花椒體內(nèi)外抗腫瘤作用及其機制的初步研究

1、花椒體內(nèi)外抗腫瘤作用及其機制的初步研究         作者：袁太寧, 王艷林, 汪鋆植 【摘要】 目的研究花椒揮發(fā)油體內(nèi)外抗小鼠H22肝癌細(xì)胞作用及其免疫學(xué)機制。方法花椒揮發(fā)油按不同時間（24，48，72 h）及不同濃度（0. 58 mg/ml）分別處理H22細(xì)胞，MTS法分析細(xì)胞的增殖速度，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。建立H               &

2、#160;             作者：袁太寧, 王艷林, 汪鋆植【摘要】  目的研究花椒揮發(fā)油體內(nèi)外抗小鼠H22肝癌細(xì)胞作用及其免疫學(xué)機制。方法花椒揮發(fā)油按不同時間（24，48，72 h）及不同濃度（0. 58 mg/ml）分別處理H22細(xì)胞，MTS法分析細(xì)胞的增殖速度，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。建立H22荷瘤小鼠模型，觀察小鼠腫瘤的生長情況,計算腫瘤生長抑制率；ELISA法檢測花椒揮發(fā)油處理后小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。結(jié)果4 mg/ml花

3、椒揮發(fā)油處理H22細(xì)胞72 h可顯著地抑制H22細(xì)胞增殖，1 mg/ml花椒揮發(fā)油處理H22細(xì)胞72 h即可導(dǎo)致亞凋亡峰的出現(xiàn)，且G0/G1期細(xì)胞增多, S期和G2/M期細(xì)胞減少，花椒揮發(fā)油對小鼠實體瘤生長具有顯著抑制作用，但不能提高荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的水平。結(jié)論花椒揮發(fā)油可抑制H22細(xì)胞增殖并激發(fā)細(xì)胞凋亡，但不能通過提高機體的免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。 【關(guān)鍵詞】  花椒； H22細(xì)胞； 凋亡； 免疫功能Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumer effect and its immunological  mechan

4、ism of the essential oil of zanthoxylum in vivo and in vitro. Methods Treating H22 cells at different time and with different concentration of the essential oil of zanthoxylum, MTS was used to assay the cell proliferation, flow cytometry was used to assay the cell apoptosis and cell cycles. The H22

5、BALB/C xenograft tumor modes were established. The anti-tumor effect of zanthoxylum was observed and tumor growth inhibitory rate (IR) was calculated. The content of serum IL-2 and IL-12 were examined by ELISA assay. ResultsTreating H22 cells 72h by 4mg/ml essential oil of zanthoxylum resulted in re

6、markable inhibition of the cell proliferation.Treating H22 cells 72h by 1mg/ml essential oil of zanthoxylum resulted in appearance of sub-G1 and increase G0/G1 phase cells and decrease S phase and G2/M phase cells. The essential oil of zanthoxylum inhibited the growth of tumor in tumor-bearing mice.

7、 However, essential oil of zanthoxylum could not increase the contents of murine serum IL-2 and IL-12.  ConclusionThe essential oil of zanthoxylum inhibits proliferation and induces cell apoptosis of H22 cells, but it can not exert the anti-tumor efficiency through reinforcing the immune functi

8、on.  Key words： Zanthoxylum ;   H22 cells;   Apoptosis;   Immune function      花椒屬一種溫?zé)犷愔胁菟?，?熱,有小毒，歸脾、腎兩經(jīng),功能溫中止痛,解毒殺蟲，常用于治療脾胃虛寒癥?；ń愤€是深受民眾喜愛的重要食用性香料，其資源在我國分布很廣,安全性高。國內(nèi)外研究報道花椒對消炎、鎮(zhèn)痛、殺菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗真菌、抗氧化等均具有較強的作用15。隨著對花椒提純和藥理作用的深入研究,發(fā)現(xiàn)花椒還具有抗腫瘤作

9、用,但目前對花椒抗腫瘤的研究還不夠深入,其體內(nèi)的抗腫瘤作用研究則更少。為了認(rèn)識花椒在體內(nèi)外抗腫瘤作用的機制和特點,我們選用小鼠H22肝癌細(xì)胞為研究對象,觀察了花椒在體內(nèi)外對該細(xì)胞的作用，以期探討花椒在體內(nèi)外抗腫瘤作用及其可能的機制。1  材料      成熟花椒,采于湖北宜都，經(jīng)汪鋆植博士鑒定為Zanthoxylum bungeanum。H22腹水型小鼠肝癌細(xì)胞由本院保存，清潔級BALB/C小鼠由同濟醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。MTS細(xì)胞增殖分析試劑由Promega公司提供。EPL CSXL流式細(xì)胞分析儀為Becman Coulter公司產(chǎn)

10、品,全波長酶標(biāo)儀為為Thermo公司產(chǎn)品，R206D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器為上海申生科技有限公司產(chǎn)品。2  方法2.1  花椒揮發(fā)油制備使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器提取花椒果皮揮發(fā)油并過濾除菌，稱取適量揮發(fā)油加入5%Tween-80溶解的水溶液中，超聲破碎儀處理10 min，用RMPI1640無血清培養(yǎng)基或生理鹽水稀釋成所需要的濃度。2.2  細(xì)胞增殖分析將對數(shù)生長期的H22細(xì)胞以4×107/L細(xì)胞數(shù)接種于圓底96孔培養(yǎng)板,每孔50 l。37 培養(yǎng)24 h后,向孔內(nèi)直接加入含不同濃度（8，4，2，1，0.5mg/ml）花椒揮發(fā)油的RPMI1640培養(yǎng)基50 l。在加入藥物后選定的

11、時間點(24，48，72 h),向每孔中加入20 l MTS試劑,37 繼續(xù)保溫2 h顯色,于490 nm波長下讀取OD值。    細(xì)胞生存率（）=OD藥物/OD對照×100；    細(xì)胞生長抑制率（）=(1-細(xì)胞生存率)×100%2.3   流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期取1×106對照細(xì)胞或經(jīng)不同濃度（8，4，2，1，0.5 mg/ml）花椒揮發(fā)油處理的細(xì)胞,用冰冷PBS洗滌1次后,再懸浮于500 l低滲DNA染色液中(1 g/L Sodium Citrate, 0.1%Trit

12、onX 100, 100 mg/L RNase, 50 mg/L Propidium Iodode), 4 保溫30 min后,經(jīng)流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞及細(xì)胞周期時相分布，計算細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）。    PI=（S+G2/M）÷(G1+S+G2/M)×100%2.4  花椒揮發(fā)油對H22荷瘤小鼠移植瘤生長的影響取對數(shù)生長期H22細(xì)胞, 以RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml,于BALB/c小鼠左側(cè)下腹部行無菌皮下接種0.2 ml細(xì)胞懸液。接種24 h后將BALB/c小鼠隨機分為5組,給藥劑量分別為10，25，50 mg/kg體重和100 mg/kg體重，陰性對照組給予等量無菌生理鹽水(NS)，每組小鼠10只，隔日腹腔注射給藥0.2 ml/只，連續(xù)給藥7次。停藥后次日處死小鼠，剝出瘤體稱重并測量體積，計算腫瘤生長抑制率（IR）。    腫瘤生長抑制率（IR，）=（對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%2.5  花椒揮發(fā)油對荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12水平的影響各組小鼠停藥后次日采用眼球摘除法取血，靜置后離心分離血清，ELISA法檢測花椒揮發(fā)油處理后荷