洗脫（12）。顯然，對照菌株不能在0.10/h的稀釋率下維持無醋酸鹽的低葡萄糖生長。 同樣條件下，蘇氨酸醛縮酶-過生產(chǎn)Pdc菌株能夠以葡萄糖為唯一碳源生長（表3），說明蘇氨酸醛縮酶能提供細(xì)胞足夠的合成細(xì)胞溶質(zhì)乙酰-CoA的前體。相似條件下，Gly1p-過生產(chǎn)菌株單位體積內(nèi)菌體獲得的葡萄糖產(chǎn)量（0.47±0.01g/葡萄糖）與從野生型菌株獲

22、得的產(chǎn)量（0.48-0.49g/ptt）相近。Gly1p-過生產(chǎn)菌株穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)副產(chǎn)品形成可以忽略。這說明蘇氨酸醛縮酶額外的氨基乙酸生產(chǎn)既不是低葡萄糖連續(xù)培養(yǎng)物的異化作用也不是其同化作用。工程菌也能在0.15/h稀釋率低葡萄糖下生長（表3）。然而，當(dāng)嘗試進(jìn)一步增加稀釋率為0.20/h時導(dǎo)致菌體沖失。 揭示葡萄糖限制培養(yǎng)變?yōu)槠咸烟沁^度培養(yǎng)副產(chǎn)物的形成。為研究蘇氨酸醛縮酶-過表達(dá)Pdc菌株對額外葡萄糖的短期應(yīng)答，對穩(wěn)態(tài)、需氧、低葡萄糖的連續(xù)培養(yǎng)給予葡萄糖脈沖。當(dāng)給予一個50mM的葡萄糖脈沖后，原養(yǎng)型對照菌株CEN.PK113-7D需要2h來完全消耗添加的葡萄糖。葡萄糖的消耗伴隨著50mM乙醇和10mM

23、醋酸鹽的生成（圖2）。在相同條件下，蘇氨酸醛縮酶GLY1-過生產(chǎn)Pdc菌株需要4h來完全消耗葡萄糖脈沖。沒有乙醇或醋酸鹽的生成，但對照于野生型菌株，相似于不同基因的Pdc菌株（13），工程菌生產(chǎn)大量的丙酮酸鹽（等于30mM；圖2）。表3.蘇氨酸醛縮酶-過生產(chǎn)Pdc 釀酒酵母菌株RWB893（YEpGLY1）和空載體對照Pdc菌株RWB893（YEplac181）在需氧連續(xù)培養(yǎng)中的生理學(xué)數(shù)據(jù)aa平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤差來自復(fù)制實(shí)驗(yàn)包含葡萄糖和醋酸鹽的混合物（0.25M培養(yǎng)基碳和10%以碳為主要元素的醋酸鹽）或只有葡萄糖（0.25M培養(yǎng)基碳）的合成培養(yǎng)基的獨(dú)立穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)。碳回收的計(jì)算基于48%的單位體積內(nèi)生

24、物碳容量（wt/wt）。GLY1代表RWB893（YEpGLY1）。圖1.葡萄糖、代謝物濃度和pdc1pdc5pdc6對照菌株RWB893（YEplac181）從生長于包含葡萄糖和醋酸鹽的混合物（0.25M培養(yǎng)基碳和10%以碳為主要元素的醋酸鹽）的合成培養(yǎng)基變?yōu)樯L于葡萄糖（0.25M培養(yǎng)基碳）為唯一碳源的合成培養(yǎng)基的需氧連續(xù)培養(yǎng)（稀釋率=0.10/h）的單位體積生物量。曲線顯示了單一有代表性的培養(yǎng)物的沖失側(cè)面圖。復(fù)制實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果。討論P(yáng)dc- 基因缺失的釀酒酵母對C2復(fù)合物的需求可以用來反映PDC蛋白質(zhì)在合成胞質(zhì)乙酰輔酶A時的重要作用.可獲取的證據(jù)表明釀酒酵母不能進(jìn)行左旋肉堿的原發(fā)性合成

25、。在缺少輔因子的合成媒介生長的過程中，這個結(jié)果可能預(yù)示了左旋肉堿穿梭過程的產(chǎn)生。穿梭過程是指將線粒體的乙酰輔酶A運(yùn)出到細(xì)胞質(zhì)中。我們的結(jié)果表明pdc缺陷型釀酒酵母對C2復(fù)合體的需求不是僅僅由左旋肉堿營養(yǎng)缺陷體造成的。這個不一定能推斷出線粒體肉堿在釀酒酵母中的穿梭是單向的，就如之前以pdc缺陷型菌株的表型和這種酵母可以進(jìn)行左旋肉堿的生物合成的猜想為依據(jù)被提出的情況一樣。然而，添加左旋肉堿的影響的缺失可能反映了左旋肉堿被吸收并通過酵母質(zhì)膜的能力有限，正如最近已在擁有不同遺傳背景的釀酒酵母中證明的一樣。只要對釀酒酵母對左旋肉堿吸收的生化反應(yīng)和控制機(jī)理以及其新成代謝有了更好的理解，pdc缺陷菌株將會對在